Instrumentales de laboratorio

Introduccin:
Todo laboratorio de Micropropagacin debe constar con diferentes reas
de trabajo que aseguren condiciones de asepsia y esterilidad
dependiendo de las tareas que se realicen. En la sala especfica de
micropropagacin, se debe contar con un flujo laminar de tipo horizontal
con un filtro HEPA de al menos 0.22 uM de tamao de poro. El espacio
destinado a tal fin debera poseer pisos, paredes y techos realizado con
materiales de fcil limpieza.
Con el fin de evitar flujos de aire turbulento que perjudiquen el buen
funcionamiento de los flujos laminares e incrementen la contaminacin
por agentes externos se deben crear salas de doble entrada (precmaras) tanto en la/s salas donde se encuentran ubicados dichos
equipos, como as tambin en las cmaras de plantas. Dichas salas
debern contar con presin positiva mediante la entrega de aire estril
forzado.
Objetivos:

Tener el conocimiento de los materiales de laboratorio para un

correcto empleo
Reconocer los dipositivos a disposicin dentro del laboratorio.

Revisin bibliogrfica:
La biotecnologa tiene sus fundamentos en la tecnologa que estudia y
aprovecha los mecanismos e interacciones biolgicas de los seres vivos,
en especial los unicelulares, mediante un amplio campo
multidisciplinario. La biologa y la microbiologa son las ciencias bsicas
de la biotecnologa, ya que aportan las herramientas fundamentales
para la comprensin de la mecnica microbiana en primera instancia. La
biotecnologa se usa ampliamente en agricultura, farmacia, ciencia de
los alimentos, medio ambiente y medicina. La biotecnologa se
desarroll desde un enfoque multidisciplinario involucrando varias
disciplinas y ciencias
como biologa, bioqumica,gentica, virologa, agronoma, ecologa, inge
niera, fsica, qumica, medicina y veterinaria entre otras. Tiene gran
repercusin en la farmacia, la medicina, la ciencia de los alimentos, el
tratamiento de residuos slidos, lquidos, gaseosos y la agricultura. La

Organizacin para la Cooperacin y Desarrollo Econmico (OCDE) define

la biotecnologa como la "aplicacin de principios de la ciencia y la
ingeniera para tratamientos de materiales orgnicos e inorgnicos por
sistemas biolgicos para producir bienes y servicios".
Establecimiento de un laboratorio:
Un laboratorio de cultivo de tejidos se puede dividir esquemticamente
en reas separas para las diferentes funciones que se desarrollan en l.
Sin embrago en la para algunas funciones pueden desarrollarse en un
mismo ambiente. Las reas principales son (CIAT, 1993):
a) rea de preparacin. Utilizado para la preparacin de medios de
cultivo, as como para proveer un espacio de almacenamiento de
los materiales de vidrio y de plstico,
b) rea de lavado y de esterilizacin. Pueden ser dos reas
conectadas entre s, o un solo ambiente, y puede estar localizada
dentro del rea general de preparacin. Debe incluir un lavadero
grande con agua caliente y fra, y una fuente de agua de alto
grado de pureza, preferiblemente agua doblemente destilada
c) rea de transferencia. Es donde se realiza el trabajo de
escisin, inoculacin y trasferencia de los explantes a los medios
de cultivo. Dado que este trabajo demanda los ms altos niveles
de limpieza, se recomienda la instalacin de cmaras de flujo
laminar, horizontal o vertical, de aire filtrado bajo presinrea de
incubacin. Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o en
un gabinete o en cmaras de crecimiento; estas pueden ser ms
eficientes en cuanto al control ambiental, pero son ms costosas.
El rea de incubacin o crecimiento in vitro
Esa rea debe incluir adems, un espacio para cultivos en
agitacin y para cultivos estticos en oscuridad (si son
necesarios).
d) rea de observacin y examen. Opcionalmente, los
microscopios pueden estar en un rea separada, para realizar
observaciones peridicas de los cultivos, tanto en medios
semislidos como en lquidos.

Las reas descritas hasta ahora se consideran el ncleo de todo

laboratorio de cultivo de tejidos. Un laboratorio de produccin comercial
debera de tener adems, lo siguiente:
e) rea de crecimiento. Lugar donde se acondicionara o
aclimatarn las plantas salidas del rea de incubacin, para luego
ser trasplantadas en macetas, camas, bandejas, etc. Esto se
puedefitosanitarias.
Luego
del
trasplante,
las
plantas
necesitan
de
un
acondicionamiento gradual al campo, que puede hacerse usando
nebulizadores, cmaras hmedas de plstico, etc.

Equipo de Laboratorio:
Para un laboratorio de tamao medio se necesitan las siguientes piezas
y equipo estndar (CIAT, 1993):
a) En el rea de preparacin: Refrigerador, balanzas (una macro
balanza y una de precisin), potencimetro (medidor de pH),
plancha elctrica con agitador elctrico, frascos Erlenmeyer (120,
250y 500ml), botellas y material de vidrio o plstico.
b) En el rea de lavado y esterilizacin: Autoclave manual o
automtico (grande o de mesa), destilador de vidrio, gradillas para
secado, bandejas de aluminio y plstico de varios tamaos,
recipientes de plstico grandes, estufas para esterilizacin y
secado.
Conclusiones:

Hace posible establecer bancos de germoplasmas en pequeos

espacios.
Un clon mantenido in vitro puede ser propagado en cualquier
poca del ao.
Por medio de esta tcnica es posible cultivar polen y anteras
mediante las cuales se producen plantas haploides.

PREPARACIN DE SOLUCIONES STOCK (PRCTICA 02)

INTRODUCCIN
OBJETIVOS:
-

Aprender a realizar el clculo y pesado de sales, para la preparacin de

la solucin stock.
Aprender a identificar los reactivos.
Aprender a preparar (dilucin) las soluciones Stock.
Aprender a formular las distintas soluciones Stock, deacuerdo a los
requerimientos segn la especie.

REVISIN BIBLIOGRFICA:
Solucin Madre o Stock
Una solucin es una mezcla homognea cuyas partculas son menores a 10
angstrom. Estas soluciones estn conformadas por soluto y por solvente. El
soluto es el que est en menor proporcin y por el contrario el solvente est en
mayor proporcin. Para diluir una solucin es preciso agregar ms % de
disolvente a dicha solucin y ste procedimiento nos da por resultado la
dilucin de la solucin, y por lo tanto el volumen y concentracin cambian,
aunque el soluto no. Una solucin madre o stock es una concentracin de algn
macro o micro nutriente necesario para el desarrollo adecuado de explantes
vegetales.
Macronutrientes
Son los que se requieren en cantidades de milimoles y son los elementos
requeridos en mayor cantidad, (carbono C), oxgeno (O) e hidrgeno (N),
aminocidos, Vitaminas, protenas y cidos nucleicos. Comnmente se
adicionan como nitrato o amonio y menos usual como nitrito. El nitrito se
aade en concentraciones de 25-40 milimoles y el amonio de 2 a 20 milimoles
(Gamborg y Jerry, 1981) fsforo (P) empleado casi universalmente en forma de
fosfatos; sin embargo, la alta concentracin de fosfato en solucin puede

detener el crecimiento, azufre (S) como sulfato y con la posibilidad que se

agregue en forma de sulfito o como sulfuro, pero con menos efectividad (Nitsch
y Nitsch, 1969). Como fuente de azufre, adems de los sulfatos, sulfitos, se
encuentran la cistena, metionina o glutation. La deficiencia de azufre da por
resultado una etiolacin; magnesio (Mg) es componente fundamental de la
molcula de clorofila; el calcio (Ca) es parte importante integral de la
membrana celular, adems confiere proteccin a la membrana contra los
efectos deletreos de los metales pesados, salinidad y pH muy bajos;
usualmente se adiciona como cloruro de calcio (CaCl2 2H2O)m nitrato de calcio
(Ca (NO3)2) y menos comnmente como fosfato triclcico (Ca 3 PO4); fsforo
y el potasio como el catin mayor y se adiciona en la forma de KNO3, KI, KCI Y
K2 PO4. En trminos general fsforo, calcio, magnesio y azufre son requeridos
en concentraciones de 1 a 3 milimoles para un buen crecimiento. Sin embargo,
existe un antagonismo entre el Ca y el Mg. Cuando la concentracin de Mg+
es alta, se requiere tambin alta Ca+. La concentracin comparativa es a
menudo ms importante que la concentracin absoluta de iones.
Micronutrientes
Equipo automtico de preparacin y dosificacin de
medio de cultivo.

Los micronutrientes o elementos menores se aaden en concentracin

micromolar. Los elementos menores son seis, a saber: Fierro (Fe), zinc (Zn),
manganeso (Mn), cobre (Cu), cobalto (Co), boro (B) y molibdeno (Mo) que
forman parte de la estructura de algunas protenas vegetales, o vitaminas de
inters bioqumico-fisiolgico. De los 6 elementos, el Zn, Mn, Fe, Cu y Mo
intervienen en la sntesis de la clorofila y en la estructura del cloroplasto
(Sundqvist et al, 1980). El manganeso es considerado como uno de los ms
esenciales, junto con el boro y el fierro; adems tiene importancia de la
fotosntesis en donde interviene en la conservacin de la ultraestructura de los
cloroplastos. De acuerdo a Galston y Hillman (1961), el Mn es un cofactor de
las enzimas peroxidasa que permiten la oxidacin del cido indolactico en las
clulas vegetales. Doershug y Miller (1967) mencionan que la omisin reduce
el nmero de brotes en cotiledones de lechuga. Asimismo su adicin en alta
concentracin puede compensar la carencia del Mo en raz de jitomate (Hannay
y

Street, 1954). En ocasiones el manganeso puede remplazar al magnesio, en

algunos sistemas enzimticos (Hewitt, 1948).

RECOMENDACIN:

Tener cuidado con la cantidad de un compuesto a aadir, en peso,

puesto que est en funcin de su grado de hidratacin. Lo relevante es
mantener la molaridad del nutriente; a igual peso del compuesto, cuanto
mayor grado de hidratacin menor molaridad del
La preparacin correcta de las soluciones madres es muy importante, ya
que van a ser estas los componentes del medio de cultivo final, donde
va estar y desarrollarse el explante, un error en esta labor puede
propiciar el total fracaso de la micropropagacin, puesto que los

explantes son muy susceptibles a variaciones (pH, sobredosis de un

elemento) en el medio de cultivo.
La calidad del agua es importante si es que va ser el solvente utilizado,
debe ser destilada. Para evitar reacciones con los compuestos.
Es importante contar con compuestos de calidad (que la pureza indicada
en el envase sea la correcta), para realizar buenas dosificaciones, ya que
cualquier error afecta el proceso en general. Tener proveedores de
confianza.
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO (PRCTICA 03)
INTRODUCCIN

Una parte importante del cultivo in vitro son los Medios de Cultivo ya que en
ellos se encuentran las sustancias necesarias para el crecimiento y desarrollo
de los tejidos vegetales. Antes de realizar la asepsia del material vegetal que
se va a introducir in vitro, es necesario disponer de Medios de Cultivo
esterilizados y dosificados en recipientes adecuados.
OBJETIVOS:
-

Conocer la clasificacin, preparacin, esterilizacin y distribucin de los

medios de cultivo.
Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparacin
del medio de cultivo en la micropropagacin.
Adquirir prctica en el preparado de algunos medios de cultivo a partir
de sus componentes individuales.
Reconocer la necesidad de evitar la contaminacin tanto de los medios
de cultivo como de los dems elementos utilizados en el laboratorio de
microbiologa.

REVISIN BIBLIOGRFICA:
Segn su origen:
a) NATURALES: Son los preparados a partir de sustancias naturales de origen
animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin
qumica no se conoce exactamente.
b) SINTTICOS: Son los medios que contienen una composicin qumica
definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados
reproducibles.
c) SEMISINTTICOS: Son los sintticos a los que se les aaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por
ejemplo extracto de levadura.

Segn su consistencia:
a) LQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solucin
acuosa.
b) SLIDOS: se preparan aadiendo un agar a un medio lquido (caldo) a
razn de 15g/litro. El agar es una sustancia inerte polisacrida (hidrato de
carbono) que se extrae de las algas. Como esta sustancia no es digerida por las
bacterias no constituye ningn elemento nutritivo. Este conjunto
convenientemente esterilizado puede ser vertido en placas de Petri o en tubos
de ensayo y presentan la posibilidad de aislar y diferenciar bacterias, "procesos
que antes no eran posibles en medio lquido".
c) SEMISLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para
determinar la motilidad de las especies en estudio. Actualmente se encuentran
disponibles comercialmente con el agregado de agar.
Pasos para la preparacin de medio de cultivo:

1. Mezclar las soluciones Stock.

2. Homogenizar
el
medio
de
cultivo.
3. Enrazar.
4. Medir el pH.
5. Adicionar el agar.
6. Diluir el agar.
7. Distribuir en los recipientes.
8. Esterilizar en el autoclave.
9. Guardar en anaquel durante 7
das.

CONCLUSIN:

Para las distintas especies vegetales existen distintos medios de

cultivo, debido a que cada especie tiene distintos requerimientos
de nutrientes.
Cada paso en el proceso de la preparacin es muy importante para
obtener un buen medio de cultivo.
El medio de cultivo debe ser totalmente estril para tener xito en
la micropropagacin.
Para hallar el medio de cultivo ms ptimo se deben realizar
ensayos debido a que las plantas tienen diferentes requerimientos

ya sea por ser de distintas especies o por perteneces a distintos

medio ambientes.