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MEMBRANAS BIOLGICAS II
Si marcamos una protena podemos observar en que regin de
la membrana se encuentra, despus de hacer una
electroforesis y observar su marcaje radiactivo. Tenemos dos
componentes, el EA (permeable) y el IEA (impermeable).
Segn la unin de los componentes al N-ter de la protena,
podemos ver que se haya anclado a un lado u otro de la
membrana.

EMPLEO DE DETERGENTES
Luego hay otras protenas que se encuentran dentro de la
membrana y que si se quieren cristalizar o aislar necesitamos
extraerlas con un detergente. Aunque hay que tener cuidado
con el detergente ya que puede provocar un cambio
irreversible, para ello tendremos cuidado con su empleo para
que el cambio sea siempre reversible.

Los detergentes van a extraer tanto protenas de membrana (lipoflicas) como lpidos y van a
dar lugar a la formacin de micelas. Las protenas sern funcionales en los detergentes, pero
para aproximarnos a lpidos de clulas, tenemos que sustituir esos detergentes por los lpidos.
En cada micela habr un nmero de protenas. As solamente tenemos que purificar la micela
que nos interesa, olvidndonos de las dems, bien por cromatografa o por otras tcnicas.
Cuando aadimos el detergente, ste va a rodear a las protenas de
membrana cubriendo las zonas hidrofbicas. Pero no se formar la micela
hasta que no se supere la concentracin micelar crtica. En este caso
tendremos una micela con detergente, lpidos y protenas, pero si
seguimos aadiendo detergentes podremos conseguir micelas nicamente
con protenas.

Aqu vemos cinturones de detergente alrededor de trmeros de protena visualizados con

difraccin de neutrones. Podemos ver tanto micelas como protenas. No alcanzaremos niveles
atmico, pero s estructurales, por lo que nos podemos hacer una idea de como ser la
estructura delo que estudiemos..

CONCENTRACIN

MICELAR CRTICA

Se denomina concentracin micelar crtica (CMC) a la concentracin mnima de

detergente a partir de la cual se forman micelas espontneamente en una disolucin. La
concentracin micelar crtica es un punto definido con precisin para cada compuesto y se
puede conocer mediante resonancia magntica nuclear y otros mtodos.

La CMC es una de las ms importantes caractersticas de un detergente, pues antes de

alcanzarse la tensin superficial depende directamente de la concentracin de
detergente, pero permanece constante o crece de forma suave a partir de la CMC.

Aumentando el detergente hasta que superamos la concentracin micelar crtica nos permite:
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Sacar la protena de su entorno y purificarla.

Hacer estudios estructurales por difraccin de rayos X, o si el tamao lo permite, por
RMN (resolucin magntica nuclear).

Una vez purificada la protena, sta conservar su

funcin en el detergente, aunque no ser exactamente
igual. Por eso una vez purificada vamos a hacer el paso
inverso en una poblacin lipdica, vamos a ir
eliminando poco a poco el detergente para que la
protena se instale en los lpidos y poder medir su
actividad.

Durante
el
proceso
mantenemos
las
interacciones hidrofbicas, por eso es importante
la concentracin micelar crtica, porque nos dice
como de fcil va a ser eliminar el detergente.
Tambin una de las cosas que tenemos que
tener en cuenta es que el detergente no puede unirse de manera irreversible, se tiene
que poder eliminar y que cuando se elimine la protena no se desnaturalice, por eso
hay que tener mucho cuidado con que detergente hacemos la purificacin.

RAFTS
Como ya mencionamos en el tema anterior tenemos
unas zonas especficas en la membrana denominadas
rafts lipdicos. Estas son unas balsas enriquecidas de
esfingolpidos y colesterol, donde se asocian unas
determinadas protenas. Estructuralmente hablando, los
rafts son in estado intermedio entre gel y lquido
cristalino.
Con las balsas lipdicas se modifica la anchura de la
membrana, por lo que se consigue secuestrar a otras
protenas que de otra manera no sera posible. De esta
manera al poder modificarse la membrana, la protena no tienen por qu adaptar su
estructura o tener una posicin diferente para entrar.
Dentro de los rafts tenemos tambin unas invaginaciones especficas de
esta zona denominadas caveolas. stas estn especializadas en el
transporte.
Una de las protenas tpicas es la caveolina, que se asegura su insercin
en la membrana via 3 grupos acilo. La protena tiene una estructura
que va a inducir la curvatura de la membrana cuando dimeriza,
formando esas caveolas que producirn transporte de sustancias al
interior de la clula.
Otro ejemplo es la recoverina: es una protena que a elevados niveles
de calcio saca un cido graso que se ancla a la membrana, de
manera que la protena est lo ms cerca posible de protenas de
membrana que regular.
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DESAJUSTE HIDROFBICO
Lo que pasa en estos casos es que la membrana vara en
tamao, por lo que las protenas que tengan que estar ah
se tendrn que adaptar de una u otra manera. Esto ocurre
porque muchas protena TM tienen grupos hidrofbicos que
no pueden completamente cubrirse con la membrana a
menos que se inclinen lo suficiente. Si esto no es
suficiente, las protenas migrarn a rafts para poder
inclinarse y apantallar completamente los residuos
hidrofbicos.

MONOCAPAS Y BICAPAS EN
UNA BALANZA DE LANGMUIR
Este mtodo se emplea en electrofisiologa
para medir el voltaje.

(bioelectricidad)

Con esto podemos observar diferentes diferencias de

y como afecta esto a la bicapa. Tambin podemos
poros y ver como vara.

potencial
introducir

Para hacer
las bicapas empleamos una lmina con un
agujero en el que depositamos los lpidos, de
modo que al insertarse en agua, se
reorganizan y forman esa bicapa. Despus se
pueden introducir protenas y ver como
interactan con el sistema.

LIPOSOMAS
Los liposomas se clasifican segn el nmero
de lamelas y el tamao, lo que implica que
sean accesibles para algunos tipos de tcnicas
o que su preparacin sea ms laboriosa. Cada
una tiene diferentes funciones.
La primera que se emple para intentar
suministrar drogas que no eran solubles en
agua fueron las vesculas multilamelares
(MLV), aunque tenan un inconveniente y es
que son difciles de transportar y de liberar el
frmaco porque tienen muchos equilibrios.
Luego se pas a liposomas unicelulares pequeos (SUV) (hasta 50nm). Estos se consiguen por
sonicacin de los MLV. Los SUV atraviesan muy bien los vasos sanguneos, tienen un interior
suficientemente grande para transportar las drogas y es ms fcil que suministren los
frmacos a diferentes concnetraciones.
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Por ltimo tenemos los liposomas unicelulares grandes (LUV), estos se preparan con la prensa
de French, y despus para obtenerlos se provoca un cambio de T en nitrgeno lquido a alta
presin y los pasamos por dos filtros con un tamao de poro muy definido. La mejor poblacin
es la de 100nm ya que es la ms homognea (99%).
Aun as los LUV son demasiado pequeos para la microscopa confocal, por lo que existen
liposomas unicelulares gigantes, que se consiguen con una tcnica parecida a la
electroporacin.
Los
GUVs
son
vesculas
unilamelares gigantes que tienen
el tamao celular. Eso se
consigue por tcnicas similares a
la electroporacin; empleando
una pipeta de succin, que
succiona vesculas. En medios
con calcio si juntamos dos
vesculas, no se producir fusin;
mientras que si tenemos medio
sin calcio (sacarosa), cuando hay
alguna protena de por medio se dar la fusin.
//Blebs, son evaginaciones de la membrana debido
a la carencia de citoesqueleto.
//Fantasmas de eritrocitos: es un mtodo de
formacin de bicapas con composicin diferente a
cada lado de la bicapa. Para ello tomamos un
eritrocito, lo lisamos y dejamos que se reselle la
membrana. Segn la concentracin de Mg que
aadamos, se cerrarn como son originalmente
(inside-in) o al revs (inside-out).

BICAPA PLANA APOYADA

En esta tcnica tenemos una base de cuarzo o
slice, donde colocamos unos grupos para poder
inmovilizar una parte de la membrana.

BICELAS Y NANODISCOS

Las bicelas tienen dos componentes, lpidos y detergentes, los cuales son muy suaves,
tambin se pueden emplear lpidos en los cuales una de las cadenas es corta y la otra larga.
Para la tcnica de RMN las protenas de membrana necesitan un n mnimo de interacciones
hidrofbicas, es por eso que las protenas se rodean de estas bicelas.

NANODISCOS
Muchas veces el empleo de micelas y vesculas nos es insuficiente para conseguir resolucin
de canales o protenas de alto peso molecular por resonancia magntica nuclear. Es por ello
que se emplean agregados lipdicos rodeados de un cinturn de protenas que nos permite la
insercin de la protena en el nanodisco; de manera que lo podamos estudiar por ambos lados
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sin problemas de resolucin. Las protenas, por

tanto, apantallarn las interacciones hidrofbicas
de los lpidos con el agua. Un ejemplo tpico es el
uso de apolipoprotenas, que tienen esa
estructura.

PATCH CLAMP
En electroscopa el Patch Clamp es una tcnica
de laboratorio que permite el estudio individual
o mltiple de canales inicos. Esta tcnica
puede ser aplicada en una amplia variedad de
clulas, pero es especialmente til en el estudio
de clulas excitables como las neuronas
cardiomiocitos, fibras musculares y clulas
pancreticas beta.
La grabacin en la fijacin de membrana usa
una micropipeta como electrodo que tiene una
punta abierta de cerca de un micrmetro de
dimetro, un tamao que encierra un rea
superficial que a menudo contiene uno o pocos
canales inicos moleculares.

VARIACIONES
Algunas variaciones pueden ser aplicadas
dependiendo de lo que el investigador quiera
estudiar, las tcnicas inside-out y outsideout se llaman membrana extirpada ya que la
membrana es removida de la superficie
principal de la clula. Las tcnicas de agrupacin de clulas y membrana extirpada son
usadas para estudiar el comportamiento de canales inicos individuales en la seccin de la
membrana unida al electrodo.

ESPECTROSCOPIA

DE FORMA ATMICA
La EFA es una tcnica de resolucin atmica que
nos permite analizar la estructura de molculas a
niveles de resolucin muy altos. Para ello,
empleamos una punta unida a un cantilver que
cada vez que pasa por una estructura, la barrita se
eleva de modo que ese movimiento puede
registrarse con un lser (la distancia del cantilver
al variar hace que la reflexin del laser vare, y que
esta variacin se registre en el detector).
Esta tcnica puede combinarse con fluorescencia
para observar, por ejemplo, balsas lipdicas o
protenas.