Extraccin de bromelina a partir de residuos de pia

Linda I. S. Gallardo Castillo

1
, Alfredo Snchez Solano
1,2
, Claudia Montalvo Paquini
1
yAlejandro I. A. Alonso Caldern
1,21
Universidad Politcnica de Puebla, Programa Acadmico en Ingeniera en
Biotecnologa,Tercer carril del ejido serrano S/N, San Mateo Cuanal, Juan
C.Bonilla, C.P. 72640 Puebla,Mxico. augusto96mx@hotmail.com Alejandro
Isaas Augusto Alonso Caldern es Qumico Farmacobilogo, con especialidad
enIngeniera Ambiental y maestra en Ciencias Ambientales, actualmente es
candidato a Doctor enCiencias Ambientales en el rea de Tecnologa Ambiental
por la Benemrita UniversidadAutnoma de Puebla, sus trabajos de
investigacin enfocados principalmente a la purificacin deprotenas de
productos biticos y su aplicacin ambiental han tenido premios en
diferenteseventos cientficos por ejemplo en las Convenciones Nacionales de
Investigacin Aplicada yDesarrollo Tecnolgico 2005, 2006, 2008, en el
Movimiento Internacional para el RecreoCientfico y Tcnico MILSET 2007 y
2008, adems de la presentacin en Congresos Nacionalese Internacionales y
publicacin en diversas revistas.
RESUMEN
La pia es una fruta tropical de la familia de las bromeliaceae la cual tiene
actividad proteolticadebida a la bromelina, recientemente se demostr la
posible actividad antitumoral de cisteno-proteasas como esta enzima
contenida en la pia, En este trabajo de investigacin se reporta
laconcentracin de protenas, actividad enzimtica y proteoltica de la
bromelina extrada porprecipitacin alcohlica a -10 C de diferentes partes de
esta fruto, nuestros resultados muestranque a los 7 das se tuvo una
concentracin de protenas en cscara de 857.35 mg/mL mayor a
lasencontradas en pulpa y corazn (625.09 mg/mL y 591.04 mg/mL
respectivamente). La actividadespecfica en corazn fue de 19.88
nmol/min/mg, similar al de pulpa (18.73 nmol/min/mg) ymayor al presente en
cscara (9.05 nmol/min/mg), sin embargo esta ltima al ser un residuo

agroindustrial puede ser potencialmente utilizado en la extraccin y

purificacin de esta enzimaa un menor costo.
Palabras clave:
pia, bromelina, actividad
Bromelain extraction of pineapple wasteABSTRACT
The pineapple is a tropical fruit belongs to bromeliaceae family. It has
proteolytic activity of bromelain and recently was tested its antitumoral activity
of cistein-proteases. In the presentwork the determination of protein
concentration and enzymatic activity of bromelain were testedin each one of
the parts of pineapple: crown, shell, heart and pulp. The bromelain was
obtainedby precipitation with ethanolic extraction at -10 C. The results shown
that the best proteinconcentration was obtained in shell at 7 days (857.35
mg/mL) being higher than pulp and heartwith values of 625.09 mg/mL and
591.04 mg/mL respectively. The specific activity was 19.88nmol/min/mg in
heart, it was very similar to pulp ( 18.73 nmol/min/mg) and both were
biggerthan the activity in shell (9.05 nmol/min/mg). However the crown, the
shell and the heart areconsidered like agroindustrial waste and these could be
used in extraction and purification to getbromelain with low cost.
Keywords:
pineapple, bromelain, activity
INTRODUCCIN
Las proteasas son enzimas que catalizan la hidrlisis de enlaces peptdicos en
las protenas, seagrupan segn los residuos de aminocidos, del centro activo y
los mecanismos de accin,dentro de las cisteno peptidasas (EC 3.4.22) se
encuentra a la papaina y bromelina (
1
).
La pia es una fruta tropical de la familia de las bromeliaceae, es rica en
vitaminas A, B, C ytiene actividad proteoltica debida a la bromelina que se
activa por la cistena, tiosulfato yglutatin. Es inhibida o inactivada por iones
metlicos oxidantes y por agentes que reaccionancon los tioles (cido
ascrbico). La bromelina de los frutos es una proteasa cida, su
intensaactividad proteoltica no se modifica en zonas de pH entre 3 y 8. Es una
protena constituida poraminocidos que se encuentran enrollados en dos

partes separadas por un puente que tiene unlugar activo con un grupo tiol (SH)
libre.Esta biomolcula se utiliza como ablandadora de carnes (
1
), complemento alimenticio y se hadescrito que muestran varias acciones
farmacolgicas por ejemplo aumentan la absorcin demedicamentos (
2
) se han utilizado en tratamientos de desrdenes digestivos, en
enfermedadesvirales y en la formulacin de vacunas. Tienen potencialidades
como antiedematosas,antiinflamatorias, antitrombticas y fibrinolticas.
Recientemente, se demostr la posibleactividad antitumoral de cistenoproteasas como la bromelina contenida en la pia en 5 tumorestransplantables
de ratn: Leucemia p-388, carcinoma pulmonar de Lewis, adenocarcinoma755,sarcoma-37 y tumor ascitico de Ehrlinch (
3
)
,
as como la inhibicin en la proliferacin detumores cerebrales (
4
).El objetivo del presente trabajo fue evaluar la obtencin de bromelina a partir
de cscara,corazn y pulpa de la pia as como determinar la actividad
enzimtica y especfica.
MATERIALES Y MTODOS
Se parti de una pia previamente lavada y fraccionada en pulpa cscara y
corazn. Estasfracciones fueron molidas por separado en un extractor de jugos,
el volumen resultante semultiplic por 1,5 y esa fue la cantidad aadida de
etanol. Las mezclas extracto-etanol
distribuidas en tubos falcn de 50 mL y colocados a -10 C durante 7 das, a
continuacin lasmuestras fueron centrifugadas a 8 500 rev/min durante 10
min. El sobrenadante fue eliminado ylas pastillas de cada muestra fueron
recolectadas en un volumen final de 1 mL de solucintampn Tris-HCl 50 mM
pH 8.Para la cuantificacin de protenas se utilizo el mtodo de Lowry cuya
sensibilidad es de 1 a 2g, el cual se realiz de la siguiente manera: a 300 L
de muestra o estndar se le adicionaron300 L de solucin de hidrxido de
sodio 2N y se coloc a 100 C durante 10 min. Despus sedej enfriar la
mezcla a temperatura ambiente y se le agregaron 3000 L del reactivo

paraformar el complejo. Se dej la reaccin 10 min a temperatura ambiente,

enseguida se agregaron300 L de reactivo de Folin 1N mezclando por inversin
y se dej a temperatura ambiente por40 min., se determinaron los valores de
absorbancia a 750 nm utilizando un espectrofotmetroUV-visible Agilent 8453,
se prepararon estndares con albmina bovina a distantesconcentraciones
para elaborar una curva de calibracin.La actividad proteoltica fue
determinada de acuerdo al procedimiento de Arnon con ligerasmodificaciones (
5
). Este procedimiento consisti en una mezcla de reaccin que contena: 200L
de cistena 50 mM-20 mM EDTA pH 8, 700 L de solucim tampn Tris-HCl 50
mM pH 8,20 mg de concentrado de protenas precipitadas. Esta mezcla fu
colocada a 37 C por 5 min.Posteriormente se agreg 1000 L de casena 1 %
(m/v) como sustrato y la reaccin fue puestanuevamente a 37 C durante 10
min. Para detener la reaccin se adicionaron 3000 L de cidotricloroactico
(TCA) 5 % (m/v) y se dej a 37 C durante 30 min. Finalmente las muestras
dereaccin fueron centrifugadas a 8 000 rev/min durante 10 min y el
sobrenadante fue medido a275 nm. La lectura fue corregida por un blanco en
el cual el concentrado fue adicionada despusde agregar el TCA, la actividad
fue determinada por medicin de la velocidad de liberacin detirosina a partir
de casena como sustrato; expresada en unidades enzimticas, una unidad (U)
es
la cantidad de enzima que cataliza la formacin de 1 nmol de tirosina por
minuto a 37 C. Laactividad especifica se calcul como el cociente de la
actividad enzimtica entre la concentracinde protenas.
RESULTADOS Y DISCUSIN
El fraccionamiento del fruto permiti obtener muestras representativas, las
cuales fueron cscara,pulpa y corazn.. En la figura 1 se aprecia que el mayor
valor de protena se registr para lacscara (857,35 mg/mL) con diferencia
significativa respecto a las dems muestras; pulpa(625,09 mg/mL) y corazn
(591,04 mg/mL).
01002003004005006007008009001000Cscara Pulpa Corazn
Concentracindeprotenas(mg/mL)
Figura 1. Concentracin de protenas (mg/mL)
La Fig. 2A muestra la actividad enzimtica (nmol/min) de los extractos
obtenidos a partir de lasdiferentes secciones de la pia., en la cual observamos
que para corazn fue de 397,6642

nmol/min, muy similar a pulpa (374,7928 nmol/min) y por arriba de cscara

cuyo valor fue de181,1357 nmol/min. De manera similar la actividad especfica
(nmol/min/mg) fue mayor encorazn y pulpa teniendo valores de 19,8832
nmol/min/mg y 18,7396 nmol/min/mgrespectivamente seguida por la cscara
en la cual se obtuvo un valor de 9,0567 nmol/min/mg(Fig. 2B).
050100150200250300350400450Cscara Pulpa Corazn
Actividadenzimatica(nmol/min)
Fig. 2A. Actividad enzimtica de los diferentes extractos de la pia.

0510152025Cscara Pulpa Corazn

Actividadespecfica(nmol/min/mg)

Fig. 2 B Actividad especfica de los diferentes extractos de la piaLos resultados

muestran que en pulpa y corazn se encuentra una mayor cantidad de
enzimasproteolticas a diferencia de las presentes en cscara, sin embargo,
esta ltima al ser un residuoagroindustrial puede ser potencialmente utilizado
a un menor costo en la extraccin ypurificacin, mediante tcnicas bioqumicas
como dilisis y cromatografa de intercambiocatinico y poder aplicarla en
diversos procesos.
CONCLUSIONES.
1.- Se logr establecer que las mejores condiciones para la extraccin de la
bromelina fueroncon el solvente etanol, temperatura de -10 C y durante un
tiempo de 7 das.2.- La mayor cantidad de protenas se encuentran en la
cscara, sin embargo esta tiene la menoractividad enzimtica y especfica.3.La bromelina extraida de cscara de pia tiene un menor costo con respecto a
la de las demspartes del fruto ya que es un residuo agroindustrial.4.- Los
resultados obtenidos son prometedores para que con un mayor grado de
purificacin seafactible aplicar esta enzima en tratamientos biomdicos.

REFERENCIAS1. Kleef, R., Delohery, T. y Boubjerg, D. Pathobiol. 64:339-46,

1996.2. Leipner, J. y Saller, R. Drugs. 59:769-80, 2000.3. Hernndez, M.,
Chvez, M., Bez, R., Carvajal, C., Mrquez, M., Morris, H., Santos, R.,Gonzlez,
J., Quesada V., Rodrguez C. Biotec Aplicada 20:180-182, 2003 .4. Berit, B,
Tysnes., H, Rainer, Maurer., Torsten, Porwol., Beatrice, Probst., Rolf,
Bjerkuing.and Frank, Hoover. Neoplasia 3(6): 469-479, 2002.5. Nitsawang, S.,
Hatti-Kaul, R. y Kanasawud, P. Enzyme and Microbial Technology 39: 1103-1107,
2006.

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Los resultados muestran que en pulpa y corazn se encuentra una mayor
cantidad de enzimasproteolticas a diferencia de las presentes en cscara, sin
embargo, esta ltima al ser un residuoagroindustrial puede ser potencialmente
utilizado a un menor costo en la extraccin ypurificacin, mediante tcnicas
bioqumicas como dilisis y cromatografa de intercambiocatinico y poder
aplicarla en diversos procesos.
CONCLUSIONES.
1.- Se logr establecer que las mejores condiciones para la extraccin de la
bromelina fueroncon el solvente etanol, temperatura de -10 C y durante un
tiempo de 7 das.2.- La mayor cantidad de protenas se encuentran en la
cscara, sin embargo esta tiene la menoractividad enzimtica y especfica.3.La bromelina extraida de cscara de pia tiene un menor costo con respecto a
la de las demspartes del fruto ya que es un residuo agroindustrial.4.- Los
resultados obtenidos son prometedores para que con un mayor grado de
purificacin seafactible aplicar esta enzima en tratamientos biomdicos.

REFERENCIAS1. Kleef, R., Delohery, T. y Boubjerg, D. Pathobiol. 64:339-46,

1996.2. Leipner, J. y Saller, R. Drugs. 59:769-80, 2000.3. Hernndez, M.,
Chvez, M., Bez, R., Carvajal, C., Mrquez, M., Morris, H., Santos, R.,Gonzlez,
J., Quesada V., Rodrguez C. Biotec Aplicada 20:180-182, 2003 .4. Berit, B,
Tysnes., H, Rainer, Maurer., Torsten, Porwol., Beatrice, Probst., Rolf,
Bjerkuing.and Frank, Hoover. Neoplasia 3(6): 469-479, 2002.5. Nitsawang, S.,
Hatti-Kaul, R. y Kanasawud, P. Enzyme and Microbial Technology 39: 1103-1107,
2006.