GRADO EN FILOSOFA ONLINE

Biologa
(Tema 5)

Carmen Fagoaga
carmen.fagoaga@ucv.es

er

Curso

2015-2016

PREGUNTAS CON RESPUESTAS

Biologa

Tema 5. Tecnologa del DNA recombinante

A) Lo que vamos a ver

5.1. Primeros experimentos
5.2 Clonacin. Esquema general
5.3 Elementos bsicos
5.4 Mtodos de clonacin
5.5 Clonacin en bacterias
5.5.1. Tipos de vectores
5.5.2. Mtodos de transformacin
5.6 Aplicaciones

Biologa

5.1. Primeros experimentos

Veamos esquemticamente algunos eventos esenciales para entender el surgimiento
de la tecnologa del ADN recombinante:
A partir de 1865, Mendel establece las bases de la gentica. En sus famosos
experimentos con el guisante, descubri el modo de transmisin de ciertos
caracteres desde una generacin a las siguientes, y su "mezcla" en el aporte
materno y paterno.
Los hallazgos de Mendel permanecieron en el olvido hasta 1900. En 1909 se
acua el trmino "gen" (o gene) para referirse a la entidad hipottica
responsable de los rasgos observables.
Pero la naturaleza del material gentico fue objeto de polmicas durante
mucho tiempo, hasta que entre los aos 40 y primeros 50 una serie de autores
(Avery y colaboradores, Hershey y Chase, etc.) establecen firmemente que el
material de la herencia reside en el cido desoxirribonucleico.
En los 40 y 50 se produce, en efecto, un "desembarco" de fsicos y
cristalgrafos en el abordaje de cuestiones biolgicas. Es la poca del
florecimiento de tcnicas como la difraccin de rayos X, la ultracentrifugacin y
la cromatografa.
En 1951 un joven bilogo estadounidense, James Watson, llega al laboratorio
Cavendish de la Universidad de Cambridge, para pasar una estada
postdoctoral. All se une al ingls Francis Crick, y 18 meses ms tarde (primavera
de 1953) publican en la revista Nature su modelo tridimensional de la doble
hlice del ADN. Con ello se abra en principio una nueva manera de estudiar la
base gentica de los seres vivos: de dentro (genotipo) a fuera (fenotipo), al
revs de lo que se vena haciendo desde Mendel.
A continuacin se abre un decenio llamado a menudo la "Edad de Oro de la Biologa
Molecular", que pone las bases de la comprensin de los procesos bsicos de la herencia
y de la expresin gentica:

El "Dogma Central" de la Biologa Molecular:

unidireccionalmente en sentido ADN -> ARN -> protena.

la

informacin

fluye

El desciframiento del cdigo gentico: el lenguaje del ADN consta de "palabras" de

tres letras (nucletidos), llamadas codones. Cada codn tiene un equivalente en el
lenguaje de la protena, significando uno de los 20 aminocidos. Existen 64
codones, de los cuales tres carecen de sentido: no tienen equivalente aminocido,
y sirven como seales de parada de la traduccin del mensajero.

Pero aparte de estos avances bsicos, a finales de los aos 60, segua pendiente de
plasmacin una de las expectativas abiertas por el descubrimiento de la estructura del
ADN: cmo llegar a "tocar" el ADN?, cmo estudiar cada gen por separado, aislndolo
fsicamente de los dems?, cmo determinar su secuencia de bases?
Cuando los cientficos comprendieron la estructura de los genes y cmo la informacin
que portaban se traduca en funciones o caractersticas, comenzaron a buscar la forma de

Biologa

aislarlos, analizarlos, modificarlos y hasta de transferirlos de un organismo a otro para

conferirle una nueva caracterstica. Justamente, de eso trata la Ingeniera Gentica, que
se podra definir como:
Un conjunto de metodologas que permite transferir genes de un organismo a otro y
expresarlos (producir las protenas para las cuales estos genes codifican) en organismos
diferentes al de origen. El ADN que combina fragmentos de organismos diferentes se
denomina ADN recombinante. En consecuencia, las tcnicas que emplea la ingeniera
gentica se denominan tcnicas de ADN recombinante.
Los primeros experimentos de este tipo que se llevaron a cabo fueron:
1. Fusin de dos plsmidos diferentes de E. coli
Primeras molculas de DNA recombinante. Experiencias de Stanley Cohen y
Herbert Boyer en la Universidad de California. (Cohen et
al., 1972.)
2. Fusin de dos plsmidos de especies bacterianas distintas
(E. coli y Staphilococus aureus).
3. Introduccin de un DNA eucaritico en un plsmido
( plsmido de E. coli + DNA de Xenopus)
Se vi que era factible hacer toda clase de experimentos en
los que se recombina ADN de organismos totalmente diferentes
(bacterias, plantas, animales). Con el fin de poner restricciones
a la clonacin de ADN, en 1975 se celebr una reunin de ms
de cien bilogos moleculares internacionalmente reconocidos en Asilomar (California) y
se lleg al acuerdo de que slo se deba clonar ADN en organismos que hubieran sido
daados genticamente de forma que no pudieran vivir bien fuera del tubo de ensayo.
Esto nos lleva ya a la idea de lo que es la Ingeniera Gentica: la formacin in vitro de
nuevas combinaciones de material gentico, por medio de la insercin de un ADN de
inters en un vehculo gentico (vector), de modo que tras su introduccin en un
organismo que hospeda el ADN hbrido (recombinante) se pueda multiplicar, propagar, y
eventualmente expresarse.
Los experimentos de DNA recombinante se definen como aquellos que implican
molculas que consisten en diferentes segmentos de DNA unidos en sistemas libres de
clulas, y que tienen capacidad para infectar y replicarse en algunas clulas
hospedadoras, ya sea autnomamente o como parte integrada del genoma del
hospedador.
Dentro del mbito de la Ingeniera gentica, qu es un clon?
Clon: son clulas o colonias bacterianas descendientes e idnticas a una clula original
y por lo tanto tienen la misma composicin gentica. El concepto de clon puede ir
ligado, o no a las tcnicas del DNA recombinante.

Biologa

5.2. Clonacin. Esquema general

Qu es la clonacin?
La clonacin (del griego , "retoo, rama") puede definirse como el proceso por el
que se consiguen, de forma asexual copias idnticas de un organismo, clula o molcula
ya desarrollado.
Si nos referimos al
mbito de la Ingeniera
Gentica, clonar es aislar y
multiplicar en un tubo de
ensayo un determinado
gen o, en general, un
trozo de ADN. Es decir
llamamos
clonacin gnica al
procedimiento por el cual
se introduce un gen o un
fragmento de DNA en una
clula hospedadora
donde se multiplicar
cuando la clula se divide.

5.3. Elementos bsicos

Para estudiar los genes los bilogos tenan que ser capaces de aislarlos uno a uno a
partir del cromosoma, que es demasiado grande para su manipulacin inmediata. Pero
cmo hacerlo?. Todava no se haban descubierto nucleasas especficas capaces de cortar
en puntos determinados del ADN para generar fragmentos discretos y homogneos. Fue
precisamente el descubrimiento diversas enzimas en bacterias y virus el que abri
definitivamente el camino hacia la manipulacin del ADN. A comienzos de los aos 70
cuando se descubrieron las siguientes enzimas:
Endonucleasas de restriccin: enzimas bacterianas que reconocen secuencias
especficas del ADN, y cortan la cadena cada vez que esta secuencia aparece. Existen
endonucleasas de restriccin que cortan el ADN en diferentes puntos
ADN ligasas: enzimas que pegan fragmentos de ADN.

Biologa

Las enzimas de restriccin, conocidas tambin como endonucleasas, slo cortan el ADN
si reconocen en su interior una secuencia especfica de nucletidos. Estas enzimas fueron
descubiertas en microorganismos. De hecho, se encuentran slo en organismos
procariotas (bacterias).
Por esto, se les dio una
nomenclatura asociada al
organismo de donde
provienen. Por ejemplo,
las enzimas de restriccin
que se descubrieron en la
bacteria Escherichia coli se
denominan Eco. Existen
diferentes
tipos
de
enzimas Eco que se
diferencian
en
la
secuencia que reconocen
y
cortan.
Para
diferenciarlas
se
les
agregan letras y nmeros
romanos, por ejemplo:
Eco RI (Eco erre uno).
As, el sitio de restriccin
para EcoRI es la secuencia GAATTC, como muestra la ilustracin anterior. Una vez que la
enzima encontr ese sitio en el ADN, se acerca a la hebra de ADN y realiza el corte entre la
G y la A. Al investigar otras especies de bacterias se descubrieron cientos de enzimas de
restriccin distintas y cada una reconoce una regin especfica.
Se cree que la funcin natural de estas enzimas en las bacterias es protegerlas contra
ADN de virus que podran ingresar en sus clulas. De esta manera, la bacteria utiliza estas
tijeras moleculares para cortar en pedacitos el ADN viral que la infecta. El ADN propio
de la bacteria no se corta, pues lo tiene protegido contra sus propias enzimas de
restriccin.
Las enzimas son protenas que cumplen una funcin esencial en el metabolismo
celular: son catalizadores biolgicos (aceleradores de reacciones qumicas) que hacen
posible que las reacciones se lleven a cabo en un tiempo adaptado a las necesidades
vitales del organismo. Entre sus caractersticas fundamentales se encuentra la de ser
especficas, es decir que cada tipo de enzima acta sobre un sustrato particular o una
secuencia particular de una molcula, y no sobre otra. Esta especificidad enzimtica
resulta fundamental en la actividad de las enzimas de restriccin que cortan secuencias
particulares y determinadas del ADN.
Resumiendo, las enzimas de restriccin son protenas cuya funcin es cortar las hebras
de ADN. Esa secuencia especfica para cada enzima se denomina sitio de restriccin.
Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se posiciona sobre la molcula de ADN y
corta dentro o en torno de esa secuencia.

Biologa

Vamos a ilustrar el concepto de la ingeniera gentica con el caso bastante fcil de

lograr bacterias que hospeden nuevas combinaciones de ADN:
Partimos de ADN que queremos aislar y estudiar.
Por otro lado, necesitamos un vehculo gentico para transportar y replicar ese
ADN: lo llamamos vector. Los vectores son igualmente molculas de ADN con capacidad
de replicarse por s mismos o de insertarse una vez que se introducen en el organismo
adecuado.
He aqu una lista de lo que debe poseer idealmente un vector gentico:
capacidad de replicacin autnoma, o de integracin en el genoma del
hospedador.
Marcadores seleccionables: se trata de genes que confieren algn rasgo
que se puede rastrear o seleccionar fcilmente en el laboratorio. Unos de
los ms usados son los genes que confieren resistencia a algn antibitico.
Finalmente, contamos con el organismo anfitrin o husped.
As, pues, el "retrato robot" de un experimento de Ingeniera Gentica podra ser como
sigue:
1. Se corta por separado el ADN del organismo a estudiar y el ADN del vector con la
misma restrictasa, de modo que se generan extremos compatibles entre s (mutuamente
cohesivos).
2. Se juntan ambos ADNs y se les aade ADN-ligasa: de esta forma, las uniones entre
ADN a clonar y ADN
del vector se sellan
covalentemente,
generndose
molculas
hbridas
(quimricas
o
recombinantes).
3. Ahora hay que
introducir
las
molculas generadas
en
el
organismos
husped. En el caso de
bacterias se recurre a
una tcnica sencilla
denominada
transformacin, que
permite la entrada del
ADN a travs de las
envueltas
del
microorganismo.
4. Finalmente, hay
que
localizar
las
bacterias que han
captado
y
han

Biologa

establecido establemente las molculas hbridas. A menudo este es el paso ms

laborioso, pero el hecho de que el vector posea uno o varios genes de resistencia
favorece al menos la eliminacin de las bacterias que no han recibido ADN del vector:
basta aadir al medio de cultivo el antibitico para el que el vector confiere resistencia.
Para localizar los transformantes recombinantes, muchos vectores incorporan un gen
marcador que produce alguna sustancia coloreada. Si insertamos el gen a aislar dentro de
ese marcador, lo rompemos, por lo que las colonias bacterianas no producirn la
sustancia coloreada, sino que permanecen incoloras o blancas.
5. El resultado del experimento es la obtencin de al menos una colonia (clon) de
bacterias que portan la combinacin buscada de vector con el inserto de ADN pasajero.
Se dice entonces que hemos clonado (=aislado) dicho ADN.

5.4. Mtodos de clonacin

Acorde a como las endonucleasas de restriccin realizan el corte de las cadenas del DNA,
la clonacin se puede llevar a cabo de dos formas:
Clonacin en romo: empleando enzimas que generan extremos romos (blunt
ends).
Clonacin en cohesivo: empleando enzimas que generan extremos cohesivos
(sticky ends). Estos extremos colgantes de simple cadena pueden pegarse
con otros extremos de cadena simple que tengan la secuencia complementaria.
Como se ha comentado anteriormente las enzimas encargadas de unir los extremos de
ambas cadenas de DNA se denominan ligasas. Por ejemplo, la ligasa de ADN del fago T4:
permite la unin covalente de ADNs de orgenes diferentes previamente cortados con la
misma enzima de restriccin o con enzimas que generan el mismo tipo de extremos.

El
siguiente esquema resume los tipos de clonaje ms frecuentes y sus interconexiones:

Biologa

Tipos de clonaje

5.5. Clonacin en bacterias

5.5.1. Tipos de vectores
Un vector de clonacin es una molcula de DNA estable que se replica y a la que puede
unirse un fragmento de DNA extrao para ser introducido en una clula. Dicho vector
puede manipularse e introducirse fcilmente en una bacteria, fago o clula eucariota
donde puede replicarse y generar un gran nmero de copias. Los Vectores de clonacin
en bacterias pueden ser de varios tipos:

Vectores plasmdicos

Son los ms empleados y existe un gran nmero de ellos. El tamao mximo del
inserto (fragmento de DNA que se quiere clonar) es de entre 10-15 kilobases (Kb). El
tamao del DNA se mide en pares de bases (1Kb=1000 pares de bases).
Se caracterizan por ser de pequeo tamao, y por contener genes de resistencia a
antibiticos (que son los marcadores de seleccin) lo que permite seleccionar la clulas
que contienen el vector plasmdico. Adems tienen sitios de clonacin nicos donde se
inserta el fragmento de DNA a clonar. Su origen de replicacin asegura que se
multipliquen dentro de la clula producindose un alto nmero de copias por bacteria.

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Algunos ejemplos ms comunes son:

pBR322: con dos genes de resistencia a antibiticos con dianas nicas para algunas
enzimas de restriccin. La insercin de un ADN forneo se evala viendo la sensibilidad a
uno de los antibiticos.
pUC19: con un gen de resistencia a ampicilina para seleccionar eventos de
transformacin. Dispone de un polilinker (secuencia con mltiples dianas nicas de
enzimas de restriccin).

Vectores derivados del bacteriofagos lambda ()

Los bacterifagos (virus de bacterias) pueden actuar como vehculos naturales en
la transduccin (transferencia de DNA mediada por
virus) de DNA bacteriano. Los vectores ms
conocidos derivan del fago de Escherichia coli.
Estos fagos se insertan en el cromosoma bacteriano
de E. coli por recombinacin. Se caracterizan por
una elevada eficiencia de transferencia y porque
pueden albergar insertos de unas 20 kb. Contiene
genes que no son esenciales para su supervivencia,
los cuales pueden ser sustituidos por el DNA
forneo a clonar. Hay vectores de dos tipos: de
insercin y de reemplazamiento o sustitucin.

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Vectores de expresin
Como
su
nombre
indica
permiten sintetizar el producto
proteico del gen clonado. Es
decir producen la protena en la
clula hospedadora.

5.5.2. Mtodos de transformacin

Los mtodos ms comunes para introducir el ADN en bacterias son:
a)Transformacin
Por mtodo del choque trmico por calor tras incubacin en Cl2Ca
Por el mtodo de Electroporacin: aplicando una descarga elctrica
b) Infeccin

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5.6. Aplicaciones
El mbito de aplicacin de la tecnologa del DNA recombinante es muy amplio. Sus
aplicaciones responden a fines muy variados (investigacin bsica, fines mdico-forenses,
comercialesetc, entre otros).

En este tema estudiaremos con ms detalle dos de las aplicaciones ms importantes

actualmente destinadas a la salud humana, como son la obtencin de protenas
recombinantes con fines teraputicos y la obtencin de vacunas recombinantes.
Protenas recombinantes
En ingeniera gentica o tecnologa del ADN recombinante, se utilizan diferentes
enzimas (ya estudiadas, ver apartados anteriores) para cortar y aislar un gen determinado
-que tiene informacin para fabricar una protena particular- e introducirlo en las clulas
de un organismo distinto del inicial. En consecuencia, este organismo tendr ADN
recombinante a partir del cual fabricar una nueva protena. A la protena producida a
partir de ADN recombinante se la denomina protena recombinante.
La recombinacin de genes humanos en el ADN de bacterias es una de las
posibilidades que ofrece la ingeniera gentica, y que posibilita obtener protenas
humanas con fines medicinales. Por ejemplo, la insulina humana obtenida a partir de la
bacteria Escherichia coli. Esta tcnica es de gran valor porque las bacterias se reproducen
rpidamente y pueden duplicar su nmero cada 20 minutos. De esta forma se pueden
obtener en poco tiempo muchas copias del gen humano inserto en el ADN bacteriano y
producir grandes cantidades de protenas recombinantes.
A escala industrial, la produccin de protenas recombinantes involucra las siguientes
etapas:
Fermentacin: las bacterias son cultivadas en tanques sellados (fermentadores) que
contienen un medio de cultivo nutritivo.

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Extraccin: las clulas son centrifugadas para recuperar las protenas de su interior.
Purificacin: se separa la protena recombinante de las otras protenas bacterianas.
Formulacin: la protena recombinante es modificada para conseguir una forma estable
y estril que puede administrarse teraputicamente.
Cada una de las fases de la elaboracin implica un manejo muy cuidadoso de los
materiales y un estricto control de calidad para optimizar la extraccin, la pureza, la
actividad y la estabilidad del frmaco. Dependiendo del producto y del tipo de clula
utilizada, la produccin de protenas recombinantes puede ser un proceso simple o ms
complejo. Aunque la complejidad del proceso aumentara el costo final del producto, el
valor nunca sobrepasar al gasto de aislar el compuesto desde su fuente original (por
ejemplo, obtencin de insulina a partir de pncreas de porcinos o bovinos) para llegar a
cantidades medicinales.
El caso de la insulina humana
La insulina es una hormona producida por el pncreas. Tiene una estructura proteica y
su funcin consiste en regular la concentracin de glucosa en la sangre. Sin la insulina, la
glucosa se acumula en la sangre hasta que alcanza niveles elevados y puede causar
diferentes complicaciones en el funcionamiento del organismo. Esta es la enfermedad
conocida como diabetes. Cuando la diabetes es causada por una escasa o nula produccin
de insulina, se puede regular el nivel de glucosa en la sangre (glucemia) mediante la
administracin exgena de insulina.

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Biologa

En 1921, los fisilogos canadienses Frederick G. Banting y Charles H. Best extrajeron por
primera vez la insulina del tejido pancretico de perros, y en 1923 la insulina estaba
comercialmente disponible en los Estados Unidos. Luego, la insulina para diabticos se
obtuvo a partir de pncreas de cerdos o vacas, que aunque es biolgicamente activa en
humanos, no es idntica a la humana, de modo que se pueden producir algunos
problemas de reacciones inmunes adversas.
La insulina es el primer caso de protena producida por ingeniera gentica aprobada
para uso en humanos, desde 1982. La insulina humana biosinttica, es idntica en todos
los aspectos a la insulina purificada del pncreas humano. En la actualidad, varios
laboratorios farmacuticos producen insulina humana, tanto a partir de bacterias como
de levaduras, y sin ningn riesgo para la salud.
En la figura anterior, se muestra un esquema general de la obtencin de insulina a
partir de pncreas de vacas o cerdos, y mediante ingeniera gentica.
Vacunas recombinantes
Desde que en 1796, el mdico ingls Edward Jenner descubriera la primera vacuna
contra la viruela, un nmero considerable de vacunas han sido utilizados con gran xito
para el control de muchas enfermedades. Sin embargo, este tipo de vacunas,
denominadas vacunas clsicas, pueden presentar algunas limitaciones tales como la
aparicin de efectos secundarios y complicaciones posteriores a la vacunacin.
Aunque las vacunas clsicas se consideran seguras, y por tal motivo se siguen
aplicando a la poblacin de todo el mundo, la ingeniera gentica ha permitido avanzar en
este campo de la medicina mediante la creacin de una nueva generacin de vacunas que
reducen o eliminan los inconvenientes que presentan las vacunas clsicas.
Las vacunas activan el sistema inmunolgico. La respuesta inmune protege al cuerpo
contra los agentes extraos, entre ellos algunos causantes de enfermedades. Pero
existen algunas enfermedades de riesgo contra las cuales el organismo no tiene una
respuesta efectiva. Contra estas enfermedades se han desarrollado vacunas. Las vacunas
constituyen un mtodo preventivo, mediante el cual el individuo adquiere inmunidad
permanente contra algn agente patgeno especfico.
Las vacunas son preparadas a base del agente que causa la enfermedad, pero en un
estado no patognico. stas pueden estar constituidas por el agente causante de la
enfermedad vivo pero atenuado (disminuido en su capacidad de desencadenar la
enfermedad), por el agente patgeno muerto, o por sus fracciones (antgenos). Con la
administracin de la vacuna se desarrolla la respuesta
inmune, un mecanismo complejo en el que
intervienen clulas especializadas de la sangre
(linfocitos B y T) que son capaces de reconocer el
agente extrao y responder a su presencia. Una vez
eliminado el agente suministrado con la vacuna, el
organismo conserva clulas activadas (linfocitos
memoria) que reaccionan rpida y eficientemente
ante la exposicin futura al mismo tipo de germen o
toxina (en su estado natural) antes de que puedan
causar dao. Es decir que las vacunas obligan al
sistema inmune a construir una defensa, y de esta

Biologa

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forma evitan la enfermedad.

Dentro de las vacunas tradicionales, se encuentran:

Vacunas de Virus vivos atenuados (debilitados): emplean microorganismos vivos

cuya virulencia es disminuida o atenuada por sucesivos pasajes en animales de
experimentacin. De esta manera, los microorganismos son seleccionados por
crecer preferentemente en clulas animales y muy lentamente en clulas
humanas. Por eso, no provocan la enfermedad en los individuos vacunados
aunque son capaces de inducir una fuerte y duradera inmunizacin. En el grupo de
las vacunas atenuadas se incluyen las de la viruela, sarampin, paperas, rubola,
varicela ..etc.
Vacunas de Virus o bacterias muertos (inactivados): la inactivacin de los
microorganismos patgenos se realiza mediante el tratamiento con calor o
sustancias qumicas como formaldehdo. De esta manera, estas vacunas son ms
seguras y ms estables frente a los cambios de temperatura que las anteriores. En
este grupo se encuentran las vacunas contra la rabia, polioetc.

Si bien son muy eficaces, las vacunas tradicionales presentan algunas dificultades ya
que no todos los microorganismos se pueden cultivar en el laboratorio, la produccin a
menudo es cara, se requieren medidas muy estrictas para asegurar la completa
inactivacin o la atenuacin adecuada de la cepa.
En todo el mundo, desde principios de la dcada de 1980, laboratorios y cientficos
investigan el desarrollo de nuevas vacunas que, se espera reemplazarn en un futuro a las
vacunas tradicionales. Estas nuevas vacunas son producidas por ingeniera gentica,
basadas en la molcula de ADN y en las secuencias de aminocidos que contienen la
informacin gentica con la cual el organismo patgeno produce la enfermedad, y su
primer exponente fue la vacuna contra la hepatitis B. Las investigaciones se centran en
mejorar las vacunas ya existentes para lograr respuestas inmunitarias ms eficaces,
nuevas vas de administracin, y en la aplicacin de vacunas combinadas (varias vacunas
en una sola dosis) para reducir el nmero de inyecciones.
El descubrimiento y decodificacin de los genomas de bacterias y virus patgenos
llevados a cabo en los ltimos aos, ha abierto una enorme esperanza en el desarrollo de
estas nuevas vacunas.
stas pueden clasificarse de la siguiente manera:
Vacunas atenuadas: mediante tcnicas de ingeniera gentica, se pueden eliminar
los genes de virulencia de un agente infeccioso manteniendo la habilidad de provocar una
respuesta inmune. En este caso, el organismo modificado genticamente puede usarse
como una vacuna viva sin riesgo a que revierta al tipo virulento. En el caso de Salmonella
se ha ensayado quitarle ciertos genes que aunque no estn relacionados con la virulencia,
al desaparecer convierten a la cepa en atenuada (disminucin de su virulencia en un
milln de veces). Se ha demostrado su efectividad en ovejas, bovinos, pollos y, ms
recientemente en humanos.

Vacunas vectores o de organismos recombinantes vivos: utilizan microorganismos

no patgenos (virus o bacterias) a los cuales se les incorporaron, mediante ingeniera
gentica, genes de agentes patgenos que codifican para los antgenos que

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desencadenan la respuesta inmune. El virus vacunal es uno de los vectores

recombinantes ms utilizados en este tipo de vacunas, ya que tiene un genoma amplio,
totalmente secuenciado, y que permite acomodar varios genes forneos en su interior.
De esta manera, se ha desarrollado una vacuna contra la rabia al insertar en el genoma
de este virus, un gen del virus rbico, la cual provoca la respuesta inmune en el
organismo hospedador. Tambin se han ensayado las expresiones de genes que
codifican para antgenos de virus de la hepatitis B, de la gripe y del herpes simple.

El paramyxovirus es una familia de virus que incluye agentes de enfermedad comunes como
sarampin, paperas y parainfluenza. La estructura genmica de estos virus es tal que se le podran
insertar genes adicionales (coloreado en rojo en la figura) que codificase una amplia variedad de
protenas de fuentes diferentes. As el virus del sarampin ofrece varias ventajas como portador
de genes que provoquen respuesta inmune contra otras enfermedades al mismo tiempo. Con
tecnologas recombinantes se hace posible extender el rango de enfermedades contra las que
una sola cepa atenuada del virus puede conferir inmunidad.

Vacunas de subunidades: para aquellos agentes infecciosos que no se pueden

mantener en cultivo, se pueden aislar los genes que codifican para las protenas que
provocan la respuesta inmune (por ejemplo, las protenas de las cpsulas de los virus).
Mediante tcnicas de ingeniera gentica, esos genes se pueden clonar y expresar en un
husped alternativo tales como bacterias (Escherichia coli), levaduras (Saccharomyces
Cerevisiae) o lneas celulares de mamferos. Luego de insertado el gen de inters, la
bacteria o levadura recombinante comienza a producir subunidades de protenas en
grandes cantidades, las cuales son recolectadas y purificadas para utilizarlas como
vacunas. La vacuna contra la hepatitis B fue la primera vacuna puesta en el mercado
producida por este mtodo. Esta vacuna se desarroll aislando el gen del virus que
codifica para la protena (antgeno) llamada HBsAg que provoca respuesta inmune. El gen
que produce esta protena se introdujo por ingeniera gentica en levaduras
(Saccharomyces Cerevisiae). El antgeno se produce a altos niveles en grandes
fermentadores, de modo seguro. En la actualidad, se est avanzando en vacunas de
subunidades frente al virus del herpes simple (HSV) y la fiebre aftosa.

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Vacuna de ADN desnudo

En este tipo de vacunas se utiliza directamente
una porcin del ADN purificado que contenga el gen
de la protena que produce la respuesta inmune.
Esta fraccin de ADN (coloreado en rojo) se inserta
en un plsmido. Las clulas del paciente vacunado
captan ese plsmido y lo incorporan en su ncleo,
permitiendo la expresin del gen forneo y
produciendo la protena recombinante. Esta
protena es secretada al exterior de la clula, por lo
cual el sistema inmune puede reconocerla de la
misma manera que durante una infeccin natural,
induciendo una respuesta inmune. Son las vacunas
en experimentacin que suscitan ms expectativa
Actualmente, se estn realizando ensayos de varias
vacunas de este tipo -para la malaria y el SIDA.
Muchas de estas investigaciones se encuentran
en fase de desarrollo en el laboratorio y, aunque se estima que la mayor parte comenzar
a dar sus frutos dentro de 10 aos, el impacto de estas nuevas tecnologas evitar, segn
datos de UNICEF, la muerte de 8 millones de nios por ao en todo el mundo.
[Texto plano. Negrita, Candara 12. especial en primera lnea 0,5 9]

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B) Practicamos lo visto
1. El DNA puede ser fragmentado por enzimas conocidas como:
a)
b)
c)
d)

polimerasas
enzimas de restriccin
anticuerpos
enzimas de fragmentacin

2. Las pequeas cadenas simples de DNA que sobresalen en ambos lados de un

fragmento de restriccin se denominan:
a)
b)
c)
d)

extremos isosquizmeros
extremos romos
extremos cohesivos
extremos de ligacin

3. El hbrido formado por DNAs de distintos organismos se denomina:

a)
b)
c)
d)

DNA secuencial
DNA clnico
DNA recombinante
ninguna de los anteriores

4. La electroporacin es un mtodo para introducir DNA en clulas mediante la

utilizacin de corriente elctrica
a) Verdadero
b) Falso
5. Sita en el esquema (usando las letras) los siguientes elementos, reactivos o tcnicas:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)

DNA cromosmico
DNA recombinante
inserto
vector (plsmido)
enzima de restriccin
ligasa
electroporacin

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6. Determinar si cada una de las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas:

a) La ingeniera gentica se denomina tambin "Tecnologa de ADN
recombinante.
b) La ingeniera gentica incluye tcnicas que permiten la obtencin de un
gran nmero de copias de genes de inters.
c) Las endonucleasas de restriccin son protenas.
d) Las endonucleasas son enzimas exclusivas de los virus.
e) Las ligasas se utilizan para cortar el ADN en regiones especficas.
f) La insulina es una protena.
g) La insulina es una hormona.
h) La insulina recombinante se puede producir en bacterias
i) Actualmente, la insulina recombinante se produce a partir del gen de la
insulina de cerdo introducido en bacterias.
j)

Actualmente, la insulina recombinante se produce a partir del gen de la

insulina humana introducido en bacterias.

k) La ventaja de producir protenas recombinantes consiste en que se

producen en mayor cantidad y a menor costo que si se extrajeran
directamente desde su fuente de origen.

Biologa

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7. Completa los espacios en blanco del texto utilizando los siguientes trminos:

Insulina recombinante humana

Diabticos
Escherichia coli
Plsmido bacteriano
Insulina humana
Insulina
ADN
ADN humano
Cerdos
En 1972 se llev a cabo el primer clonaje de un gen. Para realizarlo, los cientficos
utilizaron tres componentes: la bacteria ______________, un plsmido, que es un
fragmento de ADN circular ubicado dentro de la bacteria, y el _____de un humano. Qu
realizaron con esto? Los cientficos lograron tomar un fragmento del ______________ e
insertarlo dentro del ___________________. Luego, introdujeron esta construccin
dentro de E. coli para que sta, al multiplicar su material gentico, produjera millones de
veces la copia del gen insertado.
Esto fue la gran revolucin de la biotecnologa en los aos ochentas. Aos ms tarde,
se aplic esta nueva tcnica al gen de la ___________________, obteniendo la protena
que ese gen codificaba. Y no slo los cientficos estaban contentos con su
descubrimiento. Los ms favorecidos fueron los ____________, porque a ellos les falta
___________ y hasta ese momento tenan que aplicarse la insulina que se extraa del
pncreas de los __________. El problema era que un porcentaje de personas era sensible
a
este
medicamento
y
presentaban
reacciones
de
rechazo.
La
_________________________no presenta ese problema y la calidad de vida mejor para
esos enfermos.
8. Las vacunas recombinantes estn constituidas por:
a) Plsmidos en los que se introduce la pequea fraccin del material gentico
del patgeno contra el que se pretende inmunizar
b) Subunidades de protenas del patgeno producidas en bacterias o
levaduras
c) Las 2 respuestas anteriores son correctas
9. Al final de la tcnica del DNA recombinante, es necesario proceder a la deteccin o la
seleccin de los clones recombinantes. Para ello, se hace uso de la presencia de un
gen especial en el plsmido que permite dicha deteccin o seleccin. Qu puedes
comentar al respecto?

Biologa

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C) Debes recordar
o El descubrimiento de las enzimas (endonucleasas de restriccin) que cortan el
DNA por lugares especficos, junto con las enzimas que unen segmentos de DNA,
(ligasas) dio a los bilogos la posibilidad de trasladar genes de un lugar a otro.
o La ingeniera gentica se basa en insertar genes de un organismo en otro. Las
manipulaciones gnicas suelen producir combinaciones nuevas de genes en los
cromosomas, o recombinacin gentica. Por este motivo, a las tcnicas utilizadas
en ingeniera gentica a menudo se las denomina tecnologa del DNA
recombinante.
o Para analizar un gen, los bilogos tienen que conseguir muchas copias idnticas
de este. Esto se puede hacer insertando el gen en una clula bacteriana que copia
el gen a medida que crece o realizando una reaccin en cadena de la polimerasa.
o Clonar un gen significa que dicho gen ha sido aislado y que se han producido
muchas copias idnticas del mismo.
o Los elementos bsicos en la ingeniera gentica bacteriana son: las endonucleasas
de restriccin (para fragmentar y modificar el DNA); las DNA ligasas (para unir los
extremos romos o cohesivos del DNA fragmentado); los vectores de clonacin
(molculas de DNA adecuadas para la transferencia y propagacin del DNA
recombinante) y clulas bacterianas hospedadoras del DNA recombinante (en las
cuales se multiplicar dicho DNA).
o El mbito de aplicacin de la tecnologa del DNA recombinante en bacterias es
muy amplio.
o Dos de las aplicaciones actuales ms importantes son la obtencin de protenas
recombinantes con fines teraputicos y la obtencin de vacunas recombinantes.

Biologa

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o La ventaja de producir protenas recombinantes para uso teraputico consiste en

que se producen en mayor cantidad y a menor costo que si se extrajeran
directamente desde su fuente de origen.
o La insulina recombinante es el primer caso de protena producida por ingeniera
gentica, aprobada para su uso en humanos desde 1982. Actualmente se produce
y se comercializa insulina humana mediante ingeniera gentica, a partir tanto de
bacterias como de levaduras y sin ningn riesgo para la salud.
o Los actuales diseos de diversos tipos de nuevas vacunas recombinantes
permiten inactivar selectivamente los genes del patgeno no deseados
implicados en la virulencia lo que garantiza su seguridad y estabilidad, eliminando
los posibles riesgos de introducir microorganismos vivos atenuados.

23

Biologa

D) Para saber ms
Cohen, S., Chang, A., Boyer, Hof., Helling, R. (1973): Construction of biologically functional
bacterial plasmids In Vitro. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 70, pg. 3240-3244.
Cohen, S. (1975): The manipulation of genes. Scientific American, pg. 25-33 (Traducido en:
Bases Moleculares de la vida. Captulo 43. pg. 470-479)
Covarrubias, L., Cervantes, L., Covarrubias, A., Soberon, X., Vichido, I., Blanco, A.,
Kupersztoch-Portnoy, Y.M. and Bolivar, F. (1981): Construction and
characterization of new cloning vehicles. V. Mobilization and coding properties of
pBR322 and several deletion derivatives including pBR327 and pBR328. Gene 13, pg.
25-35
Curtis H., Barnes N.S., Schnek A., and Flores G. (2006): Invitacin a la Biologa. Sexta
edicin. Editorial Panamericana, Buenos Aires
Freeman, S. (2010): Fundamentos de Biologa. Tercera edicin. Pearson Education S.A.,
Madrid
Izquierdo M. (1999): Ingeniera gentica y transferencia gnica. Editorial Pirmide,
Madrid
Morcillo, G. y Portela I. (2010): Biologa bsica. Editorial Sanz y Torres, Madrid
Nathans, D. (1979): Restriction Endonucleases, Simian Virus 40, and the new genetics.
Science 206, pg. 903-909.
Nathans, D., and Smith, H.O. (1975). Restriction endonucleases in the analysis and
restructuring of DNA molecules. Annual Review of Biochemistry 44, pg. 273-293
Perera, J. Tormo, A. y Garca J.L. (2010). Ingeniera gentica, Preparacin, anlisis,
manipulacin y clonaje de DNA. Volumen I. Captulos 5, 9, 10, 11 y 12. Editorial
Sntesis, Madrid
Smith, H.O. (1979). Nucleotide sequence specificity of restriction endonucleases. Science
205, pg. 455-462
Watson, J.D., Tooze, J. and Kurtz, D.T. (1988): ADN recombinante, Introduccin a la
ingeniera gentica. Primera edicin. Editorial Labor S.A., Barcelona
Wong, D.W.S. (1997): The ABCs of gene cloning. International Thomson Publishing, New
York

Biologa

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E) Glosario
antibitico
Sustancias que evitan o retrasan el crecimiento de los microorganismos. Se los
emplea en el tratamiento de las enfermedades infecciosas y como agentes de
seleccin en procesos de transformacin gentica.
frmaco
Droga, medicamento.
glucosa
Monosacrido (azcar) de seis carbonos que constituye la principal fuente de
carbono de las clulas. Los polmeros de glucosa, como el almidn y el
glucgeno, son usados para almacenar energa en las clulas vegetales y
animales, respectivamente.
Kilobases (Kb)
Unidad empleada para medir la longitud, en nmero de bases nitrogenadas,
que tiene un fragmento de cido nucleico. Cuando se trata de un fragmento de
ADN de cadena doble, se habla de Kpb o kilopares de bases. 1 Kb = 1.000 bases.
hospedador/a
En ingeniera gentica, clula u organismo que se emplea para la expresin de
uno o ms genes heterlogos (de otro origen). En parasitologa, organismo
sobre (o dentro de) el cual vive un parsito.
in vitro
Del latn literalmente "en el vidrio", se usa para indicar experimentos (una
reaccin o proceso) realizados fuera de un organismo vivo o fuera del organismo
de origen. Lo contrario de in vivo.

Biologa

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marcador gentico (o gen marcador)

Segmento de ADN cuya herencia se puede rastrear. Puede ser un gen o un
segmento sin funcin conocida. Dado que las secuencias de ADN que se
encuentran contiguas en un cromosoma tienden a heredarse juntas, los
marcadores se usan como herramientas para rastrear el patrn hereditario de
genes que an no han sido identificados, pero cuyas ubicaciones aproximadas se
conocen.
nucleasa
Enzima capaz de cortar o degradar cidos nucleicos.
pares de bases
Dos bases nitrogenadas (timina y adenina o citosina y guanina) que se unen
por puentes de hidrgeno en la molcula de ADN.
patgeno
Organismo que causa una enfermedad.
plsmido
Porcin de ADN circular que puede mantenerse como elemento
extracromosomal en bacterias u otras clulas. Lleva pocos genes y no es
indispensable para el crecimiento y sobrevida de la clula hospedadora. Los
plsmidos pueden transferirse de un organismo a otro, por eso se usan en
ingeniera gentica como vectores de clonado y expresin.
respuesta inmune
Conjunto de mecanismos que se inducen en un organismo como respuesta a
la presencia de un antgeno.
transduccin
Transferencia de genes desde un organismo a otro mediante un virus.
transfeccin
Introduccin de ADN forneo en clulas animales.

Biologa

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transformacin
Modificacin permanente y heredable de una clula como resultado de la
incorporacin de ADN forneo (cuando se trata de clulas animales, se emplea el
trmino "transfeccin" en lugar de transformacin).

Biologa

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F) Autoevaluacin
1. Cules de los siguientes se utilizan como vectores de clonacin?
a. bacterifagos
b. virus
c. plsmidos
d. todos los anteriores

2. La enzima que cataliza la unin de las cadenas azcar-fosfato en un DNA

recombinante es:
a. ligasa
b. enzima de restriccin
c. vector
d. todos los anteriores

3. Las pequeas molculas de DNA circular con capacidad autoreplicativa se conocen como:

a. cromosomas
b. lpidos
c. genes
d. plsmidos
4. La transferencia de DNA al interior de las clulas de plantas se denomina:
a. transveccin
b. transmigracin
c. clonacin
d. transformacin

Biologa

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5. En presencia de un antibitico es menos probable que crezcan clulas bacterianas

que contienen un plsmido con un gen que confiere resistencia a dicho antibitico
que las bacterias sin el plsmido.
a. Verdadero
b. Falso

6. Se denominan vacunas tradicionales a las obtenidas mediante:

a. el empleo de organismos genticamente modificados
b. el empleo de microorganismos patgenos causantes de la enfermedad
muertos o debilitados
c. la administracin de clulas infectadas de pacientes enfermos

7. Algunas desventajas que presentan las vacunas tradicionales son:

a. aplicacin del microorganismo vivo, y sus posibles efectos secundarios (como
por ejemplo el revetir a una cepa virulenta)
b. se necesita conocer el genoma del organismo patgeno causante de la
enfermedad
c. a pesar de ser ms seguras, las vacunas de microorganismos muertos poseen
una efectividad inferior respecto a las de organismos vivos atenuadas

8. Las vacunas recombinantes atenuadas estn constituidas por:

a. Microorganismos patgenos cuya virulencia ha sido atenuada al eliminar los
genes de virulencia de un agente infeccioso manteniendo la habilidad de
provocar una respuesta inmune
b. Subunidades de protenas del patgeno producidas en bacterias o levaduras

Biologa

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Respuestas correctas del test de autoevaluacin:

Pregunta

Respuesta correcta

1
2
3
4
5
6
7
8

d)
a)
d)
d)
b)
b)
a) y c)
a)