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Tcnica do PCR
Universidade de Braslia
Alunas: Amanda Soares 09/0002776
Carolina Fumico - 09/0004434
Ina Aquino 09/0018516
Luana Lima 09/0028210
Paula Margotto 09/0011872
Disciplina: Gentica Bsica
Professora: Zulmira Guerrero Marques Lacava
Introduo
A Biologia uma cincia composta por inmeras reas, uma delas a
gentica forense. Do ingls, forensic science um termo utilizado,
predominantemente, no uso da cincia e da tecnologia para a reconstituio
e obteno de provas de crimes. Esse ramo foi consolidado com o trabalho
desenvolvido por Jeffreys, em 1985, que possibilitou a individualizao do
DNA.
O presente trabalho tem como finalidade de abordar tcnicas de
anlise de DNA e suas aplicaes. Dentre as tcnicas destacam-se: reao
em cadeia da polimerase (PCR), polimorfismo de comprimento de
fragmento de restrio (RFLP), VNTR e STR e por fim a eletroforese em
gel. A grande aplicao desse importante ramo da gentica a identificao
de indivduos a servio da justia como no teste de paternidade e
identificao de suspeitos.
Gentica Forense
Histrico
Os testes de DNA so para a justia o que o telescpio para as
estrelas: no uma lio de bioqumica, no uma exibio das maravilhas da
lente de aumento, mas uma maneira de ver as coisas como realmente so.
Esta frase encontra-se no livro Actual Innocence de Scheck e Nefeuld e
demostra como a Gentica Forense que tem como base tcnicas de anlise
da estrutura do DNA pode ser til e esclarecedora. Para este ramo da
Gentica chegar onde est hoje com todas as suas tcnicas um longo
caminho para desenvolv-las foi percorrido.
At a dcada de 1980 quando desejava-se amplificar um trecho da
molcula de DNA os cientistas lanavam mo de uma tecnologia
desenvolvida por Cohen e Boyer que nada mais era do que um recurso de
clonagem molecular. Neste mtodo primeiro isolava-se o trecho de DNA
em foco a ser amplificado utilizando enzimas de restrio. Estas enzimas
tambm chamadas de endonuclease de restrio tm origem de procariotos
e atuam como "tesouras moleculares", reconhecendo seqncias de pares
de bases especficas em molculas de DNA e cortando-as nesses pontos.
Depois de isolar o trecho desejado este inserido no plasmdeo de
alguma bactria que teve de ser cortado e aberto em algum ponto para que
a insero pudesse ser realizada. Este plasmdeo modificado ou DNA
recombinante colocado dentro de uma clula bacteriana e esta ao se
duplicar replicar o prprio material gentico e conseqentemente o
segmento de DNA inserido. Assim, esperava-se que essas bactrias se
multiplicassem suficiente para obter uma quantidade razovel do trecho
desejado. Purificava-se tal segmento separando-o da massa total de DNA
da populao de bactrias formada.
Este procedimento era muito trabalhoso e demorado, pois alm do
inconveniente de ter de lidar com bactrias levavam-se dias para conseguir
bastante DNA amplificado. Quando o PCR (Reao da Polimerase em
Cadeia) foi inventado causou uma revoluo no mundo cientfico e um
grande avano, porque em poucas horas alcanava-se o mesmo fim
(amplificao seletiva de um trecho de DNA). Tal inveno valeu o prmio
Nobel, em 1993, a Kary Mullis.
Nesta poca a tecnologia forense passou a ser aplicada cada vez mais
freqentemente e erros se tornaram comuns em identificao genmica.
Com isto, rgos de segurana pblica contestaram o mtodo empregado
nas identificaes. Na poca o mais utilizado era a anlise por meio dos
Polimorfismos de Comprimento dos Fragmentos de Restrio (RFLP).
uma tcnica na qual organismos podem ser diferenciados por padres de
DNAs clivados. Se dois organismos diferirem na distncia entre os stios de
clivagem de uma endonuclease de restrio, o comprimento dos fragmentos
produzidos vai diferir quando o DNA for digerido com uma enzima de
restrio. Acontece que a avaliao das faixas de DNA eram muito
subjetivas e difceis de interpretar. Assim, um novo tipo de marcador
passou a ser utilizado: o STR (repeties curtas enfileiradas)e o mais
empregado atualmente. Neste o tamanho medido do trecho mais preciso.
Alguns casos de identificao humana ficaram famosos na histria
pela repercusso pblica que tiveram. Citar-se- dois deles. O primeiro se
deu na Rssia com a tentativa de provar que resqucios esqueletais achados
eram de indivduos da famlia Romanov. Os ossos foram enviados ao
Servio de Cincia Forense que foi o primeiro laboratrio do Reino Unido
especializado em identificao genmica. L o cientista Gill desenvolveu
um mtodo de identificao com DNA mitocondrial (DNAm ) que mais
abundante que o cromossmico do ncleo celular. Conseguiu-se provar por
Eletroforese
A tcnica de separao dos fragmentos de DNA mais utilizada a
eletroforese atravs de gel.A Eletroforese que forma padro de bandas
caractersticas para cada indivduo ,isso permite a identificao de pessoas
como em cenas de crimes e em testes de paternidade, como tambm
Aplicaes:
1- Identificao de suspeitos
As investigaes policiais fazem o uso de comparaes entre
impresses digitais genticas (DNA fingerprint) no reconhecimento de um
criminoso. Como explicado anteriormente, cada indivduo possui um
nmero de repeties especficas de minissatlite, da mesma forma que
cada um possui uma impresso digital distinta, por isso faz-se a analogia
com o termo fingerprint. Aps a coleta do material envolvido no crime e
posterior movimentao desse ao longo do gel de agarose, compara-se os
padres de banda formados, como por exemplo na figura abaixo:
3- Teste de maternidade
Assim como no teste de paternidade sem o DNA da me, o teste de
maternidade feito com os mesmos princpios, porm a probabilidade
matemtica muda, j que na grande maioria dos casos tambm no se tem o
DNA do pai.
Concluso
A Gentica forense se apoia nas tcnicas desenvolvidas na gentica e
biologia molecular para auxiliar a justia. Essas tecnologias foram sendo
aprimoradas e hoje com uma quantidade bem menor de material gentico
que extrado de uma amostra biolgica pode ser feita uma anlise bem
precisa. Outro fator importante que contribui para a preciso da anlise a
conservao da amostra, que envolve desde o processo de coleta dessa
amostra at sua locomoo ao laboratrio. Existem uma quantidade relativa
de tcnicas que podem ser aplicadas e o que vai direcionar qual a melhor
tecnologia a ser adotada a natureza da amostra.
O PCR uma tcnica da biologia molecular amplamente utilizada
devido a sua eficcia na replicao em vitro do DNA, permitindo que de
pequenas amostras se obtenha quantidade suficiente de DNA para analise.
Essa tcnica consiste em trs etapas que ocorrem dentro de um
termociclador (controla a temperatura durante o processo). Desnaturao,
Hibridizao e Extenso. Dobra-se a quantidade de DNA a cada ciclo.
Para a anlise a tcnica mais usada a eletroforese, que utiliza
diferena de potencial para separar o DNA de acordo com o tamanho e a
densidade, formando fitas caractersticas.
Uma das tcnicas mais usuais da gentica forense a do STR
(microssatlite), que so curtas e repetitivas sequncias de DNA,
localizadas cromossomo, onde exercem funes estruturais. H cerca de 25
anos descobriu-se que o nmero de repeties de um microssatlite ou
minissatlite varia de indivduo para indivduo. Isso permitiu certas
aplicaes na justia como a identificao de indivduos e
conseqentemente de suspeitos. Desse modo, percebe-se a importncia do
desenvolvimento de estudos que aprimorem essa tcnica.
Uma das aplicaes mais usadas da gentica forense o teste de
paternidade comparando-se impresses digitais utilizadas para
identificao de indivduos, e assim, confirmando-se ou no a paternidade
do suposto pai. Esse teste auxilia muito decises judiciais em tribunais de
todo o mundo. O teste de maternidade, no to comum, possui o mesmo
princpio do teste de paternidade, exceto na probabilidade matemtica.
Bibliografia
Bio Volume nico, Snia Lopes, Editora Saraiva
http://www.scribd.com/doc/23337106/Aula-8-DNA-mitocondrial
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q=cache:rf3rFN94aVoJ:www.drashirleydecampos.com.br/noticias/1259
+dna+satelite&cd=4&hl=pt-BR&ct=clnk&gl=br
http://forum.med.up.pt/viewtopic.php?
t=92&sid=8385447c7243fca6a4929b411d721b84