Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
ESPERIMENTI
-Max Delbruck e Salvator Luria: esperimenti con il fago
-Mendel: basi dellereditariet
-Mischer: isola il DNA (nucleina)
-Griffith: esperimenti sullo STREPTOCCOCCUS PNEUMONIAE che ha due colonie:
1. R(ough) non virulento 2. S(mooth) virulento . Si uccidevano (col calore che
denaturava le proteine) delle cellule S, e pezzi di DNA potevano ricombinarsi
con cellule R e uccidevano la cavia. Inoltre le cellule S vive erano trovati nei
campioni di sangue della cavia.
-Avery, Mc Leod e McCarty: una cellula uccisa con il calore, frammenti di DNA
si ricombinano con unaltra cellula: si scopre pertanto che il principio
trasformante il DNA.
- Hershey e Chase: usano isotopi radioattivi, 32p per il DNA e 35s per le
proteine. Dimostrano che il responsabile dellinfezione di E.Coli il DNA.
-Mischer: sottopone le cellule a soluzione alcalina e poi acido per separare
citoplasma e nucleo: ottiene la nucleina e stabilisce che gli acidi nucleici hanno:
un gruppo PO4 3-, uno zucchero a 5atomi di C e una base azotata
(costituiscono un nucleotide; conosciamo due tipi di nucleotidi: Purinici con 2
anelli, adenina e guanina pirimidinici 1 anello, citosina e timina).
Pi nucleotidi (per eliminazione di un H2O tra lOH e il carbossile del Carbonio
4) si legano in modo casuale tramite un legame fosfodiestereo e si susseguono
in direzione 5 3.
-Chargaff: primi anni 50 (esperimenti sul DNA idrolizzandolo con acidi forti) e
giunse alla conclusione che le concentrazioni erano tali che A=T e C=G quindi
A si appaia con T con 3 legami a H e C con G con 2 legami ad H. Questo
appaiamento fa si che la distanza tra le basi sia costante (10,8 A)
STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI
-Legame a H: *interazione dipolo dipolo tra: 1 un atomo di H legato a un atomo
elettronegativo (O o N) e dunque delta+ e 2 un atomo elettronegativo delta
meno. *Energia= -3/-7 kcal/mol. * un legame direzionale
-Forze di Van Der Waals: *interazione dipolo istantaneo-dipolo indotto;
*Energia=-1 kcal/mol.
Un tipo di forza di Van der Waals sono le forze idrofobiche i cui gruppi apolari in
soluzione acquosa tendono ad avvicinarsi escludendo lacqua.
-Conformazioni: pirimidine: *amminica (presente in natura) *imminica
Purine: *chetonica (presente in natura) e *enolica
(Differiscono per gli H donatori e accettori di legame).
-2 Filamenti con direzione antiparallela: il primo in direzione 5 3, il secondo 3
5.
-Struttura elicolidale destrogira (scoperta da Rosalind Franklin tramite
diffrazione a raggi X. Watson e Crick realizzarono il modello tridimensionale).
La struttura elicoidale comprende: * un giro dellelica=3,4nm=10,5 coppie di
basi; * solchi (maggiore 2,2 nm-minore 1,2 nm), il solco maggiore fonisce
informazione per legare le proteine basate su un codice ADMH di:
Accettore di legame a H
Donatore di legame a H
M gruppo metilico
H idrogeno non polare. Es. G-C: AADH C-G:HDAA A-T: ADAM T-A: MADA
-Conformazione:
A-Dna: pu essere riscontrata in condizioni patologiche, in caso di
disidratazione del DNA. In condizioni fisiologiche essa caratterizza la
conformazione degli eteroduplex di DNA-RNA e le associazioni DNA-proteine.
Z-Dna: con andamento sinistrorso, riconosciuta dalle Z-DNA binding proteins.
presente in caso di metilazione o in sequenze ricche di basi C e G.
B-Dna con passo=3,4 nm rappresenta la forma pi comune nelle cellule
eucariotiche.
-Nucleoside= zucchero pi base azotata con un legame beta-N-glucosidica tra:
*C anomerico del 2-deossi-ribosio *N-1 della base pirimidiniche *N-9 della base
puriniche. Del legame beta-N-glucosidico possiamo avere una conformazione
Sin delle purine nel Z-Dna (le pirimidine resta anti); e una conformazione Anti
nel normale DNA destrogiro.
NB nel processo di denaturazione esso risulta reversibile, a differenza delle
proteine, se il raffreddamento avviene lentamente. Avviene alla temperatura di
melting, che dipende dalla composizione nucleotidica: se la molecola ricca di
C-6 pi alta perch dobbiamo rompere pi legami.
-Forma: circolare nei batteri plasmidi e virus; superavvolta dove LK=Twist +
writhe (negativamente nelle cellule eucariotiche).
LK= linking number
Twist= avvolgimento, numero di volte che un filament gira intorno allaltro
Writhe: superavvolgimento, avvolgimento della doppia elica lungo lasse
longitudinale (numeo di incroci).
Le forme di Dna superavvolto possono essere: *Pectonemico, con asse
longitudinle avvolto su se stesso (nei nostro cromosomi) *spirale, con asse
longitudinale avvolto intorno alla proteina.
NB il rilassamento del Dna con Dnasi I rimuove i superavvolgimenti. Le
topoisomerasi sono degli enzimi utili negli eventi di trascrizione e replicazione
del Dna, decatenano e districano il Dna.
Le topoisomerasi II funzionano ad ATP tagliano nettamente tutti e due i
filamenti del Dna e permettono il passaggio di un tratto di elica integra
attraverso il taglio e risaldatura del taglio. Per saldare si ha il gruppo OH sul
legame fosfo-tirosina. Le topoisomerasi II cambiano pertanto il numero di
legame di 2 unit per volta.
Le topoisomerasi I funzionano senza ATP, agiscono su un singolo filamento
effettuando un taglio detto nick che permette il passaggio del filamento integro
attraverso il nick che verr poi saldato. Meccanismo di azione: una sua tirosina
va a legarsi al fosfato dove stato indotto il taglio, c una dilatazione, poi il
taglio e il cambiamento.
Le topoisomerasi generano topoisomeri di DNA, che differiscono per il linking
numer. Essi si posso separare mediante elettroforesi.
2.Rna
Molecola a singolo filamento ottenuta per trascrizione dal DNA, dove un
filamento di DNA viene trascritto in un filamento di RNA complementare.
Diverso dal Dna per il ribosio e luracile (senza un gruppo metilico al C5) al
posto del deossiribosio e della timina.
Il singolo filamento pu avvolgersi su se stesso (e formare strutture secondarie,
terziarie e quaternarie) e avere tratti a doppia elica appaiando le basi della
stessa catena. Questo appaiamento non continuo ma c solo fra zone di
complementariet.
-struttura a gemma: quando c un solo nucleotide non complementare si
forma una singola protrusione
-struttura ad ansa: numero maggiore di nucleotidi non complementari
-a fiorami: numero ancora maggiore di nucleotidi non complementari. Quando
si formano, si creano zone consensus che fanno si che possa legarsi le proteine.
Ci sono anche appaiamenti non canonici, oltre a A U e C G (es- G U) che
formano TETRALOOP, quando ci sono 4 nucleotidi specifici.
-pseudonodi: sono coinvolti nel controllo dellespressione genica.
N B lappaiamento non canonico d vita ad una struttura che pi simile allADna, con un solco maggiore pi stretto, minore specificit.
Tipologia di Rna
-Rna codificante (4%)pre-mRna->m-Rna
-Rna funzionale: Pre-rRNA->rRNA (qui si lega la ricina e d morte- 0,2 mg
letale-sub maggiore del ribosoma segmento sarcina-ricina)
Pre-tRna->tRna (20 specifici per i 20 amminoacidi)
Sn-Rna, RNA, miRNA, siRNA (tutti microRna la cui funazione
: *funzione regolatoria sullespressione genica, nellembrione soprattutto
*sono presente anche nel sangue circolante e potrebbe essere biomarcatore
*sono coinvolti in patologie con difetti del differenziamento.
Influenza di ph e temperatura: TEMPERATURA, se maggiore di quella
ambientale, lRNa si denatura
PH, determina la configurazione dellRna
Per ricercare molecole a fini terapeutici si sintetizzano RNA fino a 100
nucleotidi con sequenze che interagiscono con determinate proteine.
1lisi della cellula
2 cromatografia: si utilizzano colonne ecomatografiche con dentro una matrice
solida di SEPADEX formata da piccole sferette che lasciano uno spazio detto
spazio escluso. Praticamente si va a frammentare la cellula nei suoi costituenti
che attraversano questi spazi grazie a una soluzione tampone che mantiene
costante il pH. Prima metto la miscela, poi introduco gradualmente la fase
mobile e recupero le sostanze in frazioni diverse. Si divide in: *a esclusione
molecolare, forma frazione a seconda della grandezza. *Di affinit, alle sfere
aderisce un anticorpo che reagisce con una specifica molecola. Se vogliamo un
particolare RNA, mettiamo il DNA complementare sulle sferette cos otterremo
lRNA di nostro interesse. Se vogliamo che si distacchi, bisogna alterare il pH o
la forza ionica.
3 PCR per lamplificazione del campione. Ottengo quindi degli aptameri,
molecole di RNA tridimensionale con appaiamenti canonici e non canonici che
interagiscono con determinate proteine OVEREXPRESSED
MODELLO DEL REPLICONE per linizio della replicazione. Nel genoma ci sono
sequenze altamente metilate e ricche in A-T che sono quindi facilmente apribili.
Nel cromosoma ci sono pi siti di replicazione a seconda delle fasi del ciclo
cellulare.
Replicone: tratto di Dna compreso fra due forche di replicazione. Esso
comprende:
*replicatore (intero set di sequenze di Dna in grado di dirigere linizio della
replicazione=
*iniziatore (proteina che riconosce il replicatore e attiva linizio della
replicazione reclutando le altre proteine necessarie.
Inizio della replicazione nei procarioti: proteine iniziatrici legano il dsDna,
avviene la rottura dei legami a H, poi forcelle di replicazione. Il sito di origine
completamente metilato, poi inizia la replicazione e il sito emimetilato e si
lega la proteina SegA che rende lorigine di replicazione refrattaria, poi di
nuovo tutta metilata e non pi refrattaria e altre replicazioni.
Inizio della replicazione negli eucarioti: regioni diverse del cromosoma sono
duplicate nei momenti diversi della fase S. loridne? Dipende dalla struttura
della cromatina.
TELOMERASI: ribonucleoproteina che aggiunge al terminale 3 dei filamenti di
Dna. Sequenze ripetitive di Dna non codificante TTAGGG. Nel filamento lagging
quando si formato lultimo primer a Rna, il filamento di Dna verrebbe
accorciato ad ogni replicazione e ci evitato dalla telomerasi.
Non richiede innesco perch usa frammenti di Rna propri per lelongazioni
complementari alla sequenza telomerica per generare lo stampo-innesco. 7
*la telomerasi allunga il terminale 3 del telomero
*la parete allungata, senza stampo, pu funzionare per la sintesi di un
frammenti di Okazaki
*con la riparazione del frammento il telamero viene esteso
*la telomerasi si stacca perch ci sono proteine concentrate che delimitano il
Dna e che creano anse (LOOP) per proteggere il cromosoma.
CLONAGGIO
Utilizzato per identificare i repliconi nelle cellule procariotiche. Richiede:
*polimerasi (RNA DNA)
*nucleasi( endonucleasi che digeriscono il DNA allinterno, esonucleasi che
digeriscono il DNA allestremit)
*ligasi
*enzimi di restrizione (riconoscono sequenze di DNA e li digeriscono) sono
presenti tre classi:
1 sono sequenze indipendenti, hanno attivit di restrizione e metilazione della
stessa molecola
2 riconoscono sequenze specifiche, attivit di restrizione e metilazione su
molecole distinte
3 tagliano lontano dal sito di riconoscimento, attivit di restrizione e
metilazione sulla stessa molecola
In particolare, la classe II riconoscono sequenze specifiche a 6 coppie di basi
che tagliano in 3 modi:
*ECOR1: riconosce GAATTC; forma lestremit sporgente al 5
*BAMH1: riconosce CTTAAG; forma estremit 3 sporgente
*ECOR5: forma estremit blunt (determina un taglio netto)
1.UCE lega UBF e SL1 che reclutano la polimerasi sul promotore centrale->la
polimerasi I riconosce il genere precursore dellRNA-> questo gene ha un
livello di espressione molto alto
2.il promotore I trascrive un RNA precursore che contiene 3 pezzi dellrRNA:
-45s
-lestremit S viene rimossa-> precursore 41s
-precursore 41 s viene scisso in: *precursore 20 s->rRNA 18 s e precursore
32 s->rRNA 5,8
NB pi polimerasi si legano per ottenere pi RNA
Nucleolo:sede del processo. Si trova nel nucleo in corrispondenza dei siti
cromosomici detti NOR contenenti i precursori dellrRNA.
Promotore di classe II: riconosciuti dalla pol II che contiene
-subunit centrale RPB1,2,3 (RBP1 contenente DOMINIO CTD ha una forma
sia fosforilata responsabile dellallungamento, e una non fosforilata che si
lega al promotore allinizio)
-subunit comuni: RPB5,6,8,10,12 presenti in tutte e 3 le polimerasi
-subunit non essenziali
Le polimerasi II trascrivono i geni che codificano per proteine
Struttura= promotore base di 70 bp che contiene alcuni elementi tra:
-BRE
-TATA BOX (sequenza consensus=TATAAA posizione=25-30basi a monte
ne prive=geni omeotici,houskeeping e associati allo sviluppo del sistema
immunitario)
-INR iniziatore(sequenza consensus PyPyAN(T/A)PyPy di cui A rappresenta il
punto di inzio della trascrizione ed N un nucleotide qualsiasi)
-DPE elementi promotori a valle (sequenza consensus= G (A/T) CG
posizione=30 basi a valle lega=TPIID insieme a INR)
ELEMENTI A MONTE GC BOX (sequenza consensus=ricca di GC posizione=
a monte di TATA BOX funzione= aumentano lattivit dei promotori)
SEQUENZE REGOLATORIE:
-enhancers: sequenze indipendenti dalla posizione. Sono ripetizioni di 72
basi distanti anche 20000 dal promotore incrementando la trascrizione
-silencers: silenziano la trascrizione
-UAS
ELEMENTO A MONTE------BRETATA-------INR---DPE
COMPLESSO DI PREINIZIO
Fattori generali di trascrizione + polimerasi legati al promotore=complesso di
preinizio
Funzioni del GTF: 1.aumentano la polimerasi a legarsi al promotore 2.a
separare il DNA 3.a passare alla fase di allungamento
COMPLESSO DI PREINIZIO DI CLASSE II= polimerasi II (TFIIA TFIIB,D,E,F,H) e in
ordine si legano DABFEH. TFIIAD-> riconoscimento di Tata BOX che d un
TFIIH-
Struttura: 3 DOMINI
1.DOMINIO DI LEGAME AL DNA -> tipologie:
*moduli contenenti zinco (grazie allo zinco hanno una forma che si adatta al
solco maggiore del DNA):
a.dita di zinco: sono formate da un filamento b antiparallelo contenente
cisterne e da un alfa elica (contenente istidina). Cisteina e istidina sono
coordinate dallo zinco e formano il dito, e pi dita di un modulo prendono
contatto con le basi del DNA e separano i filamenti
b.GAL4(lievito) controlla geni coinvolti nel metabolismo del galattosio. Essa
contiene zinco ma non forma dita
c.GRE
N.B. recettori ormonali:
1.di membrana: meno porzioni extracellulari, pi porzioni transmembrana, pi
porzione intracellulari
2.nucleari: dominio C terminale di interazione con il ligando + dominio di
interazione con il DNA + dominio N terminale. Dei nucleari conosciamo tre tipi:
a) tipo I: citoplasma, ormoni steroidei, glucorticoidi essi cambiano
conformazione, vanno nel nucleo e si legano come omodimeri al DNA
b)tipo II: ormoni tiroidei essi formano dimeri con RXR e si legano sia in
presenza che in assenza del ligando (se c agiscono da attivatori, se non c
agiscono da repressori)
*omeodomini:
*dimini beta ZIP
*domini BHLH
2.DOMINIO DI ATTIVAZIONE TRASCRIZIONALE
3.DOMINIO DI DIMERIZZAZIONE
Funzione: indicano cambiamenti allosterici delle proteine dellapparato
trascrizionale ed dimostrato con immunoprecipitazione della cromatina. Le
proteine sono fissate al DNA con formaldeide, il DNA viene frammentato con
sonicazione, viene usato un anticorpo specifico per la proteina coniugato ad
una resina->immunoprecipitazione del frammento del DNA. Il DNA
amplificato con PCR e poi sequenziato.
6.Splicing
Formazione dellRNA maturo per rimozione degli introni e concatenazione degli
esoni.
Esoni: porzione di un gene che entra nellmRNA maturo. Non implica una
regione codificante (contiene regioni per la regolazione dellespressione genica
dette regioni 5 non tradotte)
Introni: siti di regolazione che devono essere rimossi con lo splicing
MECCANSIMO:
La precisa rimozione delle sequenze introniche dipende dalla presenza di
specifiche sequenze che segnano le estremit degli introni: i siti di splicing al 5
e al 3:
sito di splicing 5: allestremit 5 dellesone ho A-G, allestremit dellintrone
ho GU (A-G) AGU
(introne)
3(pir)AG----G(esone)
punto di
ramificazione
(introne