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Professeur : Douadi Nabil

TP n..

Les colorants
Extraction, sparation, identification et synthse

I / Extraction des pigments contenus dans une feuille


Y a-t-il un seul pigment (la chlorophylle) dans une feuille ou dautres sont-ils prsents ?
Quelles sont prcisment les radiations lumineuses utiles la photosynthse ?
1) RALISATION DUNE SOLUTION DE CHLOROPHYLLE BRUTE.
Protocole exprimental :

Placer dans un mortier un peu de sable, ajouter quelques feuilles bien vertes (pinards par
exemple) coupes en petits morceaux.
Broyer sec les feuilles (destruction des parois cellulaires)
Ajouter trs peu dalcool 90 pour solubiliser certaines substances et continuer broyer
doucement pendant 5 minutes
Dans un bcher, verser la solution contenue dans le mortier.
La solution obtenue est dite chlorophylle brute .

2) SPARATION DES PIGMENTS DE LA CHLOROPHYLLE BRUTE : LA CHROMATOGRAPHIE


Protocole exprimental

Sur une bande de papier chromatographie (papier Wattman) dposer une distance
denviron 2 cm du bas une dizaine de gouttes de solution de chlorophylle brute en laissant
scher aprs dpt chaque goutte.
Attention ne pas toucher le papier sur la zone de migration

Suspendre le papier chromatographie laide dun crochet fix sur un bouchon, dans une
prouvette ferme contenant 5 mL dluant (ther de ptrole 85 %, actone 10 %, cyclohexane 5%).
Vrifier que la tache ne baigne pas dans lluant.
Placer un cache opaque autour de lprouvette durant toute llution.
Stopper llution quand lluant arrive environ 1 cm du bord suprieur.
Questions
a) Rappeler le rle dune chromatographie.
b) Pourquoi le dpt ne doit-il pas tremper dans lluant ?
c) Faire un schma annot lchelle du chromatogramme obtenu.
d) Combien de pigments contient la solution de chlorophylle brute ? Justifier.
3) ABSORBANCE DE LA SOLUTION DE CHLOROPHYLLE
Principe du spectrophotomtre :
Un spectrophotomtre est un appareil qui permet de dterminer pour diffrentes longueurs donde la
proportion de lumire absorbe par une solution.
Nous allons raliser le spectre dabsorption A = f() de la chlorophylle brute, c'est--dire tracer la
courbe de labsorbance de la solution de chlorophylle en fonction de la longueur donde de la lumire.

Observer le spectre dabsorption de chacun des pigments de la chlorophylle brute :

a) Expliquer pourquoi la chlorophylle nous apparat de couleur verte.


b) Expliquer la couleur du carotne.
c) Conclure en rpondant aux questions poses au dbut de la partie I/.

II / Chromatographie sur colonne dun sirop de menthe


La technique de chromatographie sur colonne repose sur le mme principe que la chromatographie sur couche
mince : les espces chimiques sparer sont plus ou moins entranes par un luant sur une phase fixe :
- La phase fixe est un solide, le plus souvent de la silice ou de lalumine remplissant une colonne ;
- Lchantillon est dpos en haut de la colonne. La sparation des espces chimiques est obtenue par lcoulement
continu dune phase mobile (lluant) travers la colonne ;
La sparation est base sur une diffrence de vitesses dentranement des espces chimiques vers le bas de la colonne.
Lobjectif de ce TP est donc de sparer les constituants colors dun sirop de menthe puis de montrer lintrt de la
chromatographie sur colonne vis vis de la chromatographie sur couche mince.
1.

Sparation des colorants alimentaires dun sirop de menthe


Prparation de la colonne (phase fixe)

Lopration de remplissage de la colonne conditionne lefficacit de la sparation. Il ne faut pas quil y ait de bulles ou de
zone sans phase stationnaire car on aurait alors des chemins prfrentiels nuisant une bonne sparation des composs.
Pendant la phase dlution avec le solvant on veillera galement ne pas asscher la partie suprieure de la phase fixe.

Fixer verticalement la colonne laide dune pince ;

Dposer un petit morceau de coton dans le bas de la colonne ;

Confectionner un entonnoir trs effil laide dun morceau de papier

A laide celui-ci, introduire la silice dans la colonne ; il ne doit pas se former de bulles dair !

Placer un bcher sous la colonne ;

Introduire doucement de leau distille ( laide dune pipette plastique par


coulement de long de la paroi de la colonne). Ajouter une quantit deau suffisante
pour tre environ 2 cm au dessus de la surface plane de la silice.

silice

coton

Dpt de lchantillon sparer


Dposer trs doucement laide dune pipette, sans toucher les parois de la colonne, lchantillon de sirop de menthe
(5 10 gouttes)
Lorsque le sirop de menthe a pntr la surface de la phase stationnaire, luer avec leau en remplissant la
colonne ;
Lorsque le premier colorant arrive en bas de la colonne le rcuprer dans une premire cuve pour
spectrophotomtre ;
Eluer ensuite avec un autre luant : lthanol;
Lorsque le second colorant parvient en bas de la colonne, le rcuprer dans une seconde cuve.

Quel est lintrt de ce type de chromatographie par rapport celle sur couche mince ?
2.

Analyse spectrophotomtrique des colorants

A laide dun spectrophotomtre, on souhaite tracer les spectres dabsorption A=f() du sirop de menthe et des 2 colorants
issus de la sparation prcdente.
Raliser ces spectres.
Interprter les courbes obtenues : quel(s) colorant(s) contient le sirop de menthe ?.

Donnes : Spectres dabsorption de quelques colorants


Spectre dabsorption du bleu patent V
1 mg pour 100 mL eau

Spectre dabsorption du jaune de tartrazine


2 mg pour 100 mL eau

III / Synthse de lindigo

Dans un erlenmeyer de 125 mL, verser 0,20 g de 2-nitrobenzaldhyde, 4 mL dactone et 10 mL deau distille.

Agiter trs vivement laide dun agitateur magntique.

Ajouter lentement 1 mL de solution de soude.

Attention : La soude est prpare par dissolution de 8 g de soude en pastille dans 100 mL deau. Il faut porter
gants et lunettes pour manipuler cette solution.

La solution passe de la couleur jaune fonc une couleur plus sombre. Lindigo prcipite.

Aprs quelques minutes, filtrer sur Bchner.

Laver le prcipit avec de leau jusqu ce que le filtrat soit incolore.

Laver avec 5 mL dthanol. Laisser scher le solide ou le passer ltuve vers 120C.

1. Quels sont les dangers lis la soude ?


2. Quelle est la concentration molaire de la solution de soude utilise ?
3. Quelle est la couleur de lindigo obtenue ?
4. Lindigo est-il soluble dans leau ?
5. Sachant quune mole de 2-nitrobenzaldhyde permet dobtenir, avec la quantit suffisante dactone en
milieu basique, deux moles dindigo, quelle masse dindigo peut-on esprer obtenir ?

6. En dduire le rendement de la synthse.

1re S
TP n4

CORRECTION

Les colorants
Extraction, sparation, identification et synthse

I / Extraction des pigments contenus dans une feuille


Y a-t-il un seul pigment (la chlorophylle) dans une feuille ou dautres sont-ils prsents ?
Quelles sont prcisment les radiations lumineuses utiles la photosynthse ?
2) SPARATION DES PIGMENTS DE LA CHLOROPHYLLE BRUTE : LA CHROMATOGRAPHIE
Questions
a) Rappeler le rle dune chromatographie.

Une chromatographie permet de sparer et didentifier les constituants dun mlange homogne.
b) Pourquoi le dpt ne doit-il pas tremper dans lluant ?

Si le dpt trempait dans lluant il serait dissous par celui-ci et ne pourrait


pas migrer sur la phase fixe (le papier)
c) Faire un schma annot lchelle du chromatogramme obtenu.
Carotne

Xanthophylle
Chlorophylle a

Chlorophylle b

d) Combien de pigments contient la solution de chlorophylle brute ? Justifier.

La chlorophylle brute contient 4 pigments.

3) ABSORBANCE DE LA SOLUTION DE CHLOROPHYLLE


Observer le spectre dabsorption de chacun des pigments de la chlorophylle brute :

a) Expliquer pourquoi la chlorophylle nous apparat de couleur verte.

Les spectres dabsorption montrent que les 2 types de chlorophylle absorbent les couleurs bleue
et rouge. La lumire transmise est donc verte.
b) Expliquer la couleur du carotne.

Le carotne absorbe le bleu. Lil peroit alors la


couleur complmentaire (mlange de vert et de rouge
qui ne sont pas absorbs). On voit alors une nuance de
jaune-orang.
c) Conclure en rpondant aux questions poses au
dbut de la partie I/.

Il y a 4 pigments dans une feuille.


Les radiations utiles la photosynthse sont celles qui
sont absorbes par la chlorophylle : (430, 445, 645 et
663 nm)

II / Chromatographie sur colonne dun sirop de menthe


Quel est lintrt de ce type de chromatographie par rapport celle sur couche mince ?

La chromatographie sur couche mince (CCM) permet de sparer les constituants dun mlange et
de les identifier (par comparaison avec des substances connues quon fait migrer en mme temps
que lchantillon analyser ou par mesure du rapport frontal et comparaison avec les RF de
substances connues). En revanche on ne peut pas rcuprer les constituants du mlange aprs
sparation.
La chromatographie sur colonne permet la sparation mais pas lidentification directe des
constituants du mlange. On peut en revanche recueillir des quantits non ngligeables des
constituants afin de raliser des analyses ensuite.
3.

Analyse spectrophotomtrique des colorants

A laide dun spectrophotomtre, on souhaite tracer les spectres dabsorption A=f() du sirop de menthe et des 2 colorants
issus de la sparation prcdente.
Raliser ces spectres.

Fraction jaune

Fraction bleue

sirop brut

Spectre dabsorption du bleu patent V


1 mg pour 100 mL eau

Spectre dabsorption du jaune de tartrazine


2 mg pour 100 mL eau

Interprter les courbes obtenues : quel(s) colorant(s) contient le sirop de menthe ?

Le colorant jaune contenu dans le sirop de menthe est de la tartrazine (les spectres se superposent)
Le colorant bleu est du bleu patent. (on remarque quils nont pas t parfaitement spars)

400
400

650
650

BBT

Remarque : dautres colorants jaune et bleu existent avec des spectres qui se ressemblent mais qui ne
sont pas superposables.
III / Synthse de lindigo

Dans un erlenmeyer de 125 mL, verser 0,20 g de 2nitrobenzaldhyde, 4 mL dactone et 10 mL deau distille.
Agiter trs vivement laide dun agitateur magntique.

Ajouter lentement 1 mL de solution de soude.

Attention : La soude est prpare par dissolution de 8 g de soude en pastille dans 100 mL deau. Il faut porter
gants et lunettes pour manipuler cette solution.
1. Quels sont les dangers lis la soude ?

La soude est une substance corrosive.


2. Quelle est la concentration molaire de la solution de soude utilise ?

Par dfinition,
Do

n 0,2

V 0,1

n
V

or

n(NaOH)

m(NaOH)
8

M (NaOH) 40

= 0,20 mol.

= 2,0 mol.L-1.

3. Quelle est la couleur de lindigo obtenue ? Bleu fonc (utilis pour les jeans)
Lindigo est-il soluble dans leau ? Non. Sil tait soluble dans leau (ou lthanol) on ne pourrait pas

utiliser ces solvants pour effectuer le rinage des cristaux sur le filtre Buchner.
L'quation de la raction s'crit :

2 C7H5NO3(l) + 2 C3H6O(l) + 2 HO(aq) C16H10N2O2(s) + 2 CH3CO2 (aq) + 4 H2O(l)


4. Sachant que 2 moles de 2-nitrobenzaldhyde permettent dobtenir, avec la quantit suffisante
dactone en milieu basique, 1 mole dindigo, quelle masse dindigo peut-on esprer obtenir ?

On donne les masses molaires : 2-nitrobenzaldhyde : 151 g.mol-1 ; indigo : 262 g.mol-1.
n(NBA)

m(NBA) 0,2

0,0013 mol = 1,3.10 -3 mol


M (NBA) 151

1,3.10
La quantit de matire dindigo espre sera de n(indigo)
2

6,6.10 4 mol

Soit une masse de : m(indigo) n( indigo ) M ( indigo ) 6,6.10 4 262 0,17 g


5. En dduire le rendement de la synthse.
r

m(Produit obtenu)
m(Produit espr)