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Belo Horizonte
2014
UFMF/ICEx/DQ 1016
D 554
Dissertao
Qumica
apresentada
do
Instituto
de
ao
Departamento
Cincias
Exatas
de
da
como
Belo Horizonte
2014
ii
iii
iv
AGRADECIMENTOS
vi
RESUMO
vii
ABSTRACT
The sweet sorghum juice is gaining importance as a raw material for the first
generation ethanol production in the period between harvests of sugar cane. Furthermore,
there is a great expectation on the use of sorghum bagasse for the lignocellulosic ethanol
production, since this culture has a high yield of biomass per hectare and low production
costs. Consequently, breeding programs are seeking to improve this raw material quality in
order to increase productivity. This practice has generated an excessive number of samples to
be analyzed. Thus, the aim of this study was to develop rapid and low cost methods based on
multivariate calibration and near infrared spectroscopy for the determination of quality
parameters of sweet sorghum biomass (cellulose, hemicellulose and lignin) and juice (brix,
saccharimetric reading, reducing sugars, pol and apparent purity), besides the estimate of the
theoretical ethanol yield (TEY) based on cell wall components (cellulose and hemicellulose).
The biomass models were built using 957 samples, obtained from over 100 different
genotypes, in the ranges of 21.4 to 49.1% w/w, 18.4 to 34.8% w/w, 221 to 412 Lt-1 and 1.8 to
11.5% w/w for cellulose, hemicellulose, lignin and TEY, respectively. The juice models were
built with 500 samples, part of them from 275 contrasting strains for quality and for amount
of sugars in the juice, in the ranges of 5.5 to 18.1 B for brix, 1.1 to 53.2 Z for saccharimetric
reading, 1.2 to 5.2 % w/v for reducing sugars, 0.3 to 13.0 % w/v for pol and 9.8 to 83.0% w/v
for apparent purity. Finally, a complete multivariate analytical validation was carried out in
accordance with the Brazilian and international guidelines, and the methods were considered
accurate, linear, sensitive and unbiased.
Key words: NIRS, multivariate calibration, biofuels
viii
SUMRIO
AGRADECIMENTOS .......................................................................................................... vi
RESUMO ............................................................................................................................ vii
ABSTRACT ....................................................................................................................... viii
SUMRIO............................................................................................................................ ix
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... xi
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .......................................................................... xiv
1 - INTRODUO ................................................................................................................ 1
1.1 Bioenergia e Bioetanol ................................................................................................. 1
1.2 Sorgo sacarino .............................................................................................................. 4
2 - MOTIVAO .................................................................................................................. 7
2.1 Programas de melhoramento gentico do sorgo sacarino .............................................. 7
2.2 Parmetros de qualidade e metodologias convencionais................................................ 8
2.2.1Caracterizao do caldo de sorgo sacarino .............................................................. 8
2.2.1.1 Brix ................................................................................................................ 8
2.2.1.2 Pol e leitura sacarimtrica ............................................................................... 9
2.2.1.3 Acares redutores.......................................................................................... 9
2.2.1.4 Pureza aparente do caldo ............................................................................... 11
2.2.2 Caracterizao da biomassa de sorgo sacarino ..................................................... 11
2.2.2.1 FDN.............................................................................................................. 12
2.2.2.2 FDA.............................................................................................................. 12
2.2.2.3 Lignina ......................................................................................................... 13
2.2.2.4 Celulose ........................................................................................................ 14
2.2.2.5 Hemicelulose ................................................................................................ 15
2.2.2.6 Rendimento Terico de Etanol (RTE) ........................................................... 16
3 - REFERENCIAL TERICO ........................................................................................... 18
3.1 Espectroscopia no infravermelho prximo NIRS ..................................................... 18
3.2 Quimiometria e calibrao multivariada ..................................................................... 25
3.2.1 Definio dos termos ........................................................................................... 25
3.2.2 Mtodos de calibrao multivariada ..................................................................... 27
3.2.3 Regresso por mnimos quadrados parciais .......................................................... 28
3.2.4 Deteco de amostras anmalas Outliers........................................................... 30
3.3 Validao de modelos multivariados e figuras de mrito............................................. 33
3.3.1 Veracidade .......................................................................................................... 34
3.3.2 Preciso ............................................................................................................... 34
3.3.3 Linearidade .......................................................................................................... 35
3.3.4 Sensibilidade ....................................................................................................... 38
ix
LISTA DE FIGURAS
xi
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Resultados para a otimizao dos modelos PLS da biomassa (resultados finais em
negrito) atravs das etapas de deteco de outliers........................................................ 62
Tabela 2 Resultados para a otimizao dos modelos PLS do caldo (resultados finais em
negrito) atravs das etapas de deteco de outliers........................................................ 62
Tabela 3 Parmetros para a avaliao das principais FdM dos mtodos NIRS desenvolvidos
para a determinao de celulose, hemicelulose, RTE e lignina em biomassa de sorgo
sacarino ........................................................................................................................ 75
Tabela 4 Parmetros para a avaliao das principais FdM dos mtodos NIRS desenvolvidos
para a determinao de brix, leitura sacarimtrica, acares redutores, pol e pureza
aparente (Q) nas amostras de caldo de sorgo sacarino ................................................... 76
Tabela 5 Parmetros dos testes estatsticos usados na avaliao das cartas de controle
desenvolvidas para o monitoramento dos modelos NIRS .............................................. 80
xiii
ASTM
BAG
BF
DP
Desvio Padro
DPR
DSG
DW
FDA
FDN
FdM
Figuras de Mrito
FT-NIR
INMETRO
IUPAC
MAPA
MLR
MSC
Correo de
Correction)
NAS
NIRS
PCR
PLS
PMGS
RIL
RJ
RMSEC
Espalhamento
Multiplicativo
(Multiplicative
Scatter
xiv
RMSECV
RMSEP
RPD
RTE
SDV
SEL
Seletividade
SEN
Sensibilidade
SNV
VL
Variveis Latentes
xv
1 - INTRODUO
1.1 Bioenergia e Bioetanol
O petrleo, principal fonte de energia do mundo moderno, alcanou posio de
destaque durante dcadas graas ao seu preo relativamente baixo e s facilidades de
exportao e transporte do mesmo. Entretanto, a diminuio das reservas desse material fssil
e a elevao dos custos para sua obteno, aliadas crescente preocupao com a preservao
ambiental, vm exigindo solues tecnolgicas imediatas para a substituio dessa fonte de
energia1. Tais solues se baseiam na utilizao de algumas fontes alternativas que permitam
realizar em longo prazo e, com limitados impactos econmicos, a transio para uma nova era
de energias mais limpas e renovveis2. Nesse sentido, bastante intuitivo pensar em produzilas com base em matria orgnica renovvel a chamada bioenergia.
A bioenergia representa uma das melhores alternativas para captar e armazenar a
energia solar sempre que haja terras livres para cultivo, clima adequado e conhecimento
suficiente para aplic-la. A energia solar na forma de biocombustvel, produzido com
eficincia e sustentabilidade, capaz de atender s urgentes demandas para reduzir as
emisses de gases de efeito estufa, melhorar a qualidade do ar nas metrpoles e competir em
preo com as energias convencionais3. A principal diferena entre os biocombustveis e os
combustveis fsseis, do ponto de vista de emisses, que os combustveis derivados de
petrleo utilizam para a combusto o carbono das molculas que estava estocado h milhes
de anos nas jazidas petrolferas, emitindo dixido de carbono para a atmosfera, em um ciclo
semiaberto, alterando sua composio qumica. No caso dos biocombustveis, o ciclo de
carbono fechado, ou seja, todo o carbono emitido para atmosfera durante a combusto
reabsorvido no ciclo seguinte, para produo da mesma quantidade de biocombustvel4. Alm
disso, o teor de oxignio nos biocombustveis mais elevado, o que possibilita uma
1
passa por um processo de hidrlise (cida ou enzimtica), antes da fermentao, para que os
polissacardeos sejam quebrados em acares fermentveis. A Fig. 2 mostra as snteses das
rotas tecnolgicas de obteno de cada um deles3.
Materiais
aucarados
Materiais
amilceos
lignocelulsicos
Extrao por
presso
Triturao
Triturao
Hidrlise
enzimtica
Hidrlise
cida ou
enzimtica
Materiais
2 - MOTIVAO
2.1 Programas de melhoramento gentico do sorgo sacarino
A utilizao de sorgo sacarino para a produo de etanol de primeira e de segunda
gerao tem sido amplamente estudada pelo Programa de Melhoramento Gentico de Sorgo
(PMGS) da Embrapa. O desenvolvimento de novas variedades e hbridos dessa matria-prima
vem sendo realizado com o objetivo de aumentar a capacidade de produo do lcool18. Alm
disso, a reduo dos custos de obteno de etanol pode ser alcanada atravs da melhoria da
qualidade da matria-prima19.
Em um programa de melhoramento gentico o ponto de partida o banco de
germoplasma, que rene milhares de gentipos. Depois de serem obtidas por cruzamentos
especficos definidos pelos pesquisadores, as sementes so enviadas s estaes experimentais
onde so plantadas. As plantas passam, ento, por uma fase de seleo para a definio dos
materiais com as caractersticas desejadas, por exemplo, maiores teores de acares no caldo e
composio adequada da biomassa, um trabalho que feito em conjunto com mtodos
biotecnolgicos avanados. nessa etapa do processo que as amostras devem ser
caracterizadas em laboratrio, pois, a matria-prima precisa ser submetida a um controle de
qualidade para garantir uma produo com maior rendimento e, portanto, com maior
eficincia.
Devido similaridade de composio, os mtodos analticos utilizados para avaliar os
parmetros de qualidade do caldo de cana-de-acar podem servir para a avaliao do caldo
de sorgo18. Os parmetros mais utilizados nessa avaliao so: teor de slidos solveis (brix),
sacarose (leitura sacarimtrica, pol e pureza aparente), e acares redutores (glicose e frutose).
Da mesma maneira, as metodologias e os parmetros de qualidade empregados para avaliar a
biomassa da cana-de-acar podem ser estendidos para o bagao do sorgo sacarino utilizado
7
ou seja, mede o teor de sacarose em solues puras21. A sua determinao quantitativa pode
ser realizada atravs de refratmetros nos quais o ndice de refrao do caldo extrado
medido em escala brix (B). Por definio, 1 B corresponde a 1 grama de sacarose em 100 g
de soluo aquosa. No entanto, para o caldo de sorgo, assim como para o caldo de cana, ele
representa a estimativa do teor de sacarose tendo em vista as demais impurezas presentes.
Este parmetro no fornece qualquer informao qualitativa acerca dos acares presentes.
2.2.1.2 Pol e leitura sacarimtrica
Pol (S) a medida da quantidade de sacarose na mistura de acares21,22. O clculo do
pol feito atravs da determinao do grau de polarizao da amostra. Essa medida, chamada
de leitura sacarimtrica (Z), realizada em um polarmetro (sacarmetro) aps a
clarificao do caldo com uma mistura base de alumnio.
A equao completa para o clculo do pol a seguinte22:
S(% do caldo) = (1,00621 x LAl + 0,05117) x (0,2605 - 0,0009882 x B)
(Eq. 1)
na qual LAl a leitura sacarimtrica obtida com a mistura clarificante base de alumnio
(Z) e B o brix do caldo (B).
2.2.1.3 Acares redutores
Os acares redutores (glicose e frutose) podem ser avaliados por uma titulao de
oxirreduo. O mtodo mais comum, o de Lane-Eynon23, baseia-se no fato de que os sais
cpricos, em soluo tartrica alcalina (soluo de Fehling), podem ser reduzidos a quente por
aldoses ou cetoses transformando-se em sais cuprosos, que se precipitam, conforme mostrado
na Fig. 5.
(Eq. 2)
(Eq. 3)
11
Detergente neutro
Detergente cido
no teor de FDA. Esta fibra composta basicamente de lignina, celulose e slica. Uma vez
determinados os teores de FDA e de lignina, efetua-se a incinerao do resduo da lignina. A
celulose corresponde parte do resduo que se perde com a incinerao. O que sobra,
corresponde cinza residual, que contm slica. A celulose ento calculada por diferena de
peso29.
2.2.2.5 Hemicelulose
A hemicelulose um heteropolmero que possui muitas ramificaes contendo
diferentes carboidratos, como xilose, arabinose, manose, galactose, glicose, assim como
cidos urnicos24. Dependendo da predominncia do tipo de acar as hemiceluloses podem
ser chamadas de arabino-xilanas, mananas, glucanas ou galactanas. Esses acares contm
cinco (pentoses) ou seis (hexoses) carbonos em sua estrutura e so unidos por ligaes
glicosdicas quase sempre acetiladas, formando uma estrutura fraca e hidroflica que serve
como uma conexo entre a lignina e as fibras de celulose, alm de conferir rigidez ao
complexo celulose-hemicelulose-lignina. Comparadas com a celulose, as hemiceluloses
apresentam maior susceptibilidade hidrlise cida, pois oferecem uma maior acessibilidade
aos cidos minerais comumente utilizados como catalisadores. Esta reatividade usualmente
atribuda ao carter amorfo destes polissacardeos24. Na Fig. 9 est representada uma
molcula de hemicelulose. A proporo de hemicelulose determinada atravs de clculos
pela diferena entre os teores de FDN e FDA.
(Eq. 4)
16
17
3 - REFERENCIAL TERICO
3.1 Espectroscopia no infravermelho prximo NIRS33-37
Uma alternativa analtica para superar as desvantagens das metodologias tradicionais
o uso da espectroscopia no infravermelho prximo, NIRS (Near Infrared Spectroscopy)
combinada com mtodos de calibrao multivariada. Esta tcnica possibilita a determinao
simultnea de vrias propriedades (ou concentraes de vrios analitos) de uma amostra
usando uma nica medida instrumental sem a necessidade de uma separao fsica dos
componentes. Como consequncia, ela apresenta baixo consumo de reagentes, pouca
manipulao de amostras e alta velocidade de anlise, o que pode ser crucial no mundo real,
onde qualquer atraso na obteno de resultados analticos pode resultar em significantes
perdas tanto de qualidade quanto financeiras. Com a utilizao deste tipo de tcnica, reagentes
potencialmente perigosos so evitados e claros benefcios sade dos operadores e ao
ambiente so alcanados. Alm disso, h considervel reduo de custos com tratamento de
resduos qumicos.
A espectroscopia no infravermelho prximo uma tcnica vibracional que durante as
ltimas duas dcadas tem feito progressos evidentes em suas aplicaes em diversas reas da
cincia38-40. A radiao NIR emprega ftons de energia (h) na faixa de 2,65 x 10 -19 a 7,96 x
10-20 J, o que corresponde faixa de comprimento de onda de 750 a 2.500 nm (nmeros de
onda de 13.330 a 4.000 cm-1) do espectro eletromagntico. Esta faixa de energia suficiente
apenas para promover a vibrao molecular. temperatura ambiente a maioria das molculas
est em seus nveis de energia do estado vibracional fundamental. tomos ou grupos de
tomos participantes das ligaes qumicas esto se deslocando uns em relao aos outros em
uma frequncia que definida pela fora das ligaes e pela massa dos tomos individuais ou
grupos de tomos ligados. A amplitude dessas vibraes de poucos nanmetros e aumenta
18
se alguma energia transferida para a molcula. Esta energia (E) pode ser transferida na
forma de um fton de dado comprimento de onda () e pode ser dada por:
E = h = hc/
(Eq. 5)
(Eq. 6)
em que k a constante de fora da ligao e a massa reduzida dos dois tomos de massas
m1 e m2, definida como:
20
(Eq. 7)
A vibrao molecular pode ser descrita por um modelo simplificado no qual a energia
potencial (E) dada como funo da separao entre os tomos (y):
(Eq. 8)
Este modelo til para o entendimento de energia vibracional e funciona bem para o
clculo de frequncias fundamentais de molculas diatmicas simples. Contudo, essa
aproximao fornece apenas a mdia ou a frequncia central de transies de estados
vibracionais e rotacionais de ligaes diatmicas. Em molculas poliatmicas os eltrons
sofrem influncia de tomos ou grupos vizinhos e isso influencia o estiramento, o
comprimento da ligao, o ngulo da ligao e, consequentemente, a frequncia da vibrao
das ligaes qumicas. Estas diferenas especficas, que ocorrem devido a essas interaes,
proporcionam que cada substncia apresente um espectro caracterstico.
Para representar as diferenas citadas um modelo harmnico/quntico pode ser
utilizado. Para a mecnica quntica as vibraes moleculares podem ter apenas determinados
nveis de energia discretos definidos como:
(Eq. 9)
em que h a constante de Planck e o nmero quntico vibracional, que pode assumir
valores positivos e inteiros incluindo o zero. Para molculas poliatmicas, os nveis de
energia se tornam numerosos e uma aproximao pode tratar essas molculas como uma srie
de osciladores harmnicos diatmicos e independentes. Nesse caso, a equao para a energia
potencial pode ser generalizada como:
(Eq. 10)
21
em que 3N-6 o nmero de vibraes possveis em uma molcula com N tomos (para
molculas lineares existem 3N-5 vibraes possveis), m a frequncia vibracional do
modelo clssico e 1, 2, ...= 0, 1, 2, ...16.
Uma restrio imposta pelo modelo harmnico que somente transies fundamentais
poderiam existir, sendo esta restrio denominada de regra de seleo (= 1). Uma vez que
os nveis vibracionais so igualmente espaados, apenas um nico pico de absoro deveria
ser observado para uma certa vibrao molecular. Apesar de o modelo harmnico ajudar no
entendimento da espectroscopia vibracional, ele apresenta algumas restries por no permitir
transies nas quais maior que 1. Transies com 2 so proibidas pelo modelo
harmnico e, neste caso, muitos dos fenmenos observados no espectro vibracional - bandas
de sobretons no poderiam existir. Alm disso, as vibraes no modelo harmnico so
independentes e suas combinaes no existiriam sob as restries impostas pelo modelo. No
entanto, tanto bandas de sobretons quanto de combinao existem. Outra limitao
apresentada por esse modelo que medida que dois tomos se aproximam, a repulso
coulombiana entre os dois ncleos produz uma fora que age na mesma direo da fora de
restaurao da ligao. Assim, espera-se que a energia potencial cresa mais rapidamente do
que previsto pelo modelo do oscilador harmnico. Por outro lado, quando a distncia entre
os tomos aumenta, um decrscimo na fora de restaurao e, portanto, na energia potencial,
ocorre quando a distncia interatmica se aproxima daquela em que ocorre a dissociao dos
tomos.
Um modelo mecnico mais realstico para molculas diatmicas pode ser visto na Fig.
11b. A molcula ainda aproximada por duas massas ligadas por uma mola. No entanto, o
modelo considera um comportamento no ideal do oscilador, que leva em conta a repulso
entre as nuvens eletrnicas quando os ncleos dos tomos se aproximam; e um
comportamento varivel da fora da ligao quando os tomos se afastam uns dos outros. De
22
fato, em uma molcula real, o excesso de afastamento dos ncleos atmicos ir causar ruptura
da ligao molecular com consequente dissociao dos tomos. O modelo anarmnico
tambm impe algumas restries aos estados de energias possveis das molculas.
Entretanto, ele prediz a ocorrncia das transies com 2 e a existncia de bandas de
combinao entre as vibraes. Sob as suposies do modelo anarmnico, as vibraes no
so independentes e podem interagir umas com as outras.
Figura 11 Representao esquemtica dos modelos harmnico (A) e anarmnico (B) para a
energia potencial de molculas diatmicas33. de = distncia de equilbrio
O espectro NIR pode ser dividido em regio I (12500 8333 cm-1), regio II (83335555 cm-1) e regio III (5555-4000 cm-1). Os limites dessas trs regies no so muito
rigorosos. A regio I aquela na qual tanto bandas de combinao quanto de sobretons so
observadas. Todas as bandas que aparecem nessa regio so muito fracas, o que significa que
ela mostra alta transparncia. Um grande nmero de aplicaes biomdicas e de produtos
agrcolas realizado nesta regio. Na regio II, podem ser observadas bandas resultantes do
primeiro sobretom de estiramento vibracional de X-H (X=C, O, N) e vrios tipos de modos de
combinao de vibraes X-H. A regio III a dos modos de combinao cuja
permeabilidade mais pobre. Uma ampla gama de aplicaes, tais como: estudos sobre
ligaes de hidrognio e interaes solvente-soluto usa as regio II e regio III.
Por se tratar de uma tcnica vibracional, a maioria das vantagens da espectroscopia
NIR advm da possibilidade de utilizao de amostras intactas apresentadas diretamente ao
23
24
muitos artigos tm sido publicados usando NIRS para caracterizar matrias-primas usadas
para a produo de biocombustveis, tais como palha de milho41, gramneas43 e gros de
cereais44. Apenas um artigo tratou do uso do NIRS para a determinao de trs propriedades
do bagao de sorgo: poder calorfico, digestibilidade in vitro e protena bruta45. Mais
importante para os objetivos dos programas de melhoramento gentico de plantas, focados em
biocombustveis, alguns artigos tm recentemente usado NIRS para predizer o rendimento de
etanol apartir de gramneas (Panicum virgatum)43, de cereais como trigo, centeio e triticale44,
beterraba46 e milho47. Em todos eles o rendimento de etanol foi medido por HPLC aps as
amostras terem sido submetidas a um processo de fermentao.
Com relao s amostras lquidas, alguns trabalhos utilizando NIRS na predio de
brix48, pH48, acares49,50 e outros parmetros51 de qualidade em sucos de frutas j foram
descritos. A utilizao de NIRS na predio de alguns parmetros de qualidade do caldo de
cana-de-acar como pol52, brix52,53 e acares redutores52, tambm j foi relatada.
preciso destacar que os benefcios dessa tcnica no podem ser considerados como
totalmente explorados sem o uso da quimiometria, que permite a seleo de procedimentos de
medidas timos e a extrao da mxima informao qumica a partir dos dados espectrais.
(Eq. 11)
26
(Eq. 12)
(Eq.13)
28
(Eq. 14)
Y = UQt + F
(Eq. 15)
(Eq. 16)
VL dos blocos de X e Y. Os valores previstos para as novas amostras () podem ser ento
calculados de acordo com a equao 17, com base nos novos escores T*.
= T*Bq
(Eq.17)
construdos. Outliers incluem amostras com alta influncia, amostras cujos valores de
referncia so inconsistentes com o modelo e/ou amostras cujos espectros apresentam alguma
anomalia em relao ao conjunto de dados.
Erros e fenmenos inesperados so inevitveis na construo de um modelo de
calibrao e podem ser causados por diversos motivos como, por exemplo, erros do operador,
rudos nos dados, problemas instrumentais e amostras com caractersticas muito distintas das
demais. A presena de amostras anmalas no conjunto de calibrao pode conduzir a modelos
com baixa capacidade de previso. Quando presentes no conjunto de validao, elas podem
influenciar os resultados levando a estimativas que indicam que o modelo no adequado ou
que a sua capacidade inferior que poderia ser apresentada na ausncia destas amostras
anmalas. Assim, a identificao de anomalias um passo importante para a otimizao dos
conjuntos de calibrao e validao, sendo que, a excluso dos outliers permite a construo
de modelos mais eficientes, precisos e com melhor capacidade de previso.
Os outliers na calibrao so, usualmente, avaliados com base no leverage (h)
extremo, resduos no modelados nos dados espectrais (X) e resduos no modelados nas
variveis dependentes (Y). O leverage representa o quanto uma amostra est distante da
mdia do conjunto de dados, ou seja, o peso relativo de uma amostra em relao s demais
presentes em um mesmo conjunto. De acordo com a ASTM E1655-0557, amostras com h >
(3A + 1)/n, onde n corresponde ao nmero de amostras da calibrao, devem ser removidas
do conjunto de calibrao, e o modelo deve ento ser reconstrudo.
A identificao de anomalias em relao aos resduos no modelados nos dados
espectrais obtida por comparao do desvio padro residual total (s()), definido como:
(Eq. 18)
31
(Eq. 19)
Se uma amostra apresentar s(i)>2s(), esta removida do conjunto de calibrao.
Com relao aos resduos no modelados na varivel dependente, os outliers so
identificados atravs da comparao da raiz quadrada do erro mdio da calibrao (RMSEC)
com o erro absoluto daquela amostra. Se a amostra apresentar erro absoluto maior do que
(3xRMSEC), esta definida como um outlier. O RMSEC determinado como:
(Eq. 20)
em que, yi o valor de referncia e i o valor estimado.
comum a contnua deteco de outliers aps a reconstruo do modelo. Quando
aplicaes repetidas dos testes continuam a identificar outliers, um fenmeno conhecido
como snowball (do ingls, efeito bola de neve) pode estar acontecendo. Este fenmeno
indica que h algum problema com a estrutura dos dados espectrais. Para evitar este
problema, no mais do que trs rodadas de deteco de outliers (4 modelos) devem ser
realizadas.
No conjunto de validao as amostras anmalas podem ser identificadas atravs do
teste de resduos Jacknife (Jei)62. Atravs desse teste estatstico os outliers so detectados de
acordo com a equao 21:
(Eq. 21)
32
33
(Eq. 22)
em que, nv o nmero de amostras do conjunto de validao. importante tambm, na
avaliao da veracidade, que seja conhecida a faixa de erros relativos de predio para as
amostras individuais76.
3.3.2 Preciso
A avaliao da preciso realizada da mesma forma que nos modelos univariados. De
acordo com a norma ASTM E 1655-0557 a preciso dos valores estimados a partir de um
modelo multivariado NIR deve ser calculada pela medida repetida dos espectros. Para a
determinao da preciso em nvel de repetitividade os espectros de, pelo menos, trs
amostras, com seis replicatas de cada, devem ser coletados no mesmo dia em trs nveis de
concentrao, cobrindo a faixa til do modelo. O clculo realizado utilizando-se a equao
2378. Para a determinao da preciso intermediria devem ser avaliadas as circunstncias nas
34
quais o mtodo ser aplicado e assim proceder variao de dia, nmero de analistas e
laboratrios para a anlise das replicatas.
(Eq. 23)
Em que n o nmero de amostras utilizadas no clculo da preciso, m o nmero de
replicatas de n e corresponde aos valores preditos pelo modelo.
3.3.3 Linearidade
De acordo com a definio do INMETRO77, linearidade a habilidade de um mtodo
analtico em produzir resultados que sejam diretamente proporcionais concentrao do
analito em amostras, em uma dada faixa de concentrao. Normalmente, a linearidade pode
ser inferida pela observao de parmetros como o coeficiente de regresso b, o intercepto
a e o coeficiente de correlao r de uma reta. No entanto, considera-se que um valor de r
prximo de 1 no suficiente para demonstrar a linearidade, pois deve-se tambm assegurar a
aleatoriedade dos resduos. Em calibrao multivariada, deve-se analisar a curva dos valores
de referncia versus valores previstos (Anexos A e B) e/ou o grfico dos resduos para as
amostras de calibrao e validao, que podem indicar se a distribuio residual tem um
comportamento aleatrio78. No entanto, a observao da aleatoriedade dos resduos atravs
dos grficos subjetiva e deve ser confirmada atravs de testes estatsticos apropriados 62.
A normalidade dos resduos deve ser avaliada atravs do teste de Ryan-Joiner (RJ), no
qual os resduos (ei) so ordenados de forma crescente e plotados contra a porcentagem de
pontos correspondentes (qi) a partir da distribuio normal padro (grfico quantil-quantil),
conforme mostrado na Fig. 14. Caso os resduos tenham comportamento normal, os dados
devem se aproximar do ajuste de uma linha reta. Caso eles sigam uma distribuio alternativa,
35
o grfico exibe algum grau de curvatura. O coeficiente de correlao (Req) para os dados
normalmente distribudos , ento, comparado com os valores de R crtico calculados, para a
rejeio ou aceitao da hiptese nula de normalidade. Os resduos podem ser considerados
normalmente distribudos se Req Rcrtico.
Figura 14 Distribuio residual normal. Dados se aproximam do ajuste de uma linha reta
O teste Brown-Forsythe (BF), ou Levene modificado, deve ser usado na avaliao da
homocedastidade dos resduos, ou seja, a variao absoluta constante de todos os pontos da
faixa de trabalho. Para este teste, os resduos devem ser divididos em dois grupos de tamanho
n1 e n2, respectivamente, com relao aos valores da faixa de trabalho, ou seja, os resduos
correspondentes aos valores da metade inferior da faixa ficam no grupo 1 e os resduos
correspondentes metade superior da faixa ficam no grupo 2. As medianas (1 e 2) de cada
grupo so, ento, calculadas. Em seguida, os valores absolutos das diferenas entre os
resduos e as medianas de cada grupo di1=|ei 1| e di2=|ei 2| devem ser calculados. Por
fim, a soma dos desvios quadrados de dj (SSD1 e SSD2) de cada grupo devem ser estimadas.
A estatstica de t L (t de Levene) avaliada pela equao 24:
Eq. 24
36
na qual
a mdia de dij de cada grupo, nj o nmero de amostras de cada grupo e s2p= SSD1
Eq. 25
A ausncia de autocorrelao verificada atravs da comparao entre os desvios
padro dos resduos ordenados (denominador da Eq. 25) e das diferenas sucessivas desses
mesmos resduos (numerador dessa equao), conforme mostrado na Fig. 15. Para cada
conjunto de dados, existem dois limites para d (dL o limite inferior e dU o limite superior).
Se o valor de d estimado para um conjunto de dados estiver fora destes limites, o teste
inconclusivo ou existe autocorrelao (pode-se tambm calcular limites para estas duas
situaes). Os valores de DW variam de 0 a 4 com mdia 2. Se o valor calculado convergir
para 2 significa que no h autocorrelao.
37
3.3.4 Sensibilidade
A sensibilidade (SEN) um parmetro que demonstra a variao da resposta em
funo da concentrao do analito 77. A SEN pode ser considerada como a mudana na
resposta lquida do instrumento dividida pela correspondente mudana no estmulo (a
concentrao do analito de interesse). Ela ainda definida como a inclinao (coeficiente
angular) em uma curva de calibrao 78. Suas dimenses so unidade de sinal x concentrao -1.
Para modelos de calibrao multivariada inversa, como PLS, a SEN pode ser estimada por:
(Eq. 26)
em que b o vetor dos coeficientes de regresso estimados pelo modelo PLS e "|| ||" indica a
norma euclidiana de um vetor.
3.3.5 Sensibilidade analtica
Como a SEN depende da tcnica analtica empregada, uma FdM mais til a
sensibilidade analtica (). Este parmetro, definido na equao 26, a razo entre a SEN e o
rudo instrumental (x), o qual em NIRS estimado como o desvio padro de vrias medidas
do acessrio de medida vazio.
(Eq. 27)
O inverso desse parmetro (-1) permite estabelecer a menor diferena de concentrao entre
amostras, a qual pode ser distinguida pelo mtodo, considerando o rudo instrumental como
nica fonte significativa de erro. Este parmetro tambm define o nmero de casas decimais e
algarismos significativos que devem ser usados para expressar os resultados de predio.
38
3.3.6 Seletividade
A seletividade (SEL) a capacidade de determinar uma espcie de interesse em
amostras na presena de interferentes78, ou seja, a medida do grau de sobreposio entre o
sinal da espcie de interesse e os interferentes presentes na amostra. Logo, a SEL indica a
parte do sinal que perdida por essa sobreposio 67. Para modelos de calibrao multivariada
esse parmetro definido como:
(Eq. 28)
Em que nsi o escalar NAS (Sinal Analtico Lquido - Net Analyte Signal)79 estimado
para a amostra i e xi o vetor de dados original.
Para mtodos univariados o requisito de 100 % de SEL usual, mas para mtodos
multivariados no existe interesse prtico em estabelecer um valor mnimo. Diferentemente
de mtodos univariados, baixos valores de SEL podem ser obtidos mesmo para mtodos
multivariados exatos.
3.3.7 Faixa de trabalho
A faixa de trabalho corresponde ao intervalo de massas ou concentraes para o qual
se pode afirmar que o mtodo fornece um grau aceitvel de exatido e linearidade.
3.3.8 Vis (teste para erro sistemtico Bias)57,67
De acordo com a IUPAC, o vis definido como a diferena entre a mdia
populacional e o seu valor verdadeiro. Erros sistemticos, ou seja, todos os componentes do
erro que no so aleatrios correspondem parcela fixa do vis em uma medida qumica. A
existncia desse tipo de erro afeta a preciso, a veracidade e a determinao dos intervalos de
confiana. A norma E1655-05 da ASTM57 sugere um teste t para avaliar se o vis incluso no
39
modelo significante, usando somente as amostras de validao. O vis mdio pode ser
calculado como:
(Eq. 29)
Em seguida, o desvio padro dos erros de validao (SDV, standard deviation of validation)
determinado por:
(Eq. 30)
O valor de t ento obtido:
(Eq. 31)
Caso o valor de t calculado seja menor que o seu valor crtico para graus de liberdade e 95%
de confiana, o vis includo no modelo pode ser considerado insignificante e desprezado.
3.3.9 Relao de Desempenho do Desvio, RPD (Residual Prediction Deviation)80
O RPD uma FdM mais recente, utilizada para estimar a capacidade preditiva dos
mtodos e mais adequada para comparaes em termos absolutos. A RPD estimada para os
conjuntos de calibrao e validao de acordo com as equaes 31 e 32, nas quais DPCal e
DPVal so os desvios padres dos valores de referncia dos conjuntos de calibrao e
validao, respectivamente.
(Eq. 32)
(Eq. 33)
40
Bons modelos de calibrao devem possuir um valor de RPD acima de 2,4, enquanto valores
entre 2,4 e 1,5 so considerados satisfatrios. Modelos com RPD menor que 1,5 no devem
ser utilizados.
41
4 - OBJETIVOS
O objetivo principal desse trabalho o desenvolvimento de metodologias rpidas,
limpas, confiveis e de baixo custo para a caracterizao da biomassa e do caldo do sorgo
sacarino com o intuito de otimizar a pesquisa do PMGS da Embrapa Milho e Sorgo (Sete
Lagoas-MG). Para alcanar tal objetivo foram seguidos os seguintes passos:
- A construo de modelos de calibrao multivariada empregando o mtodo de regresso por
PLS para a determinao da composio (celulose, hemicelulose, lignina) da biomassa do
sorgo sacarino utilizando espectroscopia no infravermelho prximo.
- A construo de modelos de calibrao multivariada empregando o mtodo de regresso por
PLS para a determinao do RTE obtido a partir de cada cultivar de sorgo sacarino
desenvolvido pelo PMGS da Embrapa utilizando espectroscopia no infravermelho prximo.
- A construo de modelos de calibrao multivariada empregando o mtodo de regresso por
PLS para a determinao de parmetros de qualidade (brix, leitura sacarimtrica, acares
redutores, pol e pureza aparente) no caldo do sorgo sacarino utilizando espectroscopia no
infravermelho prximo.
- A validao dos modelos de calibrao multivariada pela determinao das FdM.
42
5 - PARTE EXPERIMENTAL
5.1 Amostras
Tanto as amostras de biomassa quanto as amostras de caldo analisadas neste estudo
foram de diferentes gentipos de sorgo sacarino, dentre as quais algumas foram obtidas do
PMGS e outras foram provenientes do Banco Ativo de Germoplasma (BAG), ambos
pertencentes ao Centro Nacional de Pesquisas de Milho e Sorgo da Embrapa em Sete Lagoas,
MG, Brasil.
Biomassa
Para a caracterizao da biomassa foram conduzidos trs ensaios nos campos
experimentais da Embrapa em Sete Lagoas, entre 2010 e 2013, a partir dos quais trs painis
de diversidade gentica foram montados. Alm disso, com o intuito de aumentar a
variabilidade incorporada nos modelos de calibrao, amostras oriundas de testes de
maturao foram includas. Estas amostras foram coletadas desde o incio do
desenvolvimento da planta at o ltimo estgio de maturao que ocorreu cerca de dez
semanas depois.
Para todas as anlises laboratoriais, amostras representativas dos colmos das plantas de
sorgo, aps a extrao do caldo, foram pesadas frescas e secas em estufa de circulao forada
de ar por 72 h a 65 C. As amostras secas foram modas em moinho tipo Wiley at
granulometria adequada (2 mm) e acondicionadas em potes de polietileno. Um total de 957
amostras, obtidas de mais de uma centena de hbridos e linhagens puras, foram usadas para
construir os modelos.
43
Caldo
Para a caracterizao do caldo foi utilizado um total de 500 amostras. Parte delas so
provenientes de 275 linhagens endogmicas recombinantes (RIL) de sorgo sacarino, oriundas
de duas linhagens contrastantes quanto quantidade e qualidade de acares no caldo. Alm
disso, para assegurar uma alta variabilidade nos modelos de calibrao, amostras derivadas de
ensaios de maturao foram includas. Estas amostras foram coletadas desde o incio do
desenvolvimento da planta at o ltimo estgio de maturao, que ocorreu cerca de dez
semanas depois, garantindo teores de acares nos trs nveis baixo, moderado e alto.
Para todas as anlises laboratoriais amostras representativas dos colmos das plantas
foram desintegradas em desfibrador/homogeneizador. Em seguida, elas foram submetidas
prensa hidrulica, 250 kgf cm- durante 1 minuto, para extrao do caldo, segundo mtodo
descrito por Tanimoto 81. O caldo extrado das amostras foi acondicionado em frascos de
polietileno e enviado ao laboratrio para anlise. Uma vez que as amostras de caldo sofrem
rpida fermentao e que no foi realizado qualquer teste de estabilidade, as mesmas foram
analisadas no mesmo dia em que foram coletadas.
5.2 Reagentes
Todos os reagentes utilizados neste trabalho foram de grau analtico e usados sem
nenhuma purificao adicional.
Biomassa
Para as anlises da biomassa foram utilizados os seguintes reagentes: cido sulfrico
(95-97% m/v), brometo de cetiltrimetilamnio CTAB (99% m/m), dodecil sulfato de sdio
(99% m/m), cido etilenodiaminotetractico sal dissdico di-hidratado EDTA (99-101%
44
m/m), tetraborato de sdio (borax) deca-hidratado (99-105% m/m), fosfato de sdio dibsico
anidro (99% m/m), trietileno glicol e acetona (99,5% v/v).
Caldo
Para as anlises do caldo foram utilizados os seguintes reagentes: sacarose (99,9 %
m/m), D-glicose anidra (99,7 % m/m), reagente clarificante base de alumnio - Octapol,
soluo de Fehling A (sulfato de cobre) e soluo de Fehling B (tartarato de sdio e potssio e
hidrxido de sdio).
5.3 Equipamentos
Os espectros foram coletados em um espectrmetro Bchi NIRFlex N-500 FT-NIR
(Flawil, Switzerland), equipado com acessrio de reflectncia difusa (biomassa) e de
transflectncia (caldo).
Biomassa
Os equipamentos usados para a avaliao da biomassa atravs das metodologias
convencionais incluram: um determinador de fibras Tecnal (Piracicaba, Brasil), modelo TE149, com capacidade para 30 testes; um forno mufla Quimis (Diadema, Brasil), modelo
Q318S, com rampas e patamares; uma balana analtica Mars Scales (North York, Canad),
modelo AUW220, com sensibilidade de 0,1 mg; uma estufa American Lab (San Francisco,
EUA), modelo AL 100/150, com circulao e renovao de ar e um moinho tipo Wiley
(Thomas Scientific, Swedesboro, EUA). Bolsas de filtro Ankom F57 (Ankom Technology,
Macedon, EUA) e uma seladora de embalagem manual 40 cm modelo PCS400C tambm
foram empregados para a determinao das fibras.
45
Caldo
Os equipamentos usados para a avaliao da qualidade do caldo atravs das
metodologias convencionais incluram: refratmetro digital porttil Atago (Tkio, Japo) com
correo automtica de temperatura modelo PAL-1 3810; polarmetro VIS/NIR com fonte de
radiao tipo laser de diodo 82; determinador de acares redutores (Redutec) Tecnal modelo
TE-088 (Piracicaba, Brasil); prensa hidrulica para extrao e esmagamento de cana
Hidraseme modelo PHS 250 (Ribeiro Preto, SP); desfibrador/homogeneizador tipo betoneira
IRBI (Araatuba, SP).
5.4 Softwares
O espectrmetro foi controlado e os dados foram adquiridos utilizando o software
Bchi NIRWare Operator (Flawil, Switzerland). Os dados foram tratados utilizando-se o
software MATLAB verso 7.13 (The MathWorks, Natick, MA, EUA). A rotina PLS utilizada
oriunda do PLS Toolbox verso 6.5 (Eigenvector Technologies, Manson, WA, EUA). Uma
rotina prpria, desenvolvida pelo grupo de pesquisa do professor Jez W. B. Braga, foi
aplicada para a deteco de amostras anmalas75. Para a determinao da leitura sacarimtrica
do caldo foi utilizado o software POL_SAC82.
5.5 Procedimentos
Aquisio dos espectros NIR
Biomassa
As amostras de biomassa de sorgo, secas e modas, foram transferidas para placas de
petri de vidro, de 100 mm de dimetro interno, as quais foram utilizadas como clula de
medida para a obteno dos espectros NIR. Os espectros das amostras foram registrados em
46
triplicata na faixa de nmeros de onda de 10.000 a 4.000 cm-1 em passos de 4 cm-1, como a
mdia de 32 varreduras, e temperatura de 25 2 C. Seis replicatas de amostras com trs
diferentes nveis de rendimento terico de etanol - baixo, mdio e alto - foram obtidas para a
avaliao da repetibilidade. Estas replicatas tambm foram analisadas em trs diferentes dias
por um analista diferente para a estimativa da preciso intermediria. Dez replicatas espectrais
da placa de petri vazia foram registradas, nas mesmas condies, com o objetivo de estimar o
rudo instrumental.
Caldo
As amostras de caldo de sorgo foram filtradas em algodo hidrfilo e transferidas para
placas de petri de vidro de 100 mm de dimetro interno, as quais foram utilizadas como clula
de medida para a obteno do espectro NIR. Um acessrio metlico de transflectncia foi
ento posicionado sobre a amostra para que o espectro fosse obtido (Fig. 16). Os espectros de
transflectncia das amostras foram registrados em triplicata na mesma faixa de nmero de
onda e nas mesmas condies em que foram obtidos os espectros das amostras de biomassa.
Seis replicatas das amostras com trs diferentes nveis de acares, baixo, mdio e alto, foram
obtidas para a avaliao da repetibilidade. A preciso intermediria no foi avaliada neste
caso, pois como as amostras no so estveis, elas foram analisadas e descartadas no mesmo
dia da coleta. Dez espectros de replicatas da placa de petri contendo apenas a placa de
transflectncia tambm foram obtidos para a estimativa do rudo experimental.
47
(a)
(b)
Figura 17 (a) Determinador de fibras Ankom e (b) bolsas de filtro utilizadas nas anlises de
FDA e FDN
Caldo
Para a determinao da leitura sacarimtrica (Z) o caldo obtido a partir de cada
amostra foi diludo com gua deionizada na proporo de 1:1 (50 mL de caldo para 50 mL de
gua). Em seguida, essa soluo foi misturada a aproximadamente 7,0 g de uma mistura
clarificante base de alumnio e filtrada em papel de filtro qualitativo. O filtrado foi ento
colocado em cubeta de caminho ptico conhecido e levado ao polarmetro (previamente
calibrado com soluo de sacarose a 15% m/v), para a determinao do grau de polarizao
em comprimento de onda de 589 nm (Fig. 18).
seguida, elas foram diludas com gua deionizada na proporo de 5 mL do caldo para 50 mL
total. Essa soluo foi transferida para uma bureta e utilizada para titular um volume
conhecido de reagente de Fehlling, previamente padronizado com soluo de D-Glicose
0,25% m/v, mantido em ebulio constante no equipamento Redutec. O final da titulao foi
acompanhado por diferena de potencial (Fig. 19) e o teor de acares redutores foi calculado
atravs da equao 2.
(a)
(b)
Figura 19 Determinao do teor de acares redutores em Redutec. (a) antes e (b) depois da
titulao
O brix foi determinado automaticamente adicionando-se cerca de 0,5 mL de amostra
na superfcie do prisma do refratmetro digital (Fig. 20).
50
6 - RESULTADOS E DISCUSSO
6.1 Resultados obtidos pelas metodologias de referncia
De acordo com a norma ASTM E165557 o conjunto de amostras utilizado para a
construo dos modelos deve representar toda a variabilidade qumica e fsica normalmente
encontrada na rotina de anlises. Alm disso, esta variabilidade deve estar distribuda
uniformemente ao longo de ampla faixa de concentrao, permitindo a construo de modelos
com considervel faixa de trabalho.
Nos histogramas das Fig. 21 e 22 esto representadas as faixas de concentrao de
cada parmetro, obtidas pelas metodologias de referncia, para as amostras utilizadas nos
modelos bem como a distribuio dessas concentraes entre as amostras. Os resultados
foram agrupados em dois conjuntos: calibrao (cal) e validao (val). Pode-se inferir, a partir
dos histogramas que os valores de todos os parmetros esto distribudos, homogeneamente,
em ampla faixa de concentrao e que o conjunto selecionado para validao tem faixa de
concentrao similar ao conjunto de calibrao.
preciso lembrar que nem todas essas amostras esto presentes nos modelos, uma vez
que os mesmo passaram por etapas de eliminao de outliers.
As dimenses dos valores de referncia tambm podem ser observadas pela avaliao
das tabelas contidas nos anexos C a K.
51
160
(a)
(b)
Frequncias
140
120
100
80
cal
60
val
40
20
0
20
22
24
26
28
30
32
34
36
70
60
(c)
60
40
30
cal
20
val
10
Frequncias
Frequncias
50
(d)
50
40
30
cal
20
val
10
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
9
9,5
10
10,5
11
11,5
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
Rendimento terico de etanol (Lt -1 )
Figura 21 Teores dos parmetros da biomassa determinados pelas metodologias de referncia para (a) celulose, (b) hemicelulose, (c) RTE e (d)
lignina
52
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Figura 22 Teores dos parmetros do caldo determinados pelas metodologias de referncia para (a) brix, (b) leitura sacarimtrica, (c) acares
redutores, (d) pol e (e) pureza aparente
53
log(1/R)
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
10000 9600 9200 8800 8400 8000 7600 7200 6800 6400 6000 5600 5200 4800 4400 4000
uniforme dos dados espectrais. Como a obteno da informao espectral foi feita por
reflectncia difusa, foi necessria a utilizao de um pr-processamento dos espectros para
correo dos desvios de linha de base causados pelo espalhamento da radiao. Os desvios
no lineares da linha de base foram corrigidos atravs do pr-processamento SNV (standard
normal variate)88, como pode ser observado na Fig. 24. O mtodo de pr-processamento
alternativo, MSC (multiple scatter correction), tambm foi testado, mas forneceu resultados
um pouco piores (valores de RMSEC e RMSEP mais elevados). Todos os modelos foram
centrados na mdia e o nmero de VL foi escolhido por validao cruzada em blocos
contnuos, considerando o menor RMSECV. Como as regies espectrais entre 10.000 e 9.000
cm-1 no apresentaram absorbncias significantes, elas foram removidas dos modelos.
5
4
log(1/R)
3
2
1
0
-1
-2
10000 9600 9200 8800 8400 8000 7600 7200 6800 6400 6000 5600 5200 4800 4400 4000
Figura 24 Espectros NIR de 957 amostras da biomassa do sorgo sacarino aps o prprocessamento SNV
Os coeficientes de regresso dos modelos PLS desenvolvidos para celulose,
hemicelulose, lignina e RTE so mostrados na Fig. 25. Pela observao destas figuras
possvel identificar os nmeros de onda que apresentam os coeficientes mais positivos e,
assim, mais contribuem para cada modelo.
Os coeficientes de regresso mais positivos e mais negativos para todos os quatro
parmetros so bastantes similares indicando que as regies espectrais mais importantes para
todos eles so praticamente as mesmas. Esse resultado era esperado, uma vez que tanto os
55
56
0.6
1.5
(a)
0.5
-0.5
-1
8800
8400
8000
7600
7200
6800
6400
6000
5600
5200
4800
4400
0.2
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
4000
8400
8000
7600
7200
6800
6400
6000
5600
5200
4800
4400
4000
5600
5200
4800
4400
4000
0.5
0.4
(c)
8800
2
1
0
-1
-2
-3
-4
(b)
0.4
8800
8400
8000
7600
7200
6800
6400
6000
5600
5200
4800
4400
4000
(d)
0.3
0.2
0.1
0
-0.1
-0.2
-0.3
8800
8400
8000
7600
7200
6800
6400
6000
Figura 25 Coeficientes de regresso dos modelos PLS para (a) celulose, (b) hemicelulose, (c) RTE e (d) lignina
57
Caldo
Os parmetros avaliados para a qualidade do caldo foram brix, leitura sacarimtrica,
pol, pureza aparente e acares redutores. Os primeiros quatro parmetros citados esto
relacionados com os teores de sacarose, enquanto que o ltimo se relaciona aos teores dos
monossacardeos glicose e frutose. Bandas de vibrao associadas com estes componentes
qumicos do caldo podem ser observadas na Fig. 26, que mostra o espectro das 500 amostras
de caldo de sorgo sacarino analisadas. Tais bandas sero especificamente atribudas em
seguida, na discusso sobre coeficientes de regresso dos modelos PLS.
3.5
log (1/R)
2.5
1.5
0.5
0
10000 9600 9200 8800 8400 8000 7600 7200 6800 6400 6000 5600 5200 4800 4400 4000
Fig. 27. O uso de derivadas reduz a sensibilidade das determinaes analticas, porm, elimina
problemas relacionados absoro de fundo devido presena de pequenas partculas slidas
em amostras lquidas, que podem dispersar a luz provocando o deslocamento da linha de base.
Como o uso de derivadas tambm aumenta o rudo, usa-se o alisamento simultaneamente.
0.04
0.02
Primeira Derivada SG
0
-0.02
-0.04
-0.06
-0.08
-0.1
-0.12
-0.14
10000 9600 9200 8800 8400 8000 7600 7200 6800 6400 6000 5600 5200 4800 4400 4000
Figura 27 Espectros NIR de 500 amostras do caldo do sorgo sacarino aps o prprocessamento 1 DSG
Todos os modelos foram centrados na mdia e o nmero de VL foi escolhido por
validao cruzada em blocos contnuos, considerando o menor RMSECV.
Os coeficientes de regresso dos modelos PLS desenvolvidos para brix, leitura
sacarimtrica, acares redutores, pol e pureza aparente so mostrados na Fig. 28. Pela
observao desta figura possvel notar que os nmeros de onda que apresentam os
coeficientes mais positivos e, assim, mais contribuem para cada modelo esto na regio
compreendida entre 5.400 cm-1 e 4.000 cm-1.
Para brix (Fig. 28a), leitura sacarimtrica (Fig. 28b), pol (Fig. 28c) e pureza aparente
(Fig, 28e), os coeficientes de regresso so bastante similares. Essa similaridade era esperada,
uma vez que todos esses parmetros esto relacionados aos teores de sacarose. Os nmeros de
onda mais positivos relacionados a esses parmetros esto nas regies prximas a 4.350 cm -1
e entre 4.500-4.700 cm-1, que so o primeiro conjunto de bandas de combinao caracterstico
dos acares; a banda de absoro em 4.405 cm-1 associada combinao de estiramento e
59
60
40
150
Coeficientes de Regresso
Coeficientes de Regresso
100
(a)
20
-20
-40
(b)
50
0
-50
-100
-150
-200
-60
-250
-80
7800 7600
7200
6800
6400
6000
5600
5200
4800
4400
-300
7800 7600
4000
7200
6800
6400
6000
5600
5200
4800
4400
4000
5200
4800
4400
4000
300
Coeficientes de Regresso
250
200
(c)
150
100
50
0
-50
-100
-150
7800 7600
7200
6800
6400
6000
5600
5200
4800
4400
4000
150
100
(d)
Coefeicientes de Regresso
Coeficientes de Regresso
20
-20
-40
50
(e)
0
-50
-100
-150
-200
-60
-250
-80
7800 7600
7200
6800
6400
6000
5600
5200
4800
4400
4000
-300
7800 7600
7200
6800
6400
6000
5600
Figura 28 Coeficientes de regresso dos modelos PLS para (a) brix, (b) leitura sacarimtrica, (c) acares redutores, (d) pol e (e)
pureza aparente
61
Tabela 1 Resultados para a otimizao dos modelos PLS da biomassa (resultados finais em negrito) atravs das etapas de deteco de outliers
Ncala
Nvalb
NVLc
RMSECd
RMSEPd
Celulose
2
3
638
319
6
2,7
2,7
600
319
6
1,7
2,8
542
248
6
1,0
1,5
638
319
6
3,5
3,5
568
319
6
1,6
2,9
Hemicelulose
2
3
4
605
319
6
2,0
3,6
570
319
6
1,8
3,6
550
249
6
1,4
1,7
RTE
2
3
Lignina
2
3
638
319
4
18
14
599
319
4
14
14
534
250
4
9
12
638
319
6
1,4
1,3
598
319
6
1,0
1,3
532
256
6
0,8
0,8
562
319
4
12
14
560
319
6
0,9
1,3
Nmero de amostras da calibrao, b Nmero de amostras da validao, c Nmero de variveis latentes, dcelulose, hemicelulose e
lignina em %m/m. RTE em Lt-1
Tabela 2 Resultados para a otimizao dos modelos PLS do caldo (resultados finais em negrito) atravs das etapas de deteco de outliers
Ncala
Nvalb
NVLc
RMSECd
RMSEPd
Brix
2
3
Leitura Sacarimtrica
1
2
3
4
Acares redutores
1
2
3
4
333
167
6
0,7
0,7
305
167
6
0,6
0,8
284
135
6
0,5
0,4
333
167
6
4,7
3,9
333
167
14
0,6
0,7
333
167
6
1,2
1,1
297
167
6
0,9
1,2
279
167
6
0,8
1,2
264
136
6
0,7
0,8
333
167
6
8,8
7,8
311
167
6
7,1
7,6
296
167
6
6,6
8,1
288
142
6
6,3
5,8
284
167
6
0,5
0,8
294
167
6
3,6
4,0
275
167
6
3,3
4,2
275
137
6
3,3
3,2
309
167
13
0,4
0,7
291
167
12
0,4
0,7
276
130
12
0,4
0,4
Pol
Nmero de amostras da calibrao, b Nmero de amostras da validao, c Nmero de variveis latentes, dbrix em B, leitura sacarimtrica em Z, acares
redutores em %m/v, pol em %m/v e Q em %m/v
62
64
65
4
3
(a)
2
1
0
-1
-2
-3
(b)
2
1
0
-1
-2
-3
-4
20
25
30
35
40
45
-4
18
50
20
22
24
26
28
30
32
34
30
(c)
1.5
20
(d)
-1
RTE resduos (L t )
10
-10
0.5
0
-0.5
-1
-20
-1.5
-30
220
240
260
280
300
320
340
360
-1
380
400
420
-2
2
10
11
Figura 29 Resduos para as amostras da calibrao () e validao (). Modelos PLS para determinao de (a) celulose, (b) hemicelulose, (c)
RTE e (d) lignina em biomassa de sorgo
66
1.5
(a)
0.5
-0.5
-1
(b)
2
0
-2
-4
-6
-1.5
4
10
12
14
16
-8
0
18
10
20
30
40
50
60
0.8
0.6
0.4
(c)
0.2
0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
-1
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
5.5
15
1.5
10
(d)
1
0.5
0
-0.5
-1
-5
-10
-1.5
-2
0
(e)
10
12
14
-15
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Figura 30 Resduos para as amostras da calibrao () e validao (). Modelos PLS para determinao de (a) brix, (b) leitura sacarimtrica,
(c) acares redutores, (d) Pol e (e) pureza aparente em caldo de sorgo
67
Biomassa
Para a estimativa dos valores crticos dos testes estatsticos nos modelos da biomassa,
foi considerado N=550, o maior nmero de amostras usado entre os mtodos desenvolvidos,
aps a deteco de outliers (hemicelulose, Tabela 1).
Para o teste de RJ, as estimativas dos valores de Req estiveram todas abaixo do valor
crtico de 0,9997 calculado a 95% de nvel de confiana, mas elas estiveram todas acima de
0,9928, o valor crtico a 99%. A grande quantidade de amostras usadas (muito acima do
normalmente utilizado em modelos univariados, para os quais este mtodo foi inicialmente
proposto) levou a elevados valores de Rcritico e fez com que o teste de RJ se tornasse muito
rigoroso. Assim, os resduos para todos os modelos tiveram uma distribuio normal a 99%
de nvel de confiana.
No teste de BF os valores de t L estimados estavam todos abaixo do t crtico de 1,96
(95% e infinitos graus de liberdade), confirmando ento a homocedasticidade.
A independncia dos resduos (teste de DW) foi confirmada para todos os modelos,
pois todos os valores estimados de d estavam dentro da faixa de aceitabilidade, entre dL =
1,81 e dU = 2,19 a 95% de nvel de confiana.
Caldo
Para a estimativa dos valores crticos para estes testes nos modelos do caldo, foi
considerado N=288, o maior nmero de amostras usado entre os mtodos desenvolvidos
(pureza aparente, Tabela 2) aps a etapa de deteco de outliers.
Para a normalidade dos resduos, as estimativas dos valores de Req estavam todas
abaixo do valor crtico de 0,9966, a 95% de nvel de confiana, exceto para o modelo do brix
que apresentou Req de 0,9988. No entanto, para todos os outros 4 modelos os valores de R eq
estavam acima de 0,9902, o valor crtico a 99%. Dessa forma, os resduos para todos estes
68
modelos apresentaram uma distribuio normal, sendo que o brix a 95% de nvel de confiana
e os demais parmetros a 99% de nvel de confiana.
Na avaliao da homocedasticidade dos resduos atravs do teste de BF os valores de
tL estimados estavam todos abaixo do t crtico de 1,96 (95% e infinitos graus de liberdade),
exceto para o modelo dos acares redutores, que apresentou valor de t L de 2,03. Assim, os
modelos de brix, leitura sacarimtrica, pol e pureza aparente foram considerados
homocedsticos a 95% de confiana, e o modelo dos acares redutores a 98% (t crtico = 2,33 e
infinitos graus de liberdade).
Por fim, a independncia dos resduos (teste de DW) foi confirmada, j que todos os
valores de d estavam dentro da faixa de aceitabilidade, entre dL = 1,81 e dU = 2,19 a 95% de
nvel de confiana.
Uma discusso mais aprofundada sobre estes testes (clculo dos valores crticos, por
exemplo) pode ser encontrada no artigo de Souza & Junqueira 62 e nas referncias nele citadas.
Sendo que as premissas para a linearidade dos modelos foram verificadas, os parmetros para
os ajustes dos valores de referncia versus valores preditos mostrados nas Tabelas 3 e 4
podem ser considerados vlidos.
6.5.2 Veracidade, preciso e faixa de trabalho
Os resultados de veracidade e preciso permitem atestar a exatido dos mtodos77.
A preciso expressa o grau de concordncia entre os resultados de uma srie de
medidas realizadas para uma mesma amostra homognea em condies determinadas 78 e
avaliada atravs dos desvios padro relativos (DPR).
A veracidade pode ser avaliada atravs dos parmetros absolutos RMSEC e RMSEP,
mostrados nas Tabelas 1 e 2, para biomassa e caldo, respectivamente, e tambm pela
observao dos erros relativos individuais (Tabelas 3 e 4 e Anexos C a K).
69
A avaliao dos erros relativos individuais foi realizada pela comparao dos mesmos
com os limites estabelecidos pela normatizao do MAPA91. De acordo com esta norma,
prevista para calibrao univariada, a veracidade a concordncia entre a mdia de um
nmero suficientemente grande de resultados de um ensaio e o valor de referncia aceito
convencionalmente como verdadeiro atravs de ensaios de recuperao. No entanto, em
calibrao multivariada esta FdM pode ser avaliada pela comparao dos valores preditos
pelo modelo com os valores obtidos pelos mtodos de referncia calculando-se os erros
relativos individuais. Os limites de erros relativos utilizados para avaliao da veracidade
foram de -20 a +10%.
Biomassa
Os valores de RMSEP de 1,5%, 1,7%, 0,8% e 12 Lt-1; para celulose, hemicelulose,
lignina e RTE, respectivamente (Tabela 1), indicam que os mtodos fornecem resultados em
bom acordo com os valores de referncia.
Para celulose e RTE todos os valores de erros relativos estiveram dentro da faixa de
10%. Para hemicelulose, apenas 8 das 249 (3%) amostras da validao apresentaram erros
fora da faixa de 10%, mas para lignina 69 das 256 (27%) das amostras apresentaram erros
maiores do que os limites. A veracidade mais baixa desse ltimo mtodo atribuda faixa
analtica menor para lignina. Os histogramas dos erros relativos das previses dos parmetros
avaliados para a biomassa (amostras da validao) so mostrados na Fig. 31.
Para os parmetros da biomassa, a preciso foi calculada nos nveis de repetibilidade e
de preciso intermediria. Para todos os mtodos, os valores de DPR variaram entre 0,5 e 1,5
% para repetibilidade e entre 0,5 e 1,6 % para preciso intermediria (Tabela 3). Todos esses
resultados esto de acordo com os guias brasileiros que prescrevem aceitabilidade mxima
para o DPR de 4% para repetibilidade e 10% para preciso intermediria91.
70
limite. O DPR mais elevado dos parmetros avaliados para o caldo, possivelmente, se deve,
em parte, ao uso alternativo do acessrio de transflectncia, em vez de cubetas, para avaliao
das amostras. Esse acessrio faz com que a sensibilidade da anlise seja reduzida, o que se
reflete tambm na preciso. Alm disso, o caldo apresenta certa quantidade de amido que
decanta rapidamente no fundo da placa, o que no permite grande reprodutibilidade na
aquisio dos espectros. O valor ainda mais alto de DPR para os acares redutores pode ser
atribudo faixa analtica mais baixa deste parmetro (1,2 a 5,2% - Tabela 4).
Considerando os estudos de linearidade e exatido, as faixas de trabalho dos mtodos
desenvolvidos para anlise do caldo foram estabelecidas (Tabela 4): 5,5 a 18,1 B para brix,
1,1 a 53,2 Z para leitura sacarimtrica, 1,2 a 5,2 % para acares redutores, 0,3 a 13,0 % para
pol e 9,8 a 83,0 % para pureza aparente do caldo.
72
(a)
(c)
(b)
(d)
Figura 31 Erros relativos das amostras de validao para os parmetros da biomassa (a) celulose, (b) hemicelulose, (c) RTE e (d) lignina.
Limites em vermelho (-20 a +10%)
73
(b)
(a)
(c)
(d)
(e)
Figura 32 Erros relativos das amostras de validao para os parmetros do caldo (a) brix, (b) leitura sacarimtrica, (c) acares redutores, 74
(d) pol e (e) pureza aparente. Limites em vermelho (-20 a +10 %)
Tabela 3 Parmetros para a avaliao das principais FdM dos mtodos NIRS desenvolvidos para a determinao
de celulose, hemicelulose, RTE e lignina em biomassa de sorgo sacarino
FdM
Veracidade
Preciso
Linearidade
Faixa de
trabalho
Seletividade
Sensibilidade
Sensibilidade
Analtica ()
-1
Vis
Parmetro
Erros relativos(min/max)
DPR repetibilidadea
DPR preciso
intermediriaa
Req (teste RJ)
tL (teste BF)
d (teste DW)
Inclinaob
Interceptob
Coef, de correlao (r)b
Celulose
Valor
-5,3/6,5 %
1,5%
1,5%
Hemicelulose
RTE
Lignina
-9,8/12,2%
0,5%
0,7%
-5,6/6,1 %
0,5 %
0,5 %
-28,8/37,6%
1,5%
1,6%
0,9964
0,2400
1,95
0,930,01
2,690,43
0,9631
21,4 a 49,1 %
0,9952
1,9489
1,93
0,700,02
7,670,61
0,8390
18,4 a 34,8 %
0,9980
0,4736
1,96
0,910,01
28,374,19
0,9553
221 a 412 L t-1
0,9956
1,1487
1,87
0,790,02
1,290,13
0,8920
1,8 a 11,5%
0,13
0,07
1,7 %-1
0,11
0,15
3,4 %-1
0,26
0,02
0,5 t L-1
0,14
0,27
6,1 %-1
0,6 %
0,3 %
2 L t-1
0,2 %
-1
Vis SDV
-0,0311,079 % 0,1061,354 % 0,0498,182 Lt
0,3620,778 %
t estimado
0,46
1,23
0,09
0,36
RPD
RPD calibrao
3,7
1,8
3,3
2,2
RPD validao
2,7
1,7
2,7
2,0
a
b
Resultados para trs amostras em trs nveis diferentes, Valores para o ajuste linear das amostras de calibrao, c Desvio
Padro dos erros de validao (Standard Deviation of Validation Errors)
c
75
Tabela 4 Parmetros para a avaliao das principais FdM dos mtodos NIRS desenvolvidos para a determinao de brix, leitura
sacarimtrica, acares redutores, pol e pureza aparente (Q) nas amostras de caldo de sorgo sacarino
FdM
Veracidade
Preciso
Linearidade
Faixa de
trabalho
Seletividade
Sensibilidade
Sensibilidade
Analtica ()
-1
Vis
RPD
Parmetro
Brix
Erros relativos(min/max)
DPR repetibilidadea
Req (teste RJ)
tL (teste BF)
d (teste DW)
Inclinaob
Interceptob
Coef, de correlao (r)b
Vis SDV
t estimado
RPD calibrao
RPD validao
Leitura
sacarimtrica
Acares
redutores
Pol
Valor
-8,3/11,0 %
2,8 %
0,9988
1,2691
2,14
0,970,01
0,320,12
0,9861
5,5 a 18,1 B
-24,6/28,5 %
4,3 %
0,9944
1,2976
2,11
0,930,02
1,830,46
0,9631
1,1 a 53,2 Z
-26,6/37,0 %
14,3 %
0,9952
2,0346
1,94
0,820,03
0,520,08
0,9044
1,2 a 5,2 %
-32,9/32,8 %
4,7 %
0,9916
1,0385
2,16
0,940,02
0,360,11
0,9683
0,3 a 13,0 %
-19,7/34,3 %
4,1 %
0,9905
1,7111
2,11
0,840,02
8,541,30
0,9145
9,8 a 83,0 %
0,08
0,02
2,7 B-1
0,08
0,01
1,2 Z-1
0,01
0,01
1,2%-1
0,08
0,02
2,7 %-1
0,08
0,01
1,2%-1
0,4 B
0,0800,371 B
2,50
5,7
6,2
0,8 Z
0,4183,170 Z
1,54
3,5
3,1
0,8 %
-0,0510,371 %
1,58
2,3
2,3
0,4 %
0,1080,797 %
1,58
3,8
3,0
0,8 %
-0,0865,811 %
0,18
2,4
2,1
Resultados para trs amostras em trs nveis diferentes, b Valores para o ajuste linear das amostras de calibrao,c Desvio Padro dos
erros de validao (Standard Deviation of Validation Errors)
76
77
Biomassa
Para a biomassa, todos os valores de t calculados para a estimativa do vis foram
menores que o valor de tcrtico (1,96, com infinitos graus de liberdade e 95% de nvel de
confiana), confirmando a ausncia de erros sistemticos nos modelos de predio.
Como pode ser observado na Tabela 3, os valores de RPD para celulose e RTE foram
considerados bons, enquanto que para hemicelulose e lignina foram considerados
satisfatrios.
Caldo
Para o caldo, o valor de t calculado (2,50) para o parmetro brix (Tabela 4) foi menor
que o valor de tcrtico apenas a 99 % de nvel de confiana (2,58 com infinitos graus de
liberdade), enquanto que os valores de t calculados para os demais parmetros foram
inferiores ao valor de tcrtico a 95% de nvel de confiana (1,96 com infinitos graus de
liberdade). Assim, a confirmao da ausncia de erros sistemticos para o modelo de brix se
deu com 99% de nvel de confiana, enquanto que para pol, leitura sacarimtrica, acares
redutores e pureza aparente observa-se a ausncia de erros sistemticos com 95% de
confiana.
78
Como mostrado na Tabela 4, os valores de RPD para brix, leitura sacarimtrica e pol
foram considerados bons, enquanto que para acares redutores e pureza aparente foram
considerados satisfatrios.
6.5.5 Cartas de Controle
Aps os mtodos NIRS terem sido validados e implementados para a anlise de
biomassa, suas estabilidades foram monitoradas atravs de cartas de controle.
Biomassa
De abril a setembro de 2013, 50 amostras de biomassa de sorgo sacarino foram
aleatoriamente selecionadas, duas por semana, e analisadas por NIRS e pelos mtodos de
referncia. As cartas de controle construdas com estes resultados so mostradas na Fig. 33.
Os limites indicados nessas cartas so baseados na normatizao brasileira70, a qual estabelece
que, no monitoramento de mtodos quantitativos para anlises agrcolas e de alimentos, dois
teros das amostras devem ter erros relativos entre 15 % (limites de alerta adotados nas
cartas de controle), enquanto um tero pode apresentar erros mximos permissveis de 33 %
(limites de ao). Como pode ser visto nesta figura, apenas duas amostras mostraram erros
relativos entre os limites de alerta e de ao para os modelos da celulose e da hemicelulose
(Fig. 33a-b), enquanto nenhuma amostra apresentou erro acima do limite de alerta para RTE
(Fig. 33d). Os piores resultados observados foram para o modelo da lignina (Fig. 33c), no
qual 15 das 50 amostras (30%) mostraram erros entre os limites de alerta e de ao. Apesar
disso, este ltimo resultado ainda est dentro dos limites de aceitao e todos os modelos
foram considerados satisfatoriamente estveis.
Para complementar a anlise das cartas de controle desenvolvidas, a distribuio
aleatria dos erros foi checada com os mesmo testes estatsticos previamente usados para a
avaliao da linearidade. Uma vez que um comportamento aleatrio dos resduos das
79
previses destas cartas indica a estabilidade dos modelos, justifica-se o emprego dos mesmos
testes usados anteriormente para verificar a linearidade. Os parmetros estimados so
mostrados na Tabela 5.
Tabela 5 Parmetros dos testes estatsticos usados na avaliao das cartas de controle
desenvolvidas para o monitoramento dos modelos NIRS
Teste/Parmetro
RJ / Req
BF / tL
DW / d
Celulose
0,9763
1,53
1,21
Hemicelulose
0,9835
2,36
1,59
Lignina
0,9861
0,23
1,16
RTE
0,9843
0,30
1,64
(a)
(c)
(b)
(d)
Figura 33 Cartas de controle para o monitoramento da estabilidade dos modelos NIRS da biomassa. (a) celulose, (b) hemicelulose, (c) lignina e
(d) RTE
81
7 - CONCLUSO
Considerando a necessidade de um grande nmero de experimentos para melhorar a
qualidade do sorgo sacarino destinado produo de etanol e a necessidade do PMGS da
Embrapa de diferenciar hbridos de acordo com seu potencial de produo de lcool, mtodos
analticos rpidos e de baixo custo so necessrios para caracterizao das amostras e para a
estimativa do rendimento de etanol. Assim, este trabalho desenvolveu e validou mtodos de
calibrao multivariada baseados em NIRS para determinao de parmetros de qualidade em
caldo e biomassa de sorgo sacarino visando produo de etanol de primeira e de segunda
gerao, respectivamente.
Alm disso, o rendimento terico de etanol lignocelulsico foi determinado a partir dos
componentes estruturais da parede celular, o que permitiu a eliminao das complexas
metodologias de referncia baseadas em hidrlise, fermentao e mtodos cromatogrficos. A
estimativa do rendimento terico de etanol a partir dos componentes estruturais considerada
mais confivel que a abordagem alternativa de quantificar os teores de monossacardeos, uma
vez que as caractersticas estruturais da planta, como a lignificao, afetam a disponibilidade
dos monossacardeos para a converso em etanol92.
As metodologias desenvolvidas propiciaram uma economia significativa tanto em custo
quanto em tempo de anlises para o PMGS, uma vez que necessrio apenas um minuto para
a obteno dos espectros e predio simultnea de todos os parmetros em cada amostra
(biomassa ou caldo) e a utilizao de reagentes feita apenas nas etapas de calibrao e
manuteno dos modelos.
Todos os mtodos desenvolvidos foram submetidos a uma validao analtica
completa, de acordo com os guias nacionais e internacionais, e considerados exatos, lineares,
sensveis e sem vis. Finalmente, a estabilidade dos modelos da biomassa foi monitorada
durante aproximadamente seis meses atravs do desenvolvimento de cartas de controle
82
apropriadas. Esta mesma estratgia no pde ser aplicada s amostras de caldo, em virtude de
sua indisponibilidade em quantidade suficiente.
Finalmente, o desenvolvimento deste trabalho numa parceria entre a universidade e
uma empresa pblica promoveu transferncia de conhecimento e tecnologia no sentido de que
as metodologias propostas sero efetivamente exploradas e utilizadas nas rotinas de anlise da
Embrapa, contribuindo para a agilidade e economia de recursos financeiros na pesquisa.
83
8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1.
15-21.
2.
Empresa
de
Pesquisas
Energticas
(EPE),
Anlise
de
Conjuntura
dos
NOVA
CANA
<http://www.novacana.com/n/etanol/mercado/futuro/eua-projecao-
M.O.S. Dias, T.L. Junqueira, C.D.F. Jesus, C.E.V. Rossel, R. Maciel Filho, A.
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90
ANEXOS
ANEXO A: Valores referncia versus valores preditos para os modelos da biomassa. () amostras de calibrao () amostras da validao.
50
34
32
45
30
40
35
30
28
26
24
22
25
20
20
20
25
30
35
40
45
18
18
50
20
22
420
11
400
10
380
360
340
320
300
280
26
28
30
32
34
36
8
7
6
5
4
260
240
220
220
24
-1
Valores Preditos (L t )
240
260
280
300
320
340
360
-1
380
400
420
2
0
10
12
91
ANEXO B: Valores referncia versus valores preditos para os modelos do caldo. () amostras de calibrao () amostras da validao.
18
55
50
16
40
14
45
12
10
35
30
25
20
15
10
6
5
4
4
10
12
14
16
0
0
18
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
14
12
10
0
0
10
12
14
5.5
5
80
4.5
70
60
50
40
4
3.5
3
2.5
2
30
1.5
20
10
0
1
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0.5
1
1.5
2.5
3.5
4.5
5.5
92
VP
(%)
36,9
35,3
39,6
34,4
41,3
34,8
41,2
37,7
35,4
33,6
37,8
44,4
38,6
37,0
37,9
35,8
39,2
37,5
41,6
37,9
40,0
41,3
41,8
34,1
38,0
32,4
38,1
36,7
44,1
44,2
39,4
32,3
42,9
39,3
34,5
42,2
29,5
36,2
37,4
30,6
34,6
38,8
33,3
38,6
41,9
44,1
35,3
37,2
32,0
34,1
39,8
34,2
28,2
ER
(%)
5,3
4,4
-3,1
1,0
3,4
4,1
1,1
0,7
4,1
-2,9
1,5
-1,3
2,5
5,0
0,5
-2,6
3,9
6,2
1,7
5,6
1,8
1,9
1,8
3,2
5,9
1,7
1,9
-1,5
2,2
-0,5
-0,3
3,4
-2,0
1,8
-3,4
-1,1
1,1
0,3
0,5
6,5
-0,7
-3,4
-5,0
0,1
5,1
3,2
3,1
-0,3
3,7
4,8
0,0
-1,3
1,4
VR
(%)
33,5
33,8
37,8
40,7
32,3
37,5
35,7
35,4
34,2
36,0
44,7
33,8
36,2
35,7
33,8
36,3
38,2
32,1
35,4
39,5
36,7
41,1
35,4
37,3
42,7
34,0
33,3
32,6
36,9
39,0
41,3
42,8
46,5
47,1
40,7
38,3
40,4
34,1
33,0
34,9
37,3
36,0
42,6
34,7
33,2
37,4
37,4
34,5
39,4
39,2
37,3
36,5
43,2
VP
(%)
32,6
35,1
36,7
39,9
31,6
35,8
36,0
35,7
34,2
36,5
44,7
32,2
36,9
34,0
34,5
36,0
36,7
33,9
34,8
39,2
35,4
39,0
35,1
36,4
41,7
34,6
33,2
33,5
35,2
40,8
41,3
42,1
45,5
46,0
41,1
37,5
42,3
35,0
35,0
36,4
38,2
36,8
42,2
36,5
34,7
38,1
36,7
35,6
38,3
37,5
38,2
37,1
42,0
ER
(%)
-2,8
4,0
-3,1
-2,0
-2,2
-4,3
0,9
0,9
0,0
1,3
-0,1
-4,6
1,9
-4,9
1,9
-1,0
-4,1
5,7
-1,6
-0,8
-3,6
-5,3
-0,7
-2,3
-2,4
1,8
-0,4
2,9
-4,5
4,6
0,0
-1,6
-2,1
-2,3
1,0
-2,1
4,8
2,8
6,0
4,3
2,5
2,4
-0,9
5,0
4,5
1,9
-2,0
3,4
-2,7
-4,5
2,4
1,5
-2,8
VR
(%)
42,6
39,4
41,1
47,9
40,7
40,6
43,1
35,0
41,3
42,0
40,3
41,5
43,4
44,6
46,9
44,4
40,1
36,4
40,5
40,3
40,5
41,2
44,6
45,8
42,4
42,4
34,2
34,9
35,4
43,3
39,8
43,3
40,5
40,4
44,2
45,4
40,5
44,1
41,0
42,5
41,7
41,8
45,7
37,2
43,7
40,7
45,6
34,7
40,1
43,5
42,2
42,4
40,5
VP
(%)
41,0
39,2
40,4
46,5
41,0
40,0
42,5
35,7
39,3
40,6
38,8
41,1
44,2
45,3
46,4
42,5
39,7
36,8
39,6
38,5
39,1
42,2
45,3
44,8
41,7
41,9
33,8
35,4
35,8
43,2
40,2
43,7
40,6
40,2
44,3
44,7
38,5
42,3
40,4
40,9
40,5
40,9
44,2
38,0
44,0
40,7
45,4
36,3
41,6
43,3
40,5
40,6
40,1
ER
(%)
-3,8
-0,4
-1,6
-3,1
0,8
-1,5
-1,5
2,0
-4,7
-3,2
-3,8
-0,7
1,7
1,6
-0,9
-4,2
-0,9
1,3
-2,2
-4,4
-3,6
2,4
1,7
-2,2
-1,7
-1,2
-1,2
1,5
0,9
-0,4
1,0
1,0
0,3
-0,5
0,4
-1,6
-5,0
-4,0
-1,5
-3,8
-2,8
-2,1
-3,1
2,2
0,8
0,1
-0,6
4,7
3,6
-0,4
-3,9
-4,1
-0,9
VR
(%)
36,3
34,0
37,6
42,3
40,0
38,2
39,3
40,9
44,2
34,1
47,0
45,1
35,7
34,9
41,6
45,1
41,5
42,1
42,8
39,4
45,3
40,0
44,7
40,7
39,3
42,3
45,2
44,5
43,1
37,6
42,7
38,6
41,0
41,5
45,4
43,6
39,2
44,1
41,2
38,5
38,3
35,6
41,9
36,4
37,8
39,7
42,1
44,7
46,8
27,4
31,8
45,8
45,6
VP
(%)
37,2
34,8
36,7
41,6
38,3
38,8
40,7
39,4
44,9
34,8
46,7
44,4
34,8
36,0
41,0
43,7
42,1
42,3
42,9
38,8
44,3
39,2
45,0
41,4
39,7
43,8
45,0
44,4
42,7
37,8
40,5
39,0
42,0
40,5
43,2
43,4
38,7
43,2
40,6
38,8
37,7
37,0
40,5
35,6
38,8
40,1
43,4
43,7
47,3
26,6
30,4
43,8
47,2
ER
(%)
2,7
2,5
-2,4
-1,8
-4,2
1,6
3,3
-3,8
1,6
2,2
-0,5
-1,4
-2,6
3,2
-1,5
-3,3
1,6
0,3
0,3
-1,5
-2,2
-2,0
0,8
1,6
0,9
3,5
-0,5
-0,4
-1,0
0,4
-5,1
1,0
2,4
-2,4
-4,7
-0,7
-1,4
-2,1
-1,5
0,7
-1,5
3,9
-3,4
-2,2
2,6
1,1
3,2
-2,4
1,1
-2,7
-4,5
-4,4
3,4
93
VP
(%)
26,8
26,0
23,3
26,3
28,4
27,8
26,3
29,8
23,3
23,9
25,8
27,7
25,6
27,7
28,2
26,7
24,8
28,0
26,5
25,4
27,4
24,6
28,1
27,8
26,7
24,2
25,7
23,0
27,8
25,5
27,4
27,5
24,6
29,2
26,9
23,8
26,9
22,8
24,6
26,3
22,9
23,5
28,7
25,8
22,9
24,0
27,4
25,7
22,6
23,7
26,3
25,0
21,7
ER
(%)
-1,6
-3,2
1,6
-7,3
-1,9
-6,5
8,7
1,2
-1,7
2,9
-1,9
4,3
3,1
1,6
2,2
2,1
0,9
-5,4
3,9
2,2
-4,4
-9,4
9,1
0,0
-2,5
4,3
5,6
0,7
6,8
7,3
5,4
-2,9
-7,1
-3,9
-4,9
4,5
4,2
-4,8
-6,9
-3,3
-3,4
-7,0
8,2
4,2
7,4
-1,7
6,6
8,7
-1,2
2,6
2,1
2,1
8,6
VR
(%)
25,7
28,0
23,7
22,7
22,7
25,8
28,0
24,6
24,7
23,2
26,0
29,2
22,5
26,1
21,7
24,9
22,9
23,6
22,2
25,0
24,3
25,6
26,3
25,5
21,7
22,5
25,1
24,6
26,4
27,7
26,3
26,9
25,0
22,7
24,9
21,2
25,5
26,4
23,2
24,9
27,1
26,4
25,5
24,6
24,2
25,1
25,9
25,3
22,7
26,4
26,8
30,2
26,6
VP
(%)
26,1
25,2
23,9
24,5
25,3
25,6
25,8
24,1
24,3
23,7
27,8
28,2
24,1
25,0
23,7
22,9
24,7
23,9
23,9
25,9
25,9
26,6
26,3
27,8
23,9
22,8
25,2
24,7
28,5
29,1
28,6
28,8
25,0
23,9
24,7
20,9
25,8
26,1
25,1
25,0
25,3
25,3
27,2
24,4
25,1
25,8
26,7
26,0
22,9
26,8
25,4
27,8
28,3
ER
(%)
1,4
-9,8
0,7
7,7
11,4
-0,8
-8,1
-2,0
-1,8
1,9
7,0
-3,4
7,4
-4,0
9,3
-8,1
7,8
1,0
7,8
3,5
6,6
4,0
0,1
8,9
10,4
1,5
0,4
0,3
8,0
4,9
8,6
7,0
0,2
5,4
-1,0
-1,4
1,0
-1,4
8,0
0,3
-6,7
-4,1
6,8
-0,5
3,5
3,1
3,0
2,4
0,9
1,6
-5,2
-7,7
6,5
VR
(%)
27,9
27,1
26,1
30,2
25,4
28,3
22,0
25,5
24,5
22,9
23,5
27,1
26,8
27,3
26,1
27,4
23,2
26,0
24,2
26,9
25,8
26,2
26,9
28,1
28,8
24,4
24,4
27,0
30,9
27,4
28,6
28,6
26,5
28,6
26,1
27,0
25,6
25,9
24,6
25,2
28,0
26,8
31,0
29,9
28,2
30,4
30,1
28,3
29,2
28,1
30,3
26,2
26,9
VP
(%)
28,3
25,0
27,0
28,7
26,5
25,8
24,7
25,9
25,4
25,5
25,9
27,4
27,9
28,2
26,5
25,9
25,5
24,9
25,1
25,3
26,3
27,9
29,1
27,6
28,5
27,0
26,1
25,9
28,8
26,6
27,4
27,3
27,5
28,7
27,3
26,7
25,9
26,7
25,8
27,5
27,9
28,2
30,2
27,4
29,6
27,9
28,9
29,4
29,3
29,0
28,2
27,3
28,1
ER
(%)
1,6
-7,6
3,3
-4,8
4,4
-8,7
12,2
1,7
3,5
11,2
10,1
1,0
4,0
3,2
1,3
-5,7
9,8
-4,1
4,0
-5,8
2,0
6,4
8,1
-1,8
-1,1
10,7
7,1
-3,9
-6,7
-2,8
-4,0
-4,5
3,8
0,4
4,7
-1,2
1,3
3,3
4,7
9,2
-0,5
5,4
-2,7
-8,2
5,1
-8,0
-4,1
4,0
0,4
3,0
-6,9
3,9
4,5
VR
(%)
24,5
26,5
24,6
27,9
28,8
26,4
27,4
27,7
28,4
30,0
31,5
30,9
27,7
26,2
28,4
30,1
28,8
29,5
26,7
30,0
25,7
26,6
26,9
28,8
28,7
28,4
26,6
28,1
28,2
25,3
27,2
26,3
22,2
32,1
32,6
34,1
33,2
30,9
31,7
20,5
23,3
23,8
22,7
20,9
32,6
32,6
31,7
32,0
30,1
23,4
31,4
30,7
31,0
VP
(%)
25,2
25,7
26,0
27,4
27,1
25,4
25,7
27,3
27,2
27,8
29,0
28,6
27,1
28,2
28,3
28,3
28,7
27,9
28,9
28,3
26,7
28,0
27,3
28,8
28,1
28,7
28,3
27,8
26,3
25,5
26,8
25,9
24,0
30,3
30,7
31,7
30,6
32,3
32,7
22,0
23,1
25,6
24,9
22,8
30,7
31,5
30,6
33,8
30,2
22,3
30,6
30,5
29,3
ER
(%)
3,0
-3,1
5,3
-2,0
-6,0
-3,8
-6,4
-1,4
-4,1
-7,5
-7,8
-7,6
-2,2
7,6
-0,5
-6,0
-0,5
-5,1
8,3
-5,6
4,0
5,1
1,5
0,0
-2,1
1,0
6,5
-1,2
-6,6
0,7
-1,3
-1,7
8,0
-5,8
-5,7
-7,0
-7,8
4,5
3,1
7,2
-1,0
7,3
9,5
8,9
-6,0
-3,2
-3,5
5,5
0,5
-4,8
-2,6
-0,6
-5,4
94
VP
(Lt-1)
328
327
292
338
359
356
289
296
311
343
306
335
364
330
309
337
327
314
344
311
350
346
345
295
326
284
342
317
357
368
341
298
365
337
296
343
271
309
324
323
274
330
334
343
275
300
357
334
284
318
361
352
335
ER
(%)
0,2
3
0,2
-1
0,2
-0,3
1,8
4,2
0,6
5
0,4
1,3
-2,3
0,8
0,7
-2,3
0,8
1,7
-3,5
-3,8
5
-1,3
-1,8
2,3
5,3
1,2
5
1,3
3,1
1,8
-2,1
0,6
-3,9
-1,7
-1,6
-2,3
-0,7
-3,8
-1,8
1,8
-3,6
-0,1
2
-4,3
2,5
-2,8
-3,8
0,4
-2
-1,8
1,5
0
-3,9
VR
(Lt-1)
313
262
319
256
300
297
314
308
302
338
298
288
309
309
316
326
302
312
363
363
289
320
317
295
304
286
295
343
344
313
343
326
350
297
286
316
360
378
374
367
370
364
366
303
297
256
327
304
314
304
349
304
294
VP
(Lt-1)
327
279
331
264
297
297
312
291
297
322
311
289
310
313
307
319
297
310
364
352
294
321
317
299
314
299
304
350
339
316
329
322
348
289
287
322
355
370
365
361
375
357
364
315
309
268
331
316
328
320
352
311
307
ER
(%)
4,6
6,1
3,8
3,2
-1,1
0,1
-0,6
-5,6
-1,6
-4,5
4,4
0,5
0,3
1,6
-2,7
-2
-1,6
-0,6
0,3
-3,1
1,9
0,5
0,1
1,4
3,2
4,5
2,8
2
-1,4
1,1
-4,1
-1,4
-0,5
-2,7
0,1
1,9
-1,3
-2,1
-2,3
-1,5
1,1
-2,1
-0,6
3,8
3,8
4,7
1,4
4
4,5
5,3
0,8
2,2
4,3
VR
(Lt-1)
357
330
328
318
359
392
341
345
339
353
314
338
324
333
362
366
381
349
340
327
327
329
331
341
346
373
362
365
320
381
345
369
354
344
374
372
339
359
344
335
364
335
362
362
351
379
334
361
368
366
362
367
354
VP
(Lt-1)
356
322
331
323
352
375
331
347
341
340
324
341
331
344
363
371
370
349
344
325
332
317
325
337
362
374
361
362
323
365
349
364
349
358
370
363
338
351
344
348
361
350
362
351
352
376
342
364
374
368
360
354
350
ER
(%)
-0,3
-2,6
1,1
1,5
-2,1
-4,3
-3
0,7
0,5
-3,8
2,9
0,9
1,9
3,1
0,4
1,3
-2,8
0,2
1,1
-0,8
1,5
-3,5
-1,7
-1,1
4,6
0,3
-0,3
-0,9
0,9
-4,1
1,3
-1,2
-1,4
4,3
-1
-2,3
-0,2
-2,1
-0,2
3,9
-0,8
4,5
0,2
-3,1
0,2
-0,7
2,5
1
1,5
0,6
-0,4
-3,6
-1,2
VR
(Lt-1)
310
348
331
332
324
370
328
331
315
354
374
359
374
364
347
364
355
377
356
365
380
358
347
351
348
369
336
359
361
371
347
363
356
342
326
322
322
284
359
371
391
388
403
232
260
286
272
259
399
352
261
390
382
VP
(Lt-1)
324
355
329
341
334
370
322
314
322
342
359
358
356
352
350
366
358
369
348
368
368
365
347
349
350
367
347
366
364
370
352
364
354
339
327
332
322
281
353
359
379
387
402
235
261
289
277
258
411
343
259
374
378
ER
(%)
4,7
2,1
-0,7
2,6
3,1
-0,2
-2,1
-5
2,2
-3,5
-3,9
-0,1
-4,6
-3,2
0,9
0,5
1
-2,3
-2,3
0,8
-3,1
2
-0,1
-0,7
0,6
-0,5
3,2
2
0,6
-0,4
1,4
0,5
-0,6
-0,9
0,3
3
0,2
-0,8
-1,7
-3,1
-2,9
-0,3
-0,2
1,1
0,5
1,3
1,9
-0,6
3
-2,6
-0,9
-3,9
-0,9
95
VP
(%)
7,8
6,5
5,3
7,4
6,8
6,2
7,6
6,3
7,6
5,6
5,9
6,6
7,9
5,8
7,0
8,5
6,1
6,7
6,1
7,1
6,7
7,5
6,2
7,9
8,1
7,5
5,8
6,8
5,4
6,9
6,3
8,7
7,3
5,4
7,8
7,4
7,9
4,2
5,9
6,7
6,2
7,0
6,8
4,6
5,4
6,8
6,6
4,7
6,5
8,0
8,2
6,5
6,6
ER
(%)
-2,1
29,0
-4,4
-1,0
-2,7
-6,9
5,2
-6,2
-1,9
-3,0
-19,0
1,9
13,9
-2,0
13,3
-4,4
-1,5
1,6
13,9
-0,4
9,7
21,1
7,5
-4,6
5,5
1,4
-13,3
-9,1
11,8
-1,6
-3,4
-10,9
2,6
-2,9
15,7
13,8
-13,5
10,6
-15,6
-3,6
27,8
13,8
-3,5
21,1
-1,0
6,4
6,2
37,6
28,2
-7,6
-7,1
-15,3
26,2
VR
(%)
6,3
3,9
6,1
5,7
4,6
4,8
5,6
5,6
5,4
4,8
6,2
7,4
6,7
4,8
5,9
7,0
4,8
6,0
5,8
3,7
7,9
5,8
4,1
5,6
6,9
5,1
4,5
5,8
6,7
4,5
5,8
6,3
3,9
5,5
5,6
5,5
6,5
6,3
4,7
4,5
4,8
7,5
8,8
10,8
8,9
7,2
8,0
4,3
4,4
5,5
4,6
4,8
5,2
VP
(%)
6,1
4,1
6,1
5,4
3,7
5,5
4,7
5,6
4,6
4,2
6,2
7,1
6,3
4,5
5,5
6,1
6,0
5,4
6,1
4,8
8,0
4,8
4,5
5,8
5,5
4,9
5,0
5,8
5,7
5,4
5,2
6,3
5,2
6,4
5,5
5,9
5,6
4,8
5,3
5,8
5,7
7,6
8,8
9,3
7,9
6,8
7,7
5,5
5,0
5,4
4,2
5,5
6,1
ER
(%)
-2,3
4,5
-0,1
-5,5
-18,7
13,6
-17,0
-0,3
-15,0
-11,1
-0,8
-3,8
-5,4
-5,7
-7,7
-12,2
25,2
-10,7
4,9
31,1
2,0
-16,8
8,0
3,9
-19,6
-4,8
10,3
0,1
-15,1
19,5
-10,3
0,7
32,5
15,9
-2,3
7,6
-13,0
-23,8
13,7
27,6
18,1
1,5
-0,1
-13,5
-11,6
-5,7
-3,4
28,4
14,7
-1,7
-9,0
13,6
18,6
VR
(%)
5,1
7,5
6,6
5,8
8,9
7,5
7,9
6,4
7,4
4,5
7,9
5,9
6,9
8,4
8,4
5,6
7,9
8,0
6,7
7,1
7,3
6,2
9,4
9,3
9,1
5,7
7,4
8,3
6,4
7,3
7,0
8,8
7,9
8,8
7,3
7,7
6,5
6,4
6,1
7,1
6,6
6,5
8,4
8,1
7,6
7,1
5,9
7,3
7,5
8,6
8,6
7,1
8,3
VP
(%)
6,2
6,1
6,4
6,9
9,0
7,7
8,1
6,8
7,4
6,0
7,2
6,3
6,8
7,8
9,2
6,7
7,2
8,9
7,1
8,4
6,2
5,9
8,6
8,6
9,1
7,0
6,5
7,1
5,8
7,0
7,1
8,2
8,8
8,8
7,9
8,1
5,7
5,6
6,0
7,3
8,0
7,4
7,2
8,9
9,0
8,6
6,7
7,6
7,4
7,6
8,4
6,6
8,3
ER
(%)
22,9
-18,2
-3,7
20,1
0,5
3,8
1,6
5,1
-0,6
32,4
-8,7
7,6
-2,1
-6,7
9,6
20,3
-8,5
10,6
5,8
18,4
-14,8
-4,5
-8,7
-7,4
-0,2
22,7
-11,8
-14,7
-10,2
-3,4
2,2
-6,8
11,8
-0,2
8,6
5,6
-11,4
-13,0
-1,5
2,2
21,5
13,6
-15,1
10,0
18,2
20,8
13,2
4,4
-1,2
-11,3
-2,7
-7,2
-0,2
VR
(%)
9,7
8,4
9,4
7,3
6,0
8,1
6,4
4,8
5,9
6,3
7,8
6,8
6,7
7,8
4,6
7,8
5,4
7,9
8,4
8,5
7,4
8,5
8,7
9,0
7,8
7,9
9,0
9,2
7,4
8,1
8,5
9,3
8,5
9,3
7,7
8,1
8,0
6,8
5,1
5,4
6,9
6,6
7,3
8,6
4,2
5,8
5,1
4,1
9,1
8,2
8,4
3,9
7,3
VP
(%)
8,4
7,9
8,2
8,5
7,5
6,8
6,0
5,9
6,4
5,9
7,6
6,5
6,8
8,6
5,6
9,0
6,1
7,8
8,6
8,1
8,3
7,0
8,0
8,7
7,1
8,8
8,5
8,2
6,8
7,3
7,3
8,1
7,4
8,4
7,3
8,3
7,7
6,9
5,9
4,7
7,4
7,6
6,6
8,8
3,7
5,3
3,7
3,7
8,6
7,2
9,5
4,1
8,3
ER
(%)
-13,2
-5,9
-12,6
17,1
25,4
-15,5
-5,2
22,9
7,7
-6,7
-1,8
-4,9
0,9
10,5
22,0
15,3
11,9
-0,8
1,6
-4,8
13,3
-17,6
-8,5
-3,5
-9,7
10,2
-6,3
-10,3
-8,3
-10,5
-13,8
-12,5
-13,0
-9,7
-6,1
2,5
-4,2
0,7
15,7
-13,0
6,1
15,2
-9,7
2,1
-13,5
-8,0
-28,7
-8,9
-5,3
-11,8
13,4
5,2
14,7
96
VP
(B)
14,4
14,8
13,5
13,4
11,7
12,9
12,6
14,5
11,9
16,1
13,2
13,8
10,8
14,5
14,6
14,5
16,0
16,1
15,1
13,1
12,2
14,3
12,3
11,3
13,1
15,2
15,5
14,6
11,7
16,1
11,7
12,8
11,3
12,0
ER
(%)
0,7
-3,5
4,1
0,5
-2,2
-2,5
1,0
-1,5
2,2
-3,8
-3,5
-2,7
5,8
0,3
2,3
4,6
1,8
3,0
3,7
0,5
-0,6
1,1
-3,7
3,9
1,8
-2,2
3,6
1,3
-2,1
-0,5
5,3
-1,9
-3,9
-2,4
VR
(B)
13,9
12,4
12,1
12,7
13,1
11,8
12,9
15,3
14,5
13,6
12,9
14,9
13,4
12,3
14,9
13,4
14,9
12,1
13,0
11,4
12,8
12,7
13,1
10,3
13,6
14,9
11,8
10,9
8,5
12,2
8,1
8,0
9,5
11,2
VP
(B)
14,0
12,5
12,5
12,9
13,0
12,3
13,2
15,4
14,5
13,9
13,3
15,3
14,1
12,4
15,2
13,7
15,2
12,4
13,3
12,0
13,0
13,0
13,4
9,9
14,3
14,6
11,1
10,8
8,3
11,5
8,7
8,5
9,4
11,1
ER
(%)
0,4
1,1
3,2
1,4
-0,5
4,3
2,6
0,6
0,0
2,0
3,4
2,9
4,9
1,0
2,2
2,3
1,9
2,7
2,4
4,9
1,4
2,4
2,1
-3,7
4,9
-1,8
-5,6
-1,2
-2,8
-5,5
7,8
6,5
-0,9
-0,9
VR
(B)
8,3
11,3
10,3
9,6
11,0
9,6
8,6
7,7
8,7
11,9
13,4
9,8
7,7
10,1
9,2
10,8
10,0
9,5
11,1
10,6
10,2
12,8
11,9
13,9
6,1
9,7
13,1
4,7
10,0
11,5
9,7
7,5
13,1
8,1
VP
(B)
8,8
11,4
10,8
10,1
11,4
9,9
9,1
8,2
8,6
11,5
13,0
10,5
7,5
10,4
9,2
10,8
9,8
9,5
11,8
10,5
10,2
12,7
12,0
13,5
5,9
9,9
12,8
5,2
10,2
11,3
10,4
7,7
13,7
8,7
ER
(%)
6,3
1,3
5,2
5,2
4,0
2,8
6,2
6,4
-0,7
-3,5
-2,7
6,7
-3,2
3,4
0,1
-0,1
-2,2
0,1
6,4
-1,1
0,0
-0,6
0,5
-3,2
-3,1
1,9
-2,2
11,0
2,4
-1,6
7,3
3,1
4,5
7,2
VR
(B)
13,9
10,4
14,0
7,5
14,3
6,9
11,5
10,7
11,0
11,8
11,5
9,2
11,0
8,0
9,9
8,3
11,3
9,2
8,6
9,4
12,0
12,6
11,9
8,0
9,1
9,0
14,2
12,3
10,0
10,2
12,6
11,0
13,2
VP
(B)
14,2
10,0
14,0
7,3
14,3
7,6
11,5
11,3
10,6
11,3
10,9
9,3
11,2
8,2
10,1
8,6
11,3
9,6
7,9
9,1
11,5
12,2
11,5
8,4
8,9
9,0
14,5
12,2
9,6
10,8
11,9
10,9
13,3
ER
(%)
2,0
-3,7
-0,3
-3,0
-0,3
9,8
-0,4
6,0
-4,0
-3,9
-4,8
0,8
2,1
2,5
1,6
3,8
0,2
3,9
-8,3
-3,0
-3,9
-2,9
-3,3
4,4
-2,6
-0,3
1,8
-1,0
-4,0
5,6
-5,7
-0,7
0,6
97
VP
(Z)
35,9
37,7
24,6
29,1
29,0
35,6
42,5
31,9
33,5
23,6
37,9
38,9
37,7
43,1
36,6
43,0
32,9
28,1
37,5
28,9
28,9
25,3
32,3
42,2
38,0
26,4
44,5
31,7
24,9
27,8
30,4
33,8
27,6
29,7
ER
(%)
1,7
-5,2
11,9
-2,7
23,0
-2,4
-7,5
-9,2
8,2
2,3
-8,3
1,0
-1,3
8,4
8,3
1,3
3,8
-9,0
15,0
10,6
-11,9
24,8
16,0
-5,5
-5,0
-3,7
-2,5
3,5
-16,7
1,6
-3,7
-14,7
-2,1
19,0
VR
(Z)
34,1
29,1
29,8
35,5
32,3
36,8
28,2
45,1
43,0
34,2
30,8
40,9
33,4
26,0
38,3
30,2
39,6
25,2
28,7
25,1
10,5
28,2
12,7
29,9
23,0
33,7
19,3
14,4
26,3
23,7
13,4
8,6
18,1
22,2
VP
(Z)
40,2
35,0
30,4
37,7
38,2
31,1
33,8
43,1
38,6
35,3
33,8
41,3
36,3
29,0
40,4
33,5
37,9
26,3
32,4
28,4
12,9
28,7
16,3
34,0
21,3
27,5
18,2
11,3
22,3
22,0
12,6
10,7
15,9
21,6
ER
(%)
18,0
20,6
2,0
6,3
18,2
-15,4
19,5
-4,6
-10,2
3,3
9,7
1,2
8,7
11,3
5,5
11,1
-4,2
4,3
12,7
13,4
23,5
1,8
28,6
13,6
-7,3
-18,3
-5,6
-21,4
-15,5
-7,2
-5,7
23,4
-11,9
-2,7
VR
(Z)
20,7
20,3
10,7
23,5
18,4
20,6
11,7
15,7
12,6
11,2
8,7
10,1
26,4
28,1
14,4
10,9
9,9
17,0
9,2
15,9
20,1
21,9
19,5
16,7
24,2
21,6
6,8
11,3
18,1
28,7
22,2
24,7
23,1
6,6
VP
(Z)
22,6
24,1
13,4
23,4
21,4
22,4
13,9
18,7
14,6
13,1
8,3
10,7
25,5
30,3
16,7
13,9
7,6
20,7
11,6
18,7
18,0
25,7
16,3
17,4
27,2
26,3
5,8
12,4
17,2
30,0
21,1
23,8
21,0
8,3
ER
(%)
9,1
18,8
24,8
-0,1
16,6
8,6
19,6
19,3
16,7
17,6
-4,6
5,9
-3,3
7,9
16,4
26,9
-23,6
21,8
26,9
17,6
-10,3
16,9
-16,7
4,4
12,2
22,0
-15,4
10,0
-5,0
4,6
-5,0
-3,8
-9,2
25,3
VR
(Z)
29,6
10,5
34,0
19,5
35,1
7,1
31,5
4,5
19,3
25,1
26,9
20,4
24,7
10,9
13,7
14,4
8,3
22,8
30,2
18,7
14,3
18,4
28,5
28,4
27,2
9,9
13,5
14,8
35,9
33,8
15,0
22,3
30,4
19,2
VP
(Z)
31,6
13,4
34,3
17,8
33,2
7,5
34,5
5,8
21,3
23,6
23,5
15,4
23,6
9,2
10,4
18,0
10,1
19,9
25,4
16,9
11,7
14,9
23,9
26,0
25,3
12,2
12,8
14,7
35,6
29,5
17,8
21,3
25,1
21,6
ER
(%)
7,0
27,7
1,0
-8,7
-5,5
7,0
9,5
28,1
10,7
-6,2
-12,3
-24,6
-4,4
-15,7
-24,3
24,7
21,7
-12,5
-16,0
-9,4
-18,3
-18,7
-16,3
-8,5
-7,0
23,0
-5,1
-0,1
-0,9
-12,6
18,6
-4,6
-17,3
12,4
98
VP
(%)
9,0
9,5
6,2
7,2
7,3
8,9
10,6
8,0
8,3
5,9
9,4
9,7
9,4
10,7
9,1
10,7
8,2
7,0
9,4
7,2
7,1
6,3
8,1
10,5
9,5
6,5
11,1
7,9
6,1
6,9
7,5
8,3
6,8
7,3
ER
(%)
2,4
-3,7
11,6
-3,3
23,2
-1,9
-6,5
-8,2
8,3
1,3
-8,2
1,9
-1,1
9,3
8,0
1,8
3,3
-10,0
15,4
9,6
-13,3
23,8
15,7
-4,7
-4,2
-4,9
-1,1
3,6
-18,3
0,2
-5,3
-15,3
-3,7
17,6
VR
(%)
7,3
7,4
8,8
8,1
9,2
7,1
11,2
10,7
8,5
7,7
10,1
8,3
6,5
9,5
7,5
9,8
6,3
7,2
6,3
2,7
7,1
3,2
7,4
5,8
8,3
4,9
3,7
6,6
5,9
3,4
2,2
4,6
5,6
5,2
VP
(%)
8,7
7,5
9,5
9,6
7,8
8,5
10,8
9,7
8,8
8,4
10,3
9,2
7,3
10,2
8,4
9,5
6,6
8,2
7,2
3,0
7,2
4,1
8,6
5,4
6,9
4,6
2,8
5,6
5,6
3,2
2,8
4,0
5,5
5,7
ER
(%)
19,4
0,9
7,2
18,7
-14,6
19,8
-3,2
-9,4
3,2
9,8
1,9
10,4
11,9
7,5
11,9
-3,0
4,3
13,7
14,8
14,1
2,6
27,8
16,6
-6,9
-17,5
-5,9
-24,0
-15,1
-5,7
-6,2
26,4
-11,8
-1,7
8,0
VR
(%)
5,1
2,7
5,9
4,6
5,2
3,0
4,0
3,2
2,8
2,2
2,6
6,6
7,0
3,6
2,8
2,5
4,3
2,3
4,0
5,1
5,5
4,9
4,2
6,1
5,4
1,8
2,9
4,6
7,2
5,6
6,2
5,8
1,7
7,4
VP
(%)
6,2
3,4
5,9
5,5
5,7
3,6
5,1
4,1
3,2
2,0
2,6
6,4
7,6
4,6
3,6
1,9
5,2
3,0
4,7
4,5
6,5
4,0
4,4
6,8
6,7
1,2
3,2
4,3
7,5
5,3
5,9
5,2
2,2
7,9
ER
(%)
20,1
23,4
-0,7
18,0
9,6
19,6
29,3
28,5
11,2
-8,5
3,3
-2,5
8,3
26,0
28,6
-25,7
20,8
30,2
16,1
-11,5
18,4
-18,4
4,8
12,4
23,6
-30,9
9,9
-5,8
4,8
-6,0
-4,5
-10,8
29,5
7,5
VR
(%)
2,7
8,5
4,9
8,7
1,8
7,8
1,2
4,8
6,3
6,7
5,2
6,2
2,8
3,5
3,7
2,1
5,7
7,6
4,7
3,7
4,7
7,2
7,1
6,8
2,5
3,4
3,8
8,9
8,5
3,8
5,6
7,6
4,8
8,1
VP
(%)
3,4
8,6
4,5
8,3
1,9
8,6
1,5
5,4
6,0
5,9
3,9
6,0
2,3
2,4
4,5
2,8
5,0
6,4
4,3
2,6
3,8
6,1
6,5
6,4
3,1
3,3
3,8
9,0
7,5
4,5
5,3
6,2
5,5
8,0
ER
(%)
25,7
1,5
-9,7
-4,8
4,6
10,6
30,8
10,7
-5,8
-12,0
-23,6
-3,9
-15,4
-30,0
24,5
30,9
-12,9
-16,1
-9,9
-29,0
-19,3
-15,3
-8,4
-6,3
23,7
-5,2
1,5
0,5
-11,7
19,4
-5,0
-17,9
13,5
-1,0
99
VP
(%)
81,1
81,3
84,9
51,4
64,0
61,1
65,2
52,5
56,9
56,1
61,7
67,9
60,5
60,0
52,6
65,6
66,1
65,4
69,7
63,5
71,0
70,0
60,3
55,7
62,1
55,0
54,5
52,8
57,4
65,2
68,4
64,8
54,9
72,5
ER
(%)
5,6
15,1
12,0
12,4
1,5
-0,3
1,5
14,3
0,7
19,0
0,3
0,4
-5,4
11,0
-7,8
-7,1
-1,2
-4,2
11,5
1,8
5,8
16,1
-0,9
-11,4
8,1
7,7
-10,4
12,8
6,3
-13,2
-7,2
-6,0
-4,2
4,6
VR
(%)
63,6
55,7
70,9
56,9
51,7
60,5
55,4
58,6
65,0
59,2
70,0
52,4
56,5
72,9
73,5
62,6
59,6
67,9
62,0
53,0
63,7
56,1
62,1
65,8
52,1
55,2
48,9
55,5
46,3
46,6
50,5
49,7
48,9
56,7
VP
(%)
53,1
55,1
60,8
55,4
58,0
68,0
62,0
56,9
65,4
65,0
60,0
60,1
62,1
70,8
65,1
62,6
61,2
67,5
62,6
54,5
67,9
61,0
54,9
64,6
52,0
60,7
54,9
54,4
55,3
56,6
61,1
58,7
46,3
54,0
ER
(%)
-16,5
-1,0
-14,2
-2,6
12,2
12,4
12,0
-3,0
0,6
9,7
-14,3
14,7
9,9
-2,9
-11,5
0,0
2,6
-0,6
0,9
2,8
6,7
8,8
-11,6
-1,8
-0,2
10,0
12,2
-2,0
19,5
21,6
21,0
18,2
-5,5
-4,8
VR
(%)
54,1
49,4
42,2
27,6
48,1
49,8
54,0
49,3
32,9
52,2
45,1
54,4
39,2
35,9
37,2
33,0
29,0
29,5
55,6
52,2
37,2
32,8
33,0
42,4
37,2
50,8
49,7
46,5
41,4
47,3
45,5
28,8
40,1
47,2
VP
(%)
48,8
46,5
37,1
35,1
42,7
48,0
46,0
46,9
36,3
46,7
47,2
49,9
40,6
43,8
39,1
40,5
30,0
33,0
49,1
53,7
42,8
38,8
31,4
47,3
40,1
43,0
50,1
40,8
41,6
51,7
51,0
27,8
35,2
39,1
ER
(%)
-9,7
-6,0
-12,1
27,1
-11,2
-3,7
-14,8
-4,9
10,4
-10,5
4,8
-8,2
3,4
22,2
5,2
22,7
3,5
12,2
-11,7
2,9
15,1
18,2
-4,7
11,5
7,8
-15,4
0,8
-12,1
0,5
9,3
12,1
-3,4
-12,2
-17,2
VR
(%)
56,1
54,0
51,4
33,8
22,7
56,3
33,2
60,8
47,4
62,3
24,1
54,6
42,1
59,2
57,1
56,4
34,7
38,7
36,9
51,6
42,4
49,5
59,6
56,4
57,4
31,6
37,8
41,6
62,8
37,9
55,2
44,0
61,1
62,4
VP
(%)
45,1
47,5
44,4
43,9
29,3
53,7
38,0
58,5
41,6
57,6
32,2
58,1
43,0
48,2
48,9
47,9
31,5
35,7
43,1
46,1
34,5
40,0
49,0
48,7
50,0
35,3
38,0
38,5
59,9
41,7
45,1
44,6
55,9
54,5
ER
(%)
-19,7
-12,1
-13,6
30,1
29,4
-4,7
14,4
-3,8
-12,3
-7,6
33,5
6,4
2,1
-18,6
-14,4
-15,1
-9,0
-7,8
17,0
-10,6
-18,6
-19,1
-17,8
-13,6
-12,8
11,6
0,5
-7,5
-4,6
10,1
-18,4
1,3
-8,6
-12,6
100
VP
(%)
1,3
1,7
1,6
1,3
1,2
1,8
4,2
3,0
3,9
3,0
4,4
4,7
3,8
4,2
3,4
3,3
5,3
2,3
2,9
3,6
3,2
3,3
4,0
2,6
3,6
2,5
2,5
2,6
3,5
2,8
2,2
1,7
3,0
ER
(%)
-17,7
15,1
2,3
-2,0
-23,6
6,8
-10,4
-18,4
15,0
-0,7
-0,7
-10,1
-4,6
-9,0
-6,2
0,8
8,8
-3,3
23,6
11,0
7,4
-6,7
-9,6
-1,9
10,2
37,0
4,9
24,4
-3,2
-20,7
-7,0
-26,6
-14,2
VR
(%)
3,5
4,3
3,7
3,1
3,4
3,7
5,3
3,6
3,8
1,5
1,7
2,0
2,4
4,0
3,9
3,7
2,5
3,4
2,9
4,1
2,9
3,3
4,1
4,3
3,3
3,6
2,4
3,1
2,2
3,2
2,4
3,0
3,9
VP
(%)
3,0
4,1
4,2
2,9
3,4
3,4
4,5
3,3
3,5
1,8
2,3
2,2
2,2
3,6
3,6
3,2
3,2
3,2
3,2
3,5
3,1
3,0
3,8
4,0
3,1
3,3
2,8
2,4
2,9
3,0
2,7
2,4
3,3
ER
(%)
-13,0
-3,1
12,1
-9,4
0,6
-8,9
-14,4
-8,3
-9,1
20,9
40,5
13,5
-7,2
-11,8
-6,2
-12,8
28,0
-5,3
9,9
-14,6
5,6
-11,3
-7,1
-7,8
-8,3
-6,1
18,1
-24,2
31,2
-6,5
12,1
-19,0
-14,0
VR
(%)
3,3
2,0
3,1
2,6
3,8
3,7
3,3
3,8
3,1
3,6
3,7
4,7
2,4
1,8
3,0
3,0
1,5
1,6
1,9
2,2
3,1
1,6
1,7
2,1
2,0
3,3
2,4
3,2
2,0
3,5
2,9
3,2
3,2
VP
(%)
2,7
2,4
3,1
2,8
3,6
3,0
3,6
3,1
3,5
3,8
3,5
4,2
2,6
1,8
3,1
3,7
2,0
2,1
2,1
2,4
2,7
1,7
2,0
2,5
2,0
3,5
2,3
2,7
2,2
3,2
3,0
2,6
3,3
ER
(%)
-19,7
20,7
-1,0
8,3
-5,6
-19,0
6,6
-16,8
10,0
5,8
-5,2
-8,9
10,5
2,4
3,2
24,3
29,8
27,7
7,7
7,4
-14,0
4,9
17,8
18,3
-2,6
7,6
-3,3
-15,4
7,5
-7,4
2,7
-18,1
1,9
VR
(%)
2,5
4,2
2,3
2,2
2,6
2,1
2,4
2,8
3,2
3,3
4,1
4,1
3,7
2,9
3,6
3,3
3,3
3,3
3,4
3,6
3,2
3,0
2,8
3,2
2,5
3,6
3,0
2,5
4,0
3,7
3,0
VP
(%)
2,8
3,9
2,3
2,6
2,8
2,2
2,7
2,9
3,4
3,6
3,8
3,9
4,0
3,4
3,2
3,1
3,3
2,7
3,6
3,3
3,4
3,4
2,6
2,5
2,5
3,1
2,8
2,5
3,5
3,3
3,3
ER
(%)
11,9
-7,4
2,4
19,2
8,5
6,6
10,3
5,1
4,8
10,0
-5,5
-6,5
6,3
14,6
-9,4
-7,4
1,6
-17,5
4,9
-8,2
5,3
14,7
-6,7
-23,2
-1,3
-14,1
-6,6
-0,2
-12,6
-8,7
10,9
101