UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

TCNICAS DE CULTIVO DE
MICROORGANISMOS

DOCENTE: Juscamaita Morales, Juan.

CURSO: MICROBIOLOGA GENERAL
GRUPO: B*
INTEGRANTES:
Contreras Leiva, Kenith.
Mayhua Esteban, Daniela.
Rodrguez Santilln, Lesly.
Romn Rojas, Henry.
Huatuco Mendoza, Katherine.

Lima2015
1) INTRODUCCIN

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas,

qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En
general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las caractersticas del
medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la disponibilidad de nutrientes en
el medio.
Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y elementos
qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de
carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en auttrofos si es el CO2
atmosfrico (microorganismos que fotosintetizan) y hetertrofos si utilizan carbono
orgnico.
La elaboracin de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en
una forma asimilable. As, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgnico para
los hetertrofos y como CO2 para los auttrofos, el N en forma de NH4, de NO3 - o de NO2
- o en forma de aminocidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en
forma de PO4 3-, el S procede de aminocidos sulfurados o de SO4 2-, etc. Adems, en
ciertos casos, es necesario aadir a los medios de cultivo algunos aminocidos o
vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar.
Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composicin qumica se
conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque estn compuestos por
mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne,
etc.). Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser lquidos o slidos si se aade algn
agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar).
En funcin de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser
generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos
mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferenciales
cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de
microorganismos (por ejemplo medios con hemates para identificar colonias de
microorganismos hemolticos), selectivo-diferenciales cuando combinan las dos
caractersticas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia
coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de
microorganismo a partir de una mezcla una poblacin mixta de gran tamao. (Walker,
2000).

2) OBJETIVOS

Observar caractersticas de crecimiento de los microorganismos al trasplante en

medios de cultivo lquido y slido.

Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismo utilizando

tcnicas de aislamiento.

3) RESULTADOS
A) CULTIVO: Bacillus sp.

MEDIO SOLIDO:
Tubo con agar nutritivo

MEDIO LIQUIDO:
Tubo con caldo
nutritivo

Cantidad:
Crecimiento:

Escasa.

Limitado a la lnea
de inoculacin o
picadura profunda.

Apariencia o tipo:
Formacin de
pelcula, masa de
clulas en la
superficie del caldo.

MEDIO INCLINADO
Tubo con agar nutritivo
inclinado

Cantidad:
Abundante.
Distribucin en la
superficie:
Irregular.
Forma de
crecimiento:
Equinulado. Crece en
diferentes formas,
sin borde definido y
compactas
difundindose en el
medio.
Consistencia del
crecimiento:
Viscoso.

PLACA CON AGAR

NUTRITIVO

PLACA CON AGAR

MANITOL

PLACA CON AGAR MAC

CONKEY

Cantidad:

Escasa
(1)

Cantidad:
Escasa (1)
Cantidad:
Abundante(76)
Distribucin
en
superficie: Irregular

Distribucin
en
superficie: Regular
la

Forma de crecimiento:
Circular
Consistencia
crecimiento:
Butirosa

Forma de crecimiento:
Circular
Pigmentacin:
Fucsia

la

Distribucin
en
superficie: Regular

la

Forma de crecimiento:
Circular
Pigmentacin:
guinda

del

Pigmentacin:
Blanco

B) Tcnicas de cultivo por aislamiento de microorganismo: jugo concentrado del Gato

C) Tcnica de cultivo que permite obtener los microorganismos por dilucin en placas de
agar nutritivo slido.

BILLETE

MANO

Descripcin: Se logra observar colonias de

diferente tipo, hay colonias circulares
Descripcin: se logra observar colonias de
diferente tipo, hay colonias circulares
Descripcin: Aparicin de colonias color
blanquecinas, de forma lobulada. Con ellos
podemos demostrar que el dinero est
altamente contaminado.

Descripcin: Aparicin de colonias color

blanquecinas, de forma entera; esto nos
indica que los microorganismos son
cosmopolitas y se encuentran en todo lugar,
hasta en nuestro cuerpo.

Nmero de colonias: 277

Nmero de colonias: 55

PELO

JUGO DEL GATO

Descripcin: Se observa pocas colonias,

de color blanco y forma circular. Descripcin: colonia
Comprobando as que el refresco del gato circular.
Nmero de colonia: 1
estaba contaminado.
Numero de colonias: 6

blanca

de

forma

MOSCA
Descripcin: se logra observar colonias de diferente tipo, hay colonias circulares blancas,
otras de color crema. De acuerdo a la forma hay puntiformes, circulares e irregulares.
Nmero de colonias: 55

4) DISCUSIONES
Staphylococcus sp.
Segn Pahissa (2009), el medio selectivo ms empleado para identificar
Staphylococcus
sp es el agar sal manitol (medio Chapman), que por su elevado contenido en sal inhibe el
crecimiento de la mayora de las bacterias gramnegativas.
Escherichia coli sp
Segn (Petrera, 2014) Las colonias de la bacteria Escherichia coli sp. varan segn el medio de
cultivo donde crezcan, en este caso el medio de cultivo es Agar Eosina Azul de Metlileno abreviado
EMB, podemos observar en la imagen que las colonias tienen en demasa una coloracin verdemetalico, lo cual es caracterstico de E. coli, aunque hay otras bacterias que logran producir este
color es muy tenue y escaso. Se logran ver colonias aisladas, son colonias medianas, circulares,
convexas, moradas, contorno verde-metalico, bordes redondeados.
Bacillus sp.

la apariencia de estar secas,

una protuberancia en el centro
les da una apariencia de huevo estrellado. (Petrera, 2014)

A.Colonias medianas,
convexas,
blanquecinas
como
cera, forma fusiforme
y
circular,
bordes
redondeados.
B.
Colonias
Grandes,
planas, blanquecinas,
forma
irregular,
bordes lobulados, dan
tambin se observa
de las colonias lo cual

5) CONCLUSIONES
Se logr observar las colonias de Bacillus sp. en medios de caldo, agar inclinado y agar vertical nutritivo
Se logr separa las colonias por los mtodos de las estras en los medios e cultivo en placas Petri.
(Petrera, 2014)

EJERCICIO 1:

CUESTIONARIO 1:

1.- Por qu algunos microorganismos desarrollan en caldo un caracterstico crecimiento de pelcula.

Qu factores ambientales podran alterar la formacin de una pelcula superficial?
Porque para obtener el crecimiento ptimo de los microorganismos, no slo son indispensables los
requerimientos nutricionales, sino otros factores ambientales tanto fsicos como qumicos. Un agente fsico es la
humedad, temperatura, presin osmtica, el pH, las radiaciones y los filtros. Este crecimiento se ve modificado
por el cambio en los factores ambientales.
El conocimiento de estos factores limitantes del crecimiento microbiano se puede utilizar para su control, sobre
todo en el caso de organismo que son patgenos, que causan deterioro en los alimentos o que dan lugar a
prdidas econmicas en diferentes formas (Roberto Alarcn, L., 2001).
2.- Cuando utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las caractersticas de crecimiento es
preferible inocular con aguja de kolle y no con asa Por qu?
Al realizar la inoculacin del cultivo por la tcnica de estras, la calidad del rayado depender de la cantidad de
bacterias que se tomen en el inculo y ello depende de la concentracin de bacteria en la muestra original.
Siendo usualmente el principal problema el inculo excesivo, que no permite separa colonias (Rodrguez,
2005).
Por lo cual fue necesario usar el aguja de kolle en vez de la asa de kolle, ya que la primera permite tomar una
muestra menos concentrada de bacterias.
3.- Qu factores influenciarn en la abundancia del crecimiento en caldo, agar inclinado y agar
vertical?

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos: (Petrera, 2014)

Disponibilidad de nutrientes adecuados:

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono,
nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer
de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o
extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de
cultivo provocaba la prdida de los factores nutritivos lbiles.
Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems,
representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos,
que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros
compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios sustancias
como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales
minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,
generalmente de naturaleza vitamnica.
Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades
metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
Consistencia adecuada del medio:
Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina,
gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se
desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros
tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran
cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio.
Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases:
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden
obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se
desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los
microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de
oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a
cualquiera de las citadas condiciones.
Condiciones adecuadas de humedad:
Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen
desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas
condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio.

Luz ambiental:
La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay
excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.
ph:
La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La
mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms
o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales.
Temperatura:
Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los
psicrfilos crecen a 0C y los termfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas
generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y
los saprofitos tienen rangos ms amplios.
Esterilidad del medio:
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que
puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especmenes
inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que
utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante).

EJERCICIO 2:

CUESTIONARIO 2:
1.- Qu procedimiento seguira a continuacin del desarrollo en estos ejercicios para obtener el cultivo
puro de cada cepa contenida en la mezcla?. Cmo podramos comprobar que estas cepas obtenidas
finalmente corresponden a las colonias aisladas?

En primer lugar se debe hacer un proceso de aislamiento de colonias el cual consiste en diseminar estos
microorganismos en una placa de muestra de tal manera que puedan desarrollarse de forma separada. Luego
se proceder a trasportar con ayuda de un asa de Klle una muestra del microorganismo a un tubo con agar
nutritivo para el crecimiento del mismo.
Para determinar la pureza de los microorganismos antes cultivados se deber realizar el proceso antes
mencionado una o dos veces ms, as se podr obtener un cultivo puro, adems se podr comprobar si las
colonias presentes al final del procedimiento tienen las mismas caractersticas entre s. (PEDRIQUE, M. y
GUTIRREZ, S.)

2.- Qu factores limitan el tamao de las colonias en una placa de cultivo?

Existen diferentes factores que afectan el tamao de las colonias, en los factores fsicos y qumicos tenemos a
la temperatura la cual es importante pues los microorganismos tienen una temperatura de crecimiento
determinada y si esta no es la correcta la velocidad de crecimiento obtendr una variacin a la normal, ya sea
aumentado o disminuyendo.
La actividad de agua es otro factor ya que los microorganismos generalmente necesitan un alto valor de
actividad de agua para su ptimo crecimiento. Un tercer factor que podemos mencionar es el pH pues las
bacterias tienen un rango estrecho de pH en el cual pueden desarrollar sino ellos morirn.
Por otro lado se puede clasificar a un factor como orgnico ya que los microorganismos necesitan de nutrientes
los cuales lo obtienen de vitaminas,, aminocidos, purinas y pirimidinas; sin ellas el crecimiento puede ser
afectado (Stanier, 1992).
3.- Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el nmero total de
colonias por gramo. Plantee una metodologa cuantitativa basada en diluciones sucesivas para resolver
el problema.
Dado que la muestra es slida, debe licuarse 10 g de muestra con 90 ml de agua destilada. Para luego
transferir con una pipeta 1 ml (con una incertidumbre de medicin de 5 %) de la suspensin inicial en un tubo
con 9 ml del diluyente estril.
Para una ptima precisin no introducir la pipeta ms de 1 cm en la suspensin inicial y evitar el contacto entre
la pipeta que contiene el inculo y el diluyente estril. (Renaloa, 2014).
Mezclar utilizando preferentemente un agitador mecnico durante 5 segundos a 10 segundos para obtener la
dilucin 10-2. Si es necesario repetir esta operacin a partir de la dilucin 10 -2 y diluciones sucesivas, utilizando
en cada operacin una nueva pipeta estril para obtener las siguientes diluciones (10 -3, 10-4, etc.). Se hacen las
diluciones que sean necesarias para obtener un nmero apropiado de microorganismos para realizar el
recuento. (Renaloa, 2014).
Despus de la incubacin por el perodo especificado, seleccionar las placas que, de ser posible, tengan menos
de 300 colonias. Contar las colonias, si es necesario utilizando el equipo contador de colonias. (Renaloa,
2014).
Examinar las placas bajo una luz tenue. Es importante que las colonias diminutas sean incluidas en el recuento
sin confundirlas con partculas insolubles o como un precipitado del alimento. Se examinan los objetos dudosos
detenidamente, utilizando lentes de aumento si es necesario, para poder distinguir las colonias de otros
materiales (Renaloa, 2014).
4.- En qu consiste la tcnica del nmero ms probable y qu usos tiene?
Este mtodo se basa en la presuncin de que las bacterias se hallan uniformemente distribuidas en un medio
lquido, o sea que las muestras del mismo tamao de un mismo producto tendran el mismo nmero de
microorganismos. Naturalmente las muestras contienen algunos grmenes ms o menos. Entonces la cifra
media es el nmero ms probable. (Lpez Tevez, L. Y Torres, C., 2006).

Las bacterias rara vez estn separadas de sus vecinas. Ellas se agrupan en racimos, en especial cuando se
reproducen activamente. Adems la agitacin puede deshacer o inducir a la formacin de racimos. Por lo tanto
carecen de valor las pruebas que se obtienen de una prueba aislada. (Lpez Tevez, L. Y Torres, C., 2006).
Si el nmero de grmenes es grande, la diferencia entre las muestras ser pequea, pero si son pequeas las
diferencias relativamente sern mayores. Esta tcnica se usa principalmente para la estimacin de bacilos
coliformes en caldo Mac Conkey, pero puede ser empleada para casi toda clase de grmenes en muestras
lquidas. Es posible calcular el nmero de grmenes por cada 100 ml. con cualquier combinacin de resultados
obtenidos de tales muestras. Existen tablas para muestras de 10ml., 1ml. y 0,1 ml. utilizando cinco o tres tubos
para cada tamao de la muestra (Lpez Tevez, L. Y Torres, C., 2006).
5.- De qu manera se pueden preservar cepas puras por largos periodos?
Segn Garca (2006)
Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo:
Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las clulas microbianas, pero stas no han
muerto. As se garantiza al mximo la estabilidad gentica, por evitarse la aparicin de generaciones sucesivas.
An as no se puede descartar algn cambio originado por el mtodo preparatorio en s mismo. Los mtodos de
conservacin pertenecientes a este grupo son dos: Congelacin y liofilizacin.
Mtodos alternativos: Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los mtodos de eleccin, bien por
carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la
conservacin por estos mtodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un nico mtodo
alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos mtodos:
a) Conservacin por transferencia peridica.
La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido.
b) Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar estril.
Es un mtodo alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de
microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias.
Mtodos restringidos: En este grupo se engloban mtodos no empleados habitualmente, pero a los que es
necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la
liofilizacin o la congelacin, como por ejemplo los gneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los
cuatro mtodos que vamos a citar se basan en la paralizacin del crecimiento por eliminacin del agua
disponible para las clulas:
a) Desecacin en papel de filtro.
b) Desecacin en suelo, arena, silicagel, etc.
c) Desecacin en bolitas de alginato.
d) Desecacin en sal gorda para halobacterias.
6.- Qu tcnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos anaerbicos?
MEDIOSDE CULTIVOS PARA ANAEROBIOS. (US, 2015).
Agar sangre para anaerobios con L-cistina, hemina y vitamina K: Medio no selectivo
de uso general.
Agar chocolate: Utilizado principalmente para aislar especies de Neisseria y haemophilus,
sin embargo se puede requerir para el aislamiento de anaerobios exigentes.

Agar alcohol fenilico etil con sangre: Aislamiento de anaerobios obligados Gram
positivos.
Agar Columbia con colistina y cido nalidxico (CNA): aislamiento de anaerobios
obligados Gram positivos.
Agar KVLB (kanamicna, vancomicina, sangre lacada): Aislamiento selectivo de Gram
negativos anaerobios.
Caldo trioglicolato (enriquecido con L-cistina, hemina y vitamina K).
Caldo de carne picada: caldos de enriquecimiento que se pueden usar como suplemento
de medios solidos particularmente si la muestra escasa (se pueden aadir unas gotas de
parafina lquida para mantener mejor la atmosfera anaerobia). Subcultivar en medio de
anaerobios.

6)

BIBLIOGRAFIA:
GARCA LPEZ, URUBURU FERNNDEZ. 2006. La conservacin de cepas microbianas. Coleccin
Espaola de Cultivos Tipo (CECT). Universitat de Valncia. 46100 Burjassot (Valencia).
LPEZ TEVEZ, LEONOR Y TORRES, CAROLA. 2006. Estudio cuantitativo de bacterias Microbiologa
Genera. Universidad Nacional del Nordeste. Consultado el 29 de Octubre del 2015. Disponible en:
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp5.pdf
PEDRIQUE, M. y GUTIRREZ, S. Trabajo Prctico N4. Obtencin de Cultivos Puros [en lnea]
<http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Obtenci
%C3%B3n_de_cultivos_puros.pdf> [consulta: 17 mayo 2014]
PETRERA, E. (26 de Febrero de 2014). Mirobiologa e Inmunologa. Departamento de Qumca
Biolgica. Obtenido de Mirobiologa e Inmunologa. Departamento de Qumca Biolgica:
www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar

RENALOA (Red Nacional de Laboratorios Oficiales de Anlisis de alimentos.

2014. Anlisis
microbiolgico de los alimentos. Metodologa analtica oficial. Volumen III. Consultado el 29 de Octubre
del
2015.
Disponible
en:
http://www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/Analisis_microbiologico_de_los_alimentos_Vol_III.pdf
ROBERTO ALARCN, LUIS. 2001. Manual de prcticas de Microbiologa bsica y Microbiologa de
alimentos.
Universidad
Autnoma
de
Ciudad
Jurez.
Mxico.
Disponible
en:
https://books.google.com.pe/books?id=Oy-kG04ClBUC&hl=es

RODRGUEZ CAVALLINI EVELYN, GAMBOA CORONADO MARA DEL MAR, HERN {ANDEZ
CHAVARRA FRANCISCO, GARCA HIDALGO JORGE.2005. Bacteriologa general, principios y
prcticas de laboratorio. Primera edicin. Editorial Universidad de Costa Rica. Costa Rica.
STANIER. 1992. Microbiologa, 2da edicin, Editorial Reverte, 752 paginas
US. (Universidad de Sevilla). (30 de Octubre de 2015). Microbiologa clnica. Departamento de
Microbiologa y Parasitologa. Obtenido de Microbiologa clnica. Departamento de Microbiologa y
Parasitologa.: http://asignatura.us.es/mbclinica
WALKER STUART T. 2000. Microbiologa. 1era edicin en espaol. McGraw-Hill Interamericana
Editores S.A. de C.V. Mxico, D.F.