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Corrig du TD

Dnombrements Bactriens

Introduction :
Dnombrer les bactries = donner le nombre de bactries par unit de volume, trs souvent par ml de
culture analyse.
Diffrentes applications du dnombrement bactrien :
Ex1 : Contrle de qualit dun aliment
Le nombre de bactries existant dans un chantillon dun lait est compar des seuils ne pas dpasser
(normes de qualit dun lait).
EX2 : Evaluer la fertilit dun sol : (en se basant sur son activit microbiologique)
Dterminer le nombre de bactries par gramme de sol peut renseigner sur sa fertilit, spcialement les
bactries intervenant dans les cycles bio-go-chimiques du carbone, de lazote, du soufre, etc
EX 3 : Diagnostic dune maladie infectieuse :
Le dnombrement des bactries dans une urine renseigne sur linfection urinaire ou pas, grce une
comparaison des seuils ne pas dpasser seuils (Tableau de Merlin)
EX4 : Degr de pollution dun milieu aquatique :
Le dnombrement certaines bactries (coliformes fcaux)) renseigne sur la qualit microbiologique du milieu
tudi et son degr de pollution.
II. Mthodes de dnombrement :
Mthodes directes :
*Le comptage direct des cellules se fait au microscope laide dun hmatimtre appel Lame de Thoma
(cest une lame munie au centre dun quadrillage de dimensions bien dtermines), voir exercice I.
* Epifluorescence :
Les bactries sont colores par un fluorochrome (Orange dacridine ou Erythrosine), puis observes au
microscope en lumire UV. Cette mthode permet de compter slectivement les bactries vivantes
fluorescentes une couleur diffrente des cellules mortes. Cette technique a des inconvnients du fait
que la couleur des cellules peut changer avec le pH du milieu par exemple.
*Compteur de particules :
Cet appareil ralise automatiquement le dnombrement des particules ou cellules en suspension dans une
solution, grce aux modifications de rsistances lectriques quelles provoquent leur passage travers un
orifice calibr.
Mthodes indirectes : (aprs culture)
Bactrie + lments nutritifs (C , N, O2 , etc)---------- Biomasse cellulaire + Produits

Le dnombrement se base sur lvaluation de cette biomasse soit par :


*Mesure de la masse aprs culture sur milieu de culture liquide :
La biomasse peut tre value par pese du poids sec aprs filtration et schage) ou par mesure de la
Densit du trouble (DO au spectrophotomtre)
* Mesure de lactivit des bactries, en suivant la cintique de disparition dun substrat ou celle de
lapparition dun produit final.
*Mesure du nombre de bactries :
-

Dilution et dnombrement en milieu de culture solide : exercice II

Estimation du nombre le plus probable (MPN) : exercice III


III. Diffrence entre les mthodes directes et indirectes :
Mthodes directes : comptent directement les cellules, leur

rsultat est rapide, mais peuvent

compter aussi bien les cellules mortes que les cellules vivantes.
Mthodes indirectes : ne comptent que les cellules viables et culturables dans un milieu de
culture ; mais demandent du temps (minimum 24h).
Selon le but recherch et la prcision du dnombrement requise, on choisit lune ou lautre des mthodes.
IV Exercices dApplications :
Exercice I :
On veut dterminer le nombre de bactries vivantes dans lurine dun malade atteint dune infection
bactrienne et suivant un traitement antibiotique. Les dnombrements avant le traitement ont montr que
lurine du patient contient une concentration de 106 cellules bactriennes vivantes par ml durine. Aprs un
jour de traitement au Bactrim (trimethoprim + sulphamethoxazol), le pharmacien biologiste dpose un
volume de 0,01 ml la surface dune cellule de Thoma. Aprs 30 minutes de repos permettant la
dcantation des cellules, la lame est examine au microscope, au fort grossissement.
Calculer la concentration des cellules par ml dans cette urine sachant quon a compt 350 cellules dans 10
petits carrs dans une solution 10 fois plus concentre de lurine originale.
Aprs coloration au bleu de mthylne, le pourcentage de cellules bleues tait de 80 %. Quel est la
signification de ce rsultat pour le comptage des cellules ?
Quel est la signification de ce rsultat pour le malade ? Le traitement est-il efficace ?
Rappel : La cellule de Thoma est une lame creuse au centre avec un quadrillage denviron 400 petits
carrs. Chaque petit carr a une surface de 1/400 mm2. La distance entre la grille et la lamelle est de 1/10
mm.
Rsolution de lexercice I :
a) Volume dun petit carr := surface x hauteur
= 1/400x 1/10 = 1/4000 mm3= 0,25 .10-3 mm3= 0,25. 10-6 cm3 (ml)

Le volume de 10 petits carrs= 0,25 10-5 mm3


Nous avons 350 cellules dans 10 petits carrs
Le nombre total = 350 divis par 0,25 . 10-5
= 14. 107 cellules / ml de lchantillon analys.
Puisque lurine du dpart tait concentre 10 fois, donc le nombre de bactries dans lurine est : 14 .
106 cellules /ml durine.
b) Aprs coloration au bleu de mthylne, 80% des cellules taient colores au bleu. Le colorant utilis
ntant pas un colorant vital, il ne colore que les cellules mortes.
c) pour le malade, la majorit des cellules sont mortes. Le traitement pendant un seul jour au Bactrim tait
trs efficace.
Exercice II
L'analyse bactriologique d'une urine infecte donne le tableau de rsultats suivant, sachant que l'on
a ensemenc 0,1 ml de chaque dilution par boite de milieu de culture.
_____________________________________________________________
10-1

Dilution

10-2

10-3

10-4

_____________________________________________________________
Essai 1

inc

490

95

Essai 2

inc

501

110

Essai 3

inc

520

120

_____________________________________________________________
inc : incomptable

a) Dfinissez une colonie.


b) Quelle dilution doit-on utiliser pour raliser le dnombrement ?
c) Dterminez le nombre de bactries par ml d'urine.
d) Le dnombrement bactrien sur le mme chantillon d'urine, par la mthode directe au microscope
5

optique, a donn 15.10 bactries /ml, comparer les deux rsultats et interprter.
Rsolution de lexercice II :
a) une colonie est un ensemble de cellule qui proviennent de la division dune mme cellule mre.
b) Si on ensemence un volume connu sur une boite de glose nutritive, le nombre de colonies obtenu sur
cette boite

aprs incubation une temprature optimale, correspond au nombre de bactries

ensemenc au dpart. Si on peut aisment compter le nombre de colonies, on peut dduire le nombre
initial de bactries, connaissant le volume ensemenc.
Ex : si on ensemence 0,1 ml dune suspension bactrienne sur une boite de glose nutritive, et si aprs
incubation 37 C pendant 24H, on compte 10 colonies, le nombre initial de bactries est gal 10 x 10 (0,1 ml
ensemenc) = 100 bactrie/ml de suspension bactrienne.
Comme le nombre de bactries compter nest pas connu au dpart, et pour avoir au moins une boite o on
peut aisment compter le nombre de colonies, on procde gnralement une dilution de lchantillon avant
densemencer le milieu de culture.

Une srie de dilution de 10 en 10 est gnralement prpare. Et chaque dilution est ensemence au niveau
dune boite de glose nutritive. Aprs incubation, on ne considre que les boites de GN o on peut compter
facilement le nombre de colonies apparues. Pour une mme dilution, on refait plusieurs essais, pour avoir un
nombre moyen et augmenter la prcision du dnombrement. (voir tableau de lnonc).
Parmi les boites comptables on ne considrera que la boite qui a donn un nombre de colonies compris
entre 30 et 300 colonies.
Si le nombre est infrieur 30, il nest pas statistiquement significatif.
Si le nombre est suprieur 300, on risque de sous estimer le nombre de bactries du fait quil peut y avoir
une comptition entre ce grand nombre de bactries vis a vis des lments nutritifs disponibles et vis vis
de lespace et par la suite une inhibition dune bonne proportion de cellules au niveau de la boite. Dans notre
-3
exemple, la dilution choisie est la dilution 10 .

c) Le nombre de bactries= 106 (moyenne) x 10 (volume ensemenc 0,1ml) x 103 ( facteur de dilution)
= 10,6 x 105 UFC /ml durine
Lunit utilise est lUnit Formant Colonie (U.F.C.) : cest une unit plus prcise que lunit bactries/ml
dans ce cas. Car on compte le nombre dunits qui forment des colonies, quelque fois, plusieurs bactries
cte cte pouvant donner une mme colonie. Il est donc plus exact de parler du nombre dunits formant
colonies que de nombre de bactries.

c) La diffrence entre les deux mthodes vient du fait que la mthode directe au microscope compte aussi
bien les cellules vivantes et les cellules mortes.
Rsolution de Exercice III :
Le dnombrement des bactries ammonifiantes dans des suspensions de trois sols diffrents a t ralis par
la mthode du MPN.
A partir de chaque sol une suspension de 1g de sol broys dans 10 ml d'eau physiologique strile a t
-2

-7

prpare. Des sries de dilutions de 10 10 ont t prpares dans leau physiologique partir de chaque
-1

-7

suspension de sol. Ensuite, 1 ml de chaque dilution prpare (10 10 ) a t ensemenc dans un milieu de
culture spcifique, raison de trois rptitions pour chaque dilution. Aprs incubation 28c pendant 15 jours,
les tubes positifs sont dtects par une coloration orange, aprs addition du ractif de Nessler. Les rsultats
obtenus sont reprsents ci-dessous :
______________________________________________________
Dilution
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6 10-7
______________________________________________________
--Sol 1
+++
+++
+++
+++
+++-Sol 2
+++
+++
++--------Sol 3
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
______________________________________________________
1) Calculez pour chaque type de sol, le nombre de germes par gramme de sol .
2) quel serait le rsultat si le volume ensemenc tait de 0,1 ml .

Tableau de Mc Crady (3 tubes par dilution)


_______________________________________________________________________
Nombre
Nombre
Nombre
caractMPN
caractMPN
caractMPN
ristique
ristique
ristique
_______________________________________________________________________
000
0,0
201
1,4
302
6,5
001
0,3
202
2,0
310
4,5
010
0,3
210
1,5
311
7,5
011
0,6
211
2,0
312
11,5
020
0,6
212
3,0
313
16,0
100
0,4
220
2,0
320
9,5
101
0,7
221
3,0
321
15,0
102
1,1
222
3,5
322
20,0
110
0,7
223
4,0
323
30,0
111
1,1
230
3,0
330
25,0
120
1,1
231
3,5
331
45,0
121
1,5
232
4,0
332
110,0
130
1,6
300
2,5
333
140,0
200
0,9
301
4,0
_______________________________________________________________________
Rsolution de lexercice III :
La mthode de dnombrement par MPN sur milieu de culture liquide est utilise dans le cas o on na pas
la possibilit dutiliser le milieu de culture solide.
Trois milieux de culture sont ensemencs par dilution et on considre la prsence ou labsence des
bactries recherches mises en vidence par des tests spcifiques.
Dans le cas dchantillons solides,

comme le sol, on doit passer par une tape de prparation de

lchantillon (ici broyage de 1g de sol et sa dissolution dans 10 ml deau physiologique strile) avant de
passer aux dilutions. Cette tape est considrer lors des calculs pour ramener au gramme de sol. Cette
tape correspond une sorte de dilution au 1/10 de lchantillon de sol.

Pour la mthode de Most Probable Number (le nombre le plus probable), on se base sur des tables
statistiques qui donnent le nombre le plus probable de germes dans un milieu tenant compte du nombre de
tubes positifs obtenus dans cette exprience. Le nombre de tubes positifs relevs nous permet de calculer
un nombre caractristique NC. Le NC est un nombre form de trois chiffres. Le premier chiffre correspond
celui relev la plus grande dilution qui donne le maximum de tubes positifs. Cette dilution sera prise
considration pour les calculs. Les deux autres chiffres correspondent aux nombres respectifs de tubes
positifs dans les deux dilutions qui suivent.
Selon la table de Mac Grady, chaque nombre caractristique correspond un nombre plus probable de
germes par le volume ensemenc de la dilution considre.
EX : le sol 1 : Le nombre caractristique est 321 la dilution 10-4.
Dilution

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

Sol 1

+++

+++

+++

+++

++-

+--

---

Nombre caractristique

Le nombre le plus probable qui lui correspond dans la table de Mac Grady est : 15
Donc le nombre de bactries = 15x 104 (Dilution ayant donn 3+) germes/ml

Pour exprimer le rsultat par gramme de sol, on considre que la prparation de la suspension initiale (1g
dans 10 ml) est quivalente une dilution au 1/10 du sol tudi. Ainsi le nombre trouv ci-dessus sera
multipli par 10
Donc Nombre de germes = 15x 105 germes/g de sol.
Pour le sol 2 : NC = 320 la dilution 10-2
Dilution

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

Sol 2

+++

+++

++-

---

---

---

---

Nombre caractristique

Le MPN correspondant dans la table de Mac Grady est : 9,5


Le nombre de bactrie= 9,5 x 102 x 10= 9,5 x10+3 germes/g de sol
Pour le sol 3 :
Dilution

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

Sol 3

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

Nombre caractristique

Ce rsultat montre que la dilution ntait pas suffisante. Il a fallu diluer davantage lchantillon jusqu ce
quon trouve des tubes ngatifs. Cependant, on peut utiliser ce rsultat et considrer que le nombre
caractristique peut tre estim selon trois possibilits :
300 la dilution 10-7, le MPN = 2,5 x10+7 germes/ml= 2,5 x10+8 germes/g de sol.
ou 330 la dilution 10-6 , le MPN= 25x106 germes/ml = 2,5 x10+8 germes /g de sol
ou 333 la dilution 10-5, le MPN= 140x10+5 germes/ml= 1,4 x10+8 germes /g de sol
Ainsi les trois chiffres sont considrs valables, et lon peut utiliser lune ou lautre des estimations, les
rsultats sont assez proches. Mais il faut faire attention la dilution considre.
2) Si le volume ensemenc tait de 0,1ml au lieu de 1ml, le nombre trouv doit tre multipli par 10.