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Prctica no. 5
REACCIN EN CADENA
DE LA POLIMERASA
(PCR).
EQUIPO 4
Aragn Lpez Jovana Sarahy
Chagoya Snchez Cynthia Karen
Franco Garca Valeria Guadalupe
Ramrez Morales Mara Antonieta
PROFESORES:
Dr. Csar Aza Gonzlez
Dra. Karla Lizbeth Macas Snchez
M.C. Julieta Seplveda Angulo
05 de Octubre de 2015.
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECFICOS
RESULTADOS
TCNICA DE PCR
Para la presente prctica se generaron dos mezclas de reaccin de PCR con distintas
concentraciones (Tabla 1) empleando como templado el gen GFA1 producto de una PCR de
ADN de Sporotrix shenckii.
El gen fue proporcionado por los profesores el mismo da de la prctica. Las muestras y los
reactivos se mantuvieron a 4C aproximadamente durante toda la prctica.
Tabla 1. Mezclas de reaccin de PCR
Reactivo
Volumen (L)
Concentracin final
Mezcla 1
Mezcla 2
Mezcla 1
Mezcla 2
Agua
17
15
62%v/v
60%v/v
2.5
2.5
0.92x
1x
3.7 mM
4 mM
0.37 M
0.4 M
0.37 M
0.18 mM
0.2 mM
3.7 ng/L
4 ng/L
0.5
0.5
2.5 unidades
2.5 unidades
Taq polimerasa
Ciclos
Accin
Temperatura (C)
Tiempo
Desnaturalizacin inicial
94
5 min
30
Desnaturalizacin
94
45 s
Alineacin
59
1 min
Extensin
72
1 min
Extensin final
72
5 min
Final
Mantenimiento
600pb
Figura 1. Electroforesis del Gen GFA1 amplificado por PCR. a) Marcador Hyperladder 1Kb BIOLINE,
b) Mezcla de reaccin sin oligonucletido reverso, c) Mezcla de reaccin completa,
d) ADN templado (GFA1).
DISCUSIONES
REACCIN EN CADENA DE POLIMERASA
El mtodo de amplificacin de cidos nucleicos usado fue el de reaccin en cadena polimerasa
(PCR), ya que este mtodo combina los principios de la hibridacin de cidos nucleicos
complementarios con los de la replicacin que se aplican repetidas veces en numerosos ciclos.
Segn Forbes en (2009) al usar este mtodo, una sola copia de ADN templado, a menudo no
detectable por los mtodos de hibridacin estndares, se multiplica a 10 7 o ms copias en un
periodo relativamente breve. Esto proporciona gran cantidad de templado, que puede
detectarse con facilidad por varios mtodos.
En la tabla 3 se muestra una comparacin de las concentraciones utilizadas en distintos
protocolos para realizar PCR, es posible observar que las diferencias no son tan significativas a
excepcin de MgCl2.
Tabla 3. Comparacin de protocolos de PCR.
continuacin se presenta la importancia y funcin de cada uno de los reactivos necesarios para
la reaccin de PCR:
Templado (ADN)
La calidad del material gentico afecta directamente el resultado de la reaccin, si ste
presenta contaminacin, con protenas o detergentes, la reaccin puede inhibirse (Eguiarte et
al., 2007).
Buffer 10X
La mayora de los buffers contienen Tris 10mM y KCl 50mM; el pH vara de 8.2 a 9 a 25C sin
embargo ste se reduce conforme aumenta la temperatura por lo que vara de 6.8 a 7.6. El pH
ptimo para la Taq polimerasa se encuentra entre 7.0 y 7.5. Tambin pueden contener algn
detergente o MgCl2. Es importante utilizar el buffer proporcionado por el fabricante ya que la
preparacin ha sido optimizada para la Taq polimerasa correspondiente (Harris, 1998)
Taq ADN polimerasa
La Taq polimerasa se debe mantener en congelacin (-20C) hasta su uso, y posteriormente en
hielo. Debe agregarse como ltimo reactivo a la reaccin para evitar que la misma comience
antes de llegar a las condiciones ptimas y origine productos no especficos de la amplificacin
(Zavala, 2005).
Esta enzima puede resistir a temperaturas de 95C, necesarias para la separacin de las dos
hebras de ADN y permite manejar la astringencia de la reaccin y as acceder nicamente a
las secuencias de ADN especficas de la zona utilizada (Sforza, 2007).
El principio de la PCR se basa en la amplificacin de un fragmento especfico de ADN a travs
de ciclos sucesivos en los que se multiplica exponencialmente hasta acumular suficiente
producto para ser visualizado. Este proceso se logra a travs de tres etapas: desnaturalizacin,
hibridacin y extensin.
La primera de ellas, la desnaturalizacin permite iniciar la reaccin ya que es preciso que las
molculas de ADN molde se encuentren en forma de cadena simple. Esto se consigue
calentando a temperatura de 94C, para que produzca la rotura de los enlaces puente de
hidrgeno intercatenarios y la separacin de ambas cadenas. Esta temperatura se mantuvo por
5 min para asegurar la completa separacin de la doble cadena de todo el ADN presente en la
muestra, pues si ste slo se desnaturaliza parcialmente tender a hibridar nuevamente
dificultando con esto la alineacin de oligonuclotidos (Harris, 1998).
En cuanto a la hibridacin segn Brown (2008) una vez que el ADN est desnaturalizado se
disminuye la temperatura de la reaccin hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60C,
esta temperatura depende directamente de la temperatura de alineamiento de los
oligonuclotidos.
Para la amplificacin del gen GFA1, se usaron oligonucletidos especficos con las siguientes
secuencias:
Oligo Directo
Oligo Reverso
5 CGCTCCATACTAGCCCGT 3
5 GCAACCTTGCCAACCTCCT 3
Se realiz un anlisis de stos con la herramienta Primer Design and Search Tool de
BiSearch (Tabla 4) para conocer la temperatura de hibridacin ptima, la cual regularmente se
considera 5C por debajo de la temperatura de fusin de los oligonucletidos (Winkler, 2014).
Tabla 4. Caractersticas de los oligonucletidos utilizados
Oligo
Tamao
Tm (C)
%GC
Directo
18
66.2
61.1
Reverso
19
64.6
57.9
Tm promedio (C)
65.4
T alineamiento (C)
60.4
La temperatura de alineamiento utilizada fue de 59C, que est 1.4C por debajo de la
temperatura ptima terica, sin embargo sta se puede variar de 2 a 5C para optimizar la
amplificacin del ADN de inters (Harris, 1998).
Finalmente durante la etapa de extensin, la ADN polimerasa termoresistente incorpora
nucletidos en el extremo 3 del cebador utilizando como molde la cadena de ADN previamente
desnaturalizada. La temperatura a la que se realiza esta etapa de la reaccin es de 72C ya
que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su mxima actividad (Fernndez,
1994; Garca, 2006; Rojo, 2014; Winkler, 2014; Harris, 1998). El tiempo de esta etapa depende
del tamao previsto del fragmento a amplificar considerando que la velocidad promedio de
polimerizacin es de 1 Kb por minuto (Sforza, 2007; Winkler, 2014).
Figura 2.Electroforesis en gel de agarosa al 1%. 1) Marcador de peso molecular, 2) Control negativo,
3 y 4) gen RPL32 amplificado (Prez et al, 2014).
De acuerdo con Winn y col (2006), la presencia de una banda nica del tamao esperado es
una buena evidencia preliminar de la especificidad de la reaccin de PCR, lo cual puede
observarse en los resultados obtenidos, la nica banda visualizada en el gel present poca
intensidad lo que indica que la concentracin de amplicn es baja, pues existe una relacin
proporcional entre la intensidad de la banda y la cantidad de producto amplificado (Muoz,
2015). En teora, es suficiente con una molcula de ADN para amplificar un fragmento por PCR
sin embargo, el rendimiento a pequeas concentraciones de templado es bajo (Jimnez, 2003),
de modo que si se hubiese utilizado una mayor cantidad de ADN se esperara obtener una
banda de mayor intensidad.
Desde el punto de vista experimental, la sensibilidad y la especificidad en el anlisis de una
muestra por PCR pueden ser aumentadas si se realiza un segundo PCR o n-PCR. El ensayo
por n-PCR consiste en dos reacciones de PCR consecutivas. En la primera reaccin de
amplificacin se utilizan cebadores especficos de la secuencia por analizar. El producto de
esta reaccin sirve como templado para una segunda reaccin de PCR. La sensibilidad en la
deteccin se ve aumentada ya que al final del ensayo la secuencia blanco ha sido amplificada a
lo largo de dos rondas de PCR (Maldonado, 1998). Esto puede observarse en la Figura 1
comparando los carriles c y d, ambas muestras se tratan del gen GFA1, sin embargo ste solo
es visible en el carril c que corresponde a la PCR consecutiva de la muestra en el carril d.
De acuerdo con la base de datos de NCBI el gen GFA1 cuenta con una secuencia de 598 pb
(Figura 3), este tamao es muy cercano a la banda observada en el carril c de la Figura 1 que
corresponde a aproximadamente 600 pb con lo que se puede decir que la PCR fue realizada
exitosamente.
Cuando no se observa producto luego de una PCR se puede deber a fallas en 3 parmetros
principales: qumicos, fsicos o trmicos. Uno de los errores qumicos ms comunes en el
proceso se da al omitir alguno de los ingredientes de la mezcla de reaccin (Harris, 1998). En
el caso del carril b en la Figura 1, no se esperaba observar producto debido a la ausencia de
oligo reverso en la preparacin.
Otra forma de explicar la ausencia de producto es mediante la frmula para calcular el nmero
de copias segn los ciclos de reaccin (Horton et al, 1994):
Copias de ADN amplificado:
n1
donde se consideran las cadenas que se forman a partir del segundo ciclo con ambos
oligonucletidos, en nuestro caso, al aadir nicamente el oligo directo, la frmula se
modificara de la siguiente manera:
Copias de ADN amplificado:
n1
De donde es bien sabido que el valor de uno elevado a cualquier potencia seguir siendo uno
(Graham, 1989), lo que significa que independientemente del nmero de ciclos, siempre se
obtendr una sola cadena, que es una concentracin mnima y no puede ser visualizada.
CONCLUSIONES
CUESTIONARIO
(Entrala, 2000)
Oligonucletido directo
+=11 +=7
= 4(11)+ 2 (7)=58
Oligonucletido reverso
+=11 +=8
= 4(11)+ 2 (8)=60
promedio= 59C
Mencione que sucedera si se utiliza una temperatura de alineamiento muy inferior o
muy superior a la temperatura ptima.
La temperatura de alineamiento depende de la longitud del primer, si dicha est por encima o
por debajo de la ptima funcionar incorrectamente. En caso de que sea alta es posible que no
se realice la unin con la regin complementaria del primer, por el contrario, al ser muy baja
ser una unin inespecfica (Arredondo, 2001).
Mencione las principales causas a las que atribuira.
a. Ausencia de amplificado
Degradacin del ADN: puede ocurrir cuando se manipula la muestra en condiciones subptima
o bien prdida de un alelo, que se puede llegar a confundir con ser homocigtico para dicho
alelo y resulta en ausencia de amplificacin o resultados parciales.
Modificacin del ADN: la luz ultravioleta modifican el ADN, alterando as los resultados de la
amplificacin.
Inhibicin de la PCR: puede haber agentes que interfieren en el correcto transcurso de la PCR.
Requerir un procesamiento adicional de la muestra para eliminar estos compuestos del medio
antes de preparar la mezcla de PCR.
(Butler, 2005).
b. Amplificacin en un control negativo.
El control negativo se utiliza para comprobar que ninguno de los componentes de la
reaccin est contaminado con ADN de otra procedencia y que no se han producido
errores de manejo que hayan provocado la contaminacin cruzada entre muestras.
Sin embargo puede darse contaminacin (arrastre de productos amplificados o cidos
nucleicos) por:
-Inhibidores de la PCR en la muestra (ej. grupo hemo, heparina)
-Extraccin del ADN defectuosa
-Mutacin en el sitio de hibridacin del cebador
-Baja concentracin o calidad del templado
-Concentracin incorrecta de Mg2+ o primers
(Ogawa et al., 1980).
Investigue qu podra hacer para corregir los siguientes resultados.
REFERENCIAS