Universidade de Ribeiro Preto UNAERP

Microbiologia Bsica Engenharia Bioqumica

Roteiro Prtico
Professora Doutora Luciana Rezende A. Oliveira
Convidado: Douglas Amaral FCFRP-USP.

NMERO DO GRUPO: ___________

Roteiro 1

ESTERILIZAO E PREPARO DE MEIO DE CULTURA

Esterilizao: Eliminao total de microrganismo. Existem dois tipos de esterilizao:
Fsico e o Qumico.
Fsico: Calor Seco Chama (Bico de Bulsen), Calor mido (Autoclave)
Qumico: lcool com a concentrao de 70 %, PVP I (polivinilpirrolidona) degermante.

CLASSIFICAO DOS MEIOS:

Quanto a Constituio:
Rico
_______________________________________________________________________
Seletivo;
_______________________________________________________________________

Diferencial;
_______________________________________________________________________

Seletivo e Diferencial;
_______________________________________________________________________

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Transporte;
_______________________________________________________________________

Pobre ou mnimo.
_______________________________________________________________________

Quanto ao aspecto fsico:

Slido;
_______________________________________________________________________

Semi-Slido;
_______________________________________________________________________

Liquido (caldo).
_______________________________________________________________________

TCNICA EXPERIMENTAL
Vidrarias: balo de fundo chato 500 mL, placa de petri, proveta e
esptula.

Equipamentos e outros materiais: autoclave, balana, algodo, papel

Kraft e fita crepe, TSA e gua destilada.
Reagentes:
gar Sabouraud - 65g/L.
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CONTROLE DE QUALIDADE NO PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

TIPO DO MEIO: __________________________________________________.
DATA DO PREPARO: _______ / ________ / _________.
MARCA DO MEIO/FORNECEDOR: _________________________________________.
DATA DE VALIDADE DA EMBALAGEM: _______ / ______/ ___________.
DATA DE VALIDADE DO MEIO PRONTO: de 07 a 10 dias aps hidratao.

Meio de
Cultura

Colorao antes de
Autoclavar

Colorao aps
Autoclavar

Nome do aluno
que distribuir o
meio de cultura

Aspecto aps
distribuio em
placas

Mensurar a quantidade de Placas preparadas pelo grupo:

_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________

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NMERO DO GRUPO: ___________

Roteiro 2
Semeadura de incuo em superfcie

Dentro das normas de biossegurana e boas prticas de manuseio com materiais

biolgicos, pinar o inoculo e semear na superfcie do meio de cultura por tcnica de
isolamento de colnias.

A tcnica de semeadura por esgotamento utilizada para obteno de

colnias isoladas em meio slido, permitindo a seleo de colnias e diferenciao de
bactrias.

Microrganismo Semeado: ___________________________________________

Nmero da Placa

Nome do Aluno

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NMERO DO GRUPO: ___________

Roteiro 3
LEITURA E OBSERVAO DE CRESCIMENTO
MICROBIANO E PROVA DE IDENTIFICAO
BIOQUMICA - Catalase

N da placa: ____

N da placa: ____

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NMERO DO GRUPO: ___________

Roteiro 4

COLORAO DE GRAM
A colorao de Gram um mtodo usado para facilitar a observao
microscpica e diferenci-las de acordo com as suas caractersticas tintoriais, sendo
que as diferenas tintoriais so de cor violeta para o Gram positivo e vermelho para o
Gram negativo. Os organismos Gram positivos e Gram negativos diferem
drasticamente um dos outros na organizao das estruturas que so encontradas
externamente membrana plasmtica.
As bactrias Gram positivas, elas possuem na parede 90% de peptdeos
glucano e 10% de outros lipo polissacardeos, as bactrias Gram negativo possuem
10% de peptdeos glucano e 90% de outros lipo polissacardeos. Ambas coram se
com as mesmas quantidades de violeta e Iodo, formado um complexo, se for Gram
positivo a violeta fica fixa na membrana plasmtica, se for Gram negativo a violeta
ser retirada com um solvente feito com lcool + acetona. Por ultimo colocado a
fucsina onde ir mostrar se a bactria Gram negativo.

OBJETIVOS
Aprender a realizar a colorao de Gram e compreender porque determinadas
bactrias se comportam como Gram positivas ou Gram negativas.

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PROCEDIMENTO

Colocar a lmina no recipiente para a colorao de Gram.

Cobrir o esfregao com soluo de violeta de genciana. Aguardar 1 minuto e
desprezar o corante no recipiente.
Cobrir com lugol, aguardar 1 minuto, e desprezar o corante no recipiente.
Inclinar a lmina, gotejar lcool etlico a 95% at que no haja
desprendimento de corante.
Lavar a lmina rapidamente em gua corrente.
Cobrir com fucsina ou safranina. Aguardar 30 segundos e lavar a lmina. Secar
com papel toalha sem esfregar a lmina.
Observar ao microscpio em menor aumento e, a seguir, colocar 1 gota de
leo mineral na lmina e focalizar com objetiva de imerso.
Desenhar as bactrias observadas considerando o tipo de colorao (Gram +
ou -), a forma e o arranjo das clulas.
Aps o uso, a objetiva de imerso deve ser limpa com papel absorvente.

Material

Morfologia

Arranjo

Gram

Cultura em
placa
Material a
boca

***Completar o Anexo 1

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Anexo 1: TABELA DE IDENTIFICAO MACROMORFOLGICA

DOS FUNGOS
1- Miclio ( aspecto macroscpico ):
( ) leveduriforme (levedura) ( ) filamentoso (bolor)
( ) areo ( o que se projeta acima do meio de cultura) ( ) rasteiro (o que cresce
sobre ou abaixo do meio de cultura)
2- Cor da colnia: .........................................................................
3- Presena de pigmento: ( reverso da colnia - verso da placa)
..............................................................
4- Bordos: ( ) inteiro ( ) franjado ( ) liso
( ) ondulado ( ) encrespado ( ) arredondado
5- Superfcie: ( ) lisa ( ) rugosa ( ) cerebriforme ( ) coricea ( ) algodonosa
( ) mucide ( ) cremosa ( ) concntrica ( ) opaca ( ) aveludada
( ) brilhante ( ) pulverulenta ( ) pastosa
6- Sulcos: ( ) presentes ( ) ausentes
7- Tipo: ( ) seca ( ) mida
8- Protuberncia central: ( ) presente ( ) ausente
9- Elevao: ( ) achatada ( ) levantada ( ) amontoada
10- Reverso da colnia:
.............................................................................................................................
11- Morfologia colonial final aps a identificao:
...................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
OBS: Esta tabela tem por finalidade orient-lo na verificao das principais
caractersticas macromorfolgicas que devero ser observadas. Entretanto,
no significa que a colnia que voc deseja identificar tenha todos os itens
descritos acima, e alm disto, para cada item poder ser observada mais de
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uma caracterstica. (por exemplo: a superfcie de uma colnia poder ser ao

mesmo tempo: lisa, pastosa e brilhante).

Princpios Bsicos da Microscopia ptica

MANEJO DO MICROSCPIO

1. Acender a lmpada do sistema de iluminao.

2. Abrir totalmente o diafragma e colocar o sistema condensador - diafragma na posio mais
elevada, pois aquela que permite melhor iluminao.
3. Movimentar o revlver, colocando em posio a
objetiva de menor aumento (4X).
4. Tomar a lmina com a lamnula para cima e coloc-la
na platina, prendendo-a com os grampos.
5. Movimentar o charriot, fazendo com que o preparado
fique em baixo da objetiva.
6. Com o parafuso macromtrico, elevar a platina ao
mximo, observando que a objetiva no toque na
lamnula, pois poder quebr-la.
7. Focalizar a preparao para a obteno de uma
imagem ntida, movimentando o parafuso macromtrico e
abaixando a platina at que se possa visualizar a
imagem.
8. Aperfeioar o foco com o parafuso micromtrico.
9. Colocar a regio do preparado que se quer ver com
maior aumento bem no centro do campo visual da lente.
10. Movimentar o revlver, colocando em posio a
objetiva de 10X (aumento mdio).
11. Repetir o procedimento do item 6.
12. Para focalizar a nova imagem, repetir o procedimento
do item 7.
13. Repetir o item 8.
14. Repetir o item 9.
15. Colocar a objetiva de 40X (maior aumento) em posio e repetir os itens 6, 7 e 8.
16. A objetiva de 100X chamada de imerso e seu uso ser explicado posteriormente.