PROYECTO DE INVESTIGACIN

EFECTOS DE LA PROTENA bcl-2 SOBRE LOS PARMETROS

DE ENVEJECIMIENTO CELULAR EN FIBROBLASTOS DE
PULMN DE RATONES VIEJOS.

ALUMNA: RIVERA MARTNEZ LIDIA PAOLA

ASESOR: MINA KONIGSBERG FAINSTEIN.

2003-I

INDICE
1. INTRODUCCIN..3
1.1 ENVEJECIMIENTO CELULAR..3
1.2 PROLIFERACION CELULAR Y SENESCENCIA REPLICATIVA...4
1.3 LA PROTENA Bcl-2..6
1.4 CONTENIDO DE LA PROTENA Bcl-2 EN LOS
ORGANISMOS ENVEJECIDOS.8
2. JUSTIFICACIN....9
3. HIPTESIS..9
4. OBJETIVO GENERAL..9
4.1OBJETIVOS PARTICULARES..10
5. METODOLOGA....11
5.1 OBTENCION DEL CULTIVO PRIMARIO..11
5.2 SOBREEXPRESION DE LA PROTENA Bcl-212
5.3 OBTENCION DE LOS PLSMIDOS..13
5.4 CO-TRANSFECCIN.18
5.5 NFECCIN20
6. SEMBRADO DE CLULAS PARA LAS DETERMINACIONES
A LO LARGO DEL TIEMPO DE CULTIVO.21
7. PARMETROS DE ENVEJECIMIENTO.23
7.1 PROLIFERACIN CELULAR..23
7.2 FUNCIONALIDAD CELULAR.23
7.3 CUANTIFICACIN DE LA SENESCENCIA EN LAS CLULAS
DE CULTIVO PRIMARIO24
8. RESULTADOS26
9. DISCUSION Y CONCLUSION33
10. REFERENCIAS36
11. AGRADECIMIENTOS.38

Efecto de la protena Bcl2 sobre los parmetros de

envejecimiento celular en cultivos primarios de fibroblastos
de pulmn de ratones viejos.
1. INTRODUCCIN
1.1 ENVEJECIMIENTO CELULAR
El proceso de envejecimiento es un fenmeno biolgico complejo e
inevitable, que se relaciona con la prdida o el decaimiento de varias
funciones bioqumicas, estructurales y fisiolgicas del organismo que
conducen a la morbilidad y a la mortalidad. (Kirkwood, 1989).
Existen varias hiptesis que tratan de explicar el envejecimiento, sin
embargo, ninguna de ellas explica todas las causas del fenmeno. Al
parecer el envejecimiento es un proceso multifactorial controlado por una
combinacin de factores genticos y ambientales. Por ejemplo, las
hiptesis moleculares proponen que la duracin de la vida de cualquier
especie est gobernada por genes que interactan con los factores
ambientales. Las hiptesis sistmicas atribuyen el envejecimiento de todo
un organismo, al decremento de la funcin de un sistema clave, como
puede ser el nervioso, el endcrino o el inmunolgico. Las teoras celulares
del envejecimiento, relacionan los cambios en la estructura y en la funcin
de las clulas al paso del tiempo, bajo la influencia de factores
ambientales. (Timiras, 1997).
En 1956, Harman propuso la hiptesis del envejecimiento por radicales
libres, basada en el deterioro celular, la cual dice que el envejecimiento
resulta de los efectos nocivos generados por los radicales libres que se
producen en el curso del metabolismo celular normal y que son acumulados
a lo largo de toda la vida de un organismo .
Los radicales libres son molculas que tienen uno o ms electrones
desapareados y se producen continuamente en el metabolismo aerbico de

manera normal, o de manera exgena por la radiacin ionizante y

sustancias qumicas. Los radicales libres pueden daar las clulas a
diferentes niveles (ADN, protenas, membranas, etc.). Sin embargo, existen
mecanismos de defensa en las clulas ante el dao que ellos producen.
Tales mecanismos constan de molculas antioxidantes y/o atrapadores de
radicales libres.
De acuerdo con la hiptesis de Harman, las clulas que provienen de
animales viejos deben haber acumulado mayor dao al ADN en
comparacin con las clulas provenientes de animales jvenes. En la
actualidad esta hiptesis es aceptada y apoyada por una gran cantidad de
cientficos, ya que explica muchos de los cambios degenerativos asociados
con el envejecimiento (Melov, 2000), y cuenta con evidencia experimental.
(Liu, et. al., 1999).
1.2 PROLIFERACION CELULAR Y SENESCENCIA REPLICATIVA
Hasta la mitad del siglo pasado se pens que las clulas en cultivo se
dividan indefinidamente si las condiciones del medio permanecan
optimas (Carrel, 1912). Sin embargo, los experimentos realizados por
Hayfilck y Moorehead en 1961, trabajando con fibroblastos humanos,
demostraron que despus de un nmero finito de divisiones celulares, las
clulas dejan de dividirse y entran en una fase que se conoce como
senescencia replicativa. En 1995 se tuvo la primera evidencia directa de
la existencia de clulas senescentes in vivo en dermis de humano,
utilizando un ensayo histoqumico para

-galactosidasa (Dimri, et al.

1995). La caracterstica primordial de este estado, es que cesa totalmente

la proliferacin celular, an ante estmulos mitognicos. Sin embargo, las
clulas se mantienen metabolitamente activas y detenidas de manera
irreversible en la fase G0 o G1 del ciclo celular (Lunderberg, et al.2000;
Chen, et al. 2000). Las clulas senescentes muestran cambios selectivos
en la expresin gnica. Este cambio les da un fenotipo alterado que es
4

dependiente del tipo celular (Campisi, 1997). Cabe aclarar que la

senescencia slo se observa en organismos pluricelulares y en clulas que
tienen potencial para el recambio (Faragher et al. 2000). Por el aumento de
las clulas senescentes encontradas al final de la vida de los cultivos,
Hayflick propuso que la senescencia puede contribuir al envejecimiento en
el organismo. Para tratar de explicar la existencia de las clulas
senescentes, se ha sugerido un mecanismo de antagonismo pleiotrpico
(un efecto que proporciona un beneficio a corto plazo y un dao a ms
largo plazo) (Campisi, 1997), que dice que la aparicin lenta de estas
clulas desde el inicio de la vida, protege al organismo de desarrollar un
cncer u otra alteracin. Al incrementarse la edad del organismo, aumenta
la presencia de las clulas senescentes, esto modifica el microambiente
celular y por tanto la funcin de las clulas no senescentes. Este estado
alterado puede contribuir al envejecimiento y al desarrollo del cncer.
Se ha propuesto que la senescencia replicativa pueda deberse, a que en
cada duplicacin celular los telmeros se van acortando y ello da lugar a
que exista una sealizacin celular que indique el cese en la duplicacin
(Hayflick, 1977). Se han estudiado muchos tipos celulares de diferentes
especies de animales y se ha determinado el lmite replicativo en cada
caso. As mismo, se ha reportado que in vivo, el fenmeno de senescencia
replicativa se lleva a cabo de una manera similar a la que se describi para
los cultivos primarios, por lo que se piensa que en un tejido in vivo pueden
convivir clulas senescentes y presenescentes al mismo tiempo (Campisi,
1997).
Se ha demostrado que algunas enzimas dependientes del ciclo celular,
como por ejemplo las protenas p21, p16 y p53 entre otras, muestran
actividades disminuidas o sobre reguladas (Chen et al., 2000). Esto podra
estar relacionado con el hecho de que al entrar en senescencia, las clulas
se quedan detenidas en la fase G1 del ciclo celular (Lundberg et al., 2000).
Se ha sugerido que la senescencia de las clulas normales puede
contribuir al envejecimiento en el organismo in vivo (Hayflick, 1997),
5

debido a que el fenmeno de envejecimiento involucra una serie de

procesos que incluyen factores internos y externos que daan a la clula, y
esta como respuesta a dichos daos puede entrar en senescencia. Esto
ltimo, es un proceso inevitable en los seres vivos, ya que existe una
disminucin en las funciones fisiolgicas que conducen a la muerte
(Kirkwood, 1989). El hecho de que las clulas senescentes tengan sus
funciones alteradas conduce a un deterioro gradual que se relaciona con el
envejecimiento.
1.3 LA PROTENA Bcl-2
La protena Bcl-2, se identifica como una protena reguladora de la
apoptosis (muerte celular programada).

Se ha observado que cuando

forma homodmeros presenta funcin antiapopttica, mientras que cuando

forma heterodmeros con la protena proapopttica Bax, promueve la
apoptosis (Reed, 1997).
La protena Bcl-2 fue descubierta en linfomas de clulas B en folculo
humano, en la translocacin intercromosomal t (14 y 18) que yuxtapone el
de gen bcl-2 con el locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina (Ig)
(Warner, et al. 1997), (McDonell, et al. 1989). Tiene un peso molecular de
26 KDa, 205 aminocidos (Bcl-2b) o 239 aminocidos (Bcl-2a), y su
extremo amino terminal es hidrofbico por lo que se encuentra anclada en
la membrana mitocondrial, nuclear y del retculo endoplsmico (Bakhshi
et al. 1985), con orientacin hacia el citosol (Hockenbery, 1993).
Adems de su papel antiapptico, se sabe que protege ante el estrs
oxidativo, aunque el mecanismo por el cual lo hace no es bien conocido. Se
ha propuesto que su efecto sea prooxidante, antioxidante y/o de
reparacin.
Existen varios investigadores que se han encargado del estudio de esta
protena, aunque an hay controversias al respecto. Por mencionar a
6

algunos, tenemos que en el ao de 1993, Hockenbery reporto un papel

regulador para Bcl-2 en la va antioxidante en los sitios donde son
generadas las especies reactivas de oxgeno (ERO) (Hockenbery, 1993). En
ese mismo ao, Kane, propuso que el producto del protooncogene bcl-2,
fuera una molcula antiapopttica, ya que observ una reduccin en la
produccin de los intermediarios reactivos de oxgeno (Kane, et. al. 1993).
Sin embargo, Steinman en el mismo ao, estudiando clulas B en una
lnea murina de cultivos transfectados con bcl-2, encontr que exista
generacin de especies reactivas de oxgeno que inducan una respuesta
antioxidante por lo que l propuso que la funcin de Bcl-2 fuera
prooxidante (Steinman, 1993).
La funcin antioxidante de Bcl-2 fue apoyada por Myers en 1995, ya que
observ que confera

proteccin a cultivos de clulas neuronales en

cuanto a la lipoperoxidacin membranas plasmticas (Myers, et. al. 1995).

Un ao despus, Richter en 1996 propuso, que Bcl-2 podra ser un vnculo
entre el sistema de defensa antioxidante, el Ca2+ y el potencial de
membrana (Richter et. al; 1996). En 1997 Longo public datos que
apoyaban la actividad antioxidante de Bcl-2, ya que reportaban un
aumento en la enzima catalasa en Saccharomyces cerevisiae, cuando se
sobreexpresaba bcl-2 (Longo et. al., 1997). En 1998 Hochman, trabajando
con animales knockout de bcl-2 encontr que en el cerebro de este tipo de
ratones, haba protenas oxidadas en mayor proporcin que en animales
que podan expresar esta protena, por lo que sus resultados mostraron
una elevacin en el estrs oxidativo y niveles alterados de antioxidantes,
sugiriendo que Bcl-2 incrementa la produccin de ERO (Hochman et. al.,
1998). En 1999, se puso en auge la investigacin de dicha protena, por lo
que Degli report resultados que sugeran que Bcl-2 incrementa las
defensas antioxidantes y neutraliza la sobreproduccin de molculas que
estimulan la muerte celular como TNF- o ceramida (Degli, 1999). Por su
parte, Esteve observ que Bcl-2 inhiba la apoptosis en ausencia de
productos reactivos de oxgeno lo que indica multifuncionalidad de esta
7

molcula (Esteve, et. al; 1999). Por ltimo, Deng reporto que Bcl-2 est
tambin involucrado en la regulacin de la expresin o funcin de enzimas
de reparacin, adems que poder evitar rompimientos de las hebras del
ADN (Deng, et. al; 1999).
Todo lo anterior demuestra que an no se tiene claro el mecanismo de
accin de Bcl-2, por lo que es importante entender la relacin entre
envejecimiento y apoptosis. El conocer los mecanismos del dao oxidativo
al ADN y la participacin antioxidativa de Bcl-2, son crticos para la
comprensin de los mecanismos involucrados en las enfermedades
asociadas con el envejecimiento celular, como son las enfermedades
neurodegenerativas
Alzheimer,

de

enfermedades

Parkinson,

Huntintong,

cardiovasculares

como

esclerosis
la

lateral,

ateroesclerosis,

disminucin del sistema inmune (por la muerte de linfocitos T), cncer,

etc. (Warner, et al, 1997). Por lo que es importante encontrar un
tratamiento para tales enfermedades, debido a que son poco conocidos los
mecanismos por los cuales la protena Bcl-2 protege al ADN y su relacin
con el envejecimiento celular.
1.4 CONTENIDO DE LA PROTENA Bcl-2 EN LOS ORGANISMOS
ENVEJECIDOS
Se han realizado pocos estudios para determinar la presencia de la
protena Bcl-2 en tejidos de mamferos. En 1994 Migheli y colaboradores
reportaron un aumento en la expresin de la protena Bcl-2 en cerebros
envejecidos de rata, y propusieron que el incremento puede ser el reflejo de
un mecanismo de proteccin contra las ERO. (Migheli, 1994)
En otros estudios, se compararon linfocitos humanos de individuos
jvenes (menos de 35 aos) y de individuos viejos (ms de 60 aos) y se
encontr una correlacin entre el aumento en la expresin de Bcl-2 y la
edad avanzada del paciente (Schindowski et al. 2000).
8

En trabajos previos del laboratorio se ha encontrado que Bcl-2 aumenta

con la edad en pulmn de ratn de la cepa CD1.

2. JUSTIFICACIN
El poder emplear el modelo in vitro de cultivo primario de fibroblastos de
ratn proporciona una herramienta til que permite obtener informacin
valiosa

permitiendo

tener

conocimiento

sobre

los

mecanismos

del

envejecimiento y la relacin de este con la senescencia celular as como el

comportamiento de los mismos mediante la sobreexpresin de la protena
Bcl-2. Estos conocimientos permitirn una mejor comprensin para
desarrollar tratamientos especficos en las enfermedades relacionadas al
envejecimiento e incluso el cncer, debido a que el fenmeno de
senescencia es considerado como un mecanismo para la supresin de
tumores (Campisi, 1997).
3. HIPTESIS
Si la sobreexpresin de la protena Bcl-2 retrasa la entrada a la
senescencia en las clulas de cultivo primario, se espera encontrar
un aumento en la funcionalidad y proliferacin de dichas clulas en
comparacin con las que no sobreexpresen Bcl-2.

4. Objetivo General.
v Determinar el efecto de la sobre-expresin de la protena Bcl2 sobre
los parmetros de envejecimiento celular en fibroblastos de pulmn
de ratones viejos.

4.1 Objetivos Particulares.

v Realizar cultivos primarios de pulmones de ratones viejos de la cepa
CD1.
v Preparar

partculas

que

contengan

la

informacin

para

sobreexpresar bcl2, mediante la tcnica de cotransfeccin de fosfato

de Ca2+ de los plsmidos PCLNRX-GFPN, PCLNRX-GFPN-Bcl2 y pclEco a clulas empaquetadoras 293 T.
v Infectar los cultivos primarios con las partculas virales para que
sobre-expresen bcl2.
v Determinar microscpicamente la presencia del plsmido infectado,
gracias a la fluorescencia de la protena reportera GFP.
v Cuantificar la presencia de la enzima

-galacatosidasa como

parmetro de senescencia.
v Cuantificar la funcionalidad mitocondrial de las clulas infectadas y
control, mediante la tcnica de MTT.
v Medir la proliferacin de las clulas infectadas y control.

10

5. METODOLOGA
5.1 OBTENCION DEL CULTIVO PRIMARIO
Para este estudio, se utiliz como modelo experimental el cultivo primario
de fibroblastos de pulmn de ratn, que se ha reportado como un modelo
adecuado

para

el

estudio

de

dicho

fenmeno

(Campisi,

2000).

Primeramente se establecieron los cultivos primarios, para lo cual se

utilizaron ratones hembras de pie de cra provenientes de la cepa CD-1 de
12 meses de edad. Los animales mostraban un fenotipo envejecido como lo
es la falta de tono muscular, cada de pelo, acumulacin de grasa y en
alguno de ellos, la aparicin de tumores.
1.

Todos los ratones fueron sacrificados mediante dislocacin mduloenceflica.

2.

Los pulmones se extrajeron mediante incisin torxica.

3.

El de pulmn se coloc en cajas Petri estriles que contenan 25ml

de PBS que es una solucin amortiguadora libre de fosfatos
(Sigma), con 1% de antibitico antimictico (Gibco).

4.

El tejido se lav 2 veces con la solucin anterior, aspirando el PBS

con una jeringa para evitar la perdida del tejido. Se disgreg el
tejido con un bistur y unas pinzas, lo ms finamente posible.

5.

Se quito el PBS y se agregaron 5ml de tripsina-EDTA 0.25% (Sigma)

y se meti a la incubadora por 10min, a 37 C.

6.

La tripsina fue aspirada con una jeringa. Se lav 2 veces ms el

tejido con la solucin de PBS y aspirando el PBS con una jeringa,
para evitar la perdida de tejido.

7.

Los fragmentos del tejido se transfirieron a tubos Falcon que

contenan 7ml de colagenasa 1.A (Sigma) al 0.03% en Medio
Esencial Mnimo modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma) sin
suero fetal bovino (SFB).

8.

Los tubos se colocaron en la incubadora a 37 C durante 60 min.

11

9.

Pasado ese tiempo, se le agreg a cada tubo 30ml de DMEM

suplementado con 15% de suero fetal bovino inactivado (SFB)
(Hyclone).

10. La suspensin se homogeniz vigorosamente utilizando una pipeta

de vidrio.
11. La suspensin

celular se distribuy homogneamente en cajas

Petri de 60mm de dimetro.

12. El

establecimiento

de

las

primeras

clulas

(cuando

stas

permanecieron viables y adheridas al sustrato), fue entre 4 y 6 das

despus de la obtencin del cultivo.
13. Los cultivos se mantuvieron en una atmsfera con 5% de CO2 y
90% de humedad a 37 C de temperatura.
14. El medio se cambi cada 3 o 4 das, durante el tiempo de vida del
cultivo.

5.2 SOBREEXPRESION DE LA PROTENA Bcl-2

Para lograr la sobreexpresin de la protena Bcl-2 en los cultivos primarios
de fibroblastos de pulmn de ratn, se utiliz un vector retroviral, se
introdujo un gen no viral (bcl-2) y el gen de una protena fluorescente (gfp),
que permite observar la insercin del gen en nuestros cultivos.
Para ello, primero se amplificaron los plsmidos de inters, posteriormente
se realiz una cotransfeccin de dichos plsmidos en las clulas
empaquetadoras 293T. A partir de las cuales se obtuvieron las partculas
virales para infectar a los cultivos primarios.

12

5.3 OBTENCION DE LOS PLSMIDOS

Se amplificaron 3 plsmidos: PCLNRX-GFPN, que contiene la informacin
para la protena verde fluorescente (GFP); PCLNRX-GFPN-Bcl2, que
adems de contener a la protena GFP, tambin contena el gen que
codifica para la protena Bcl-2; y el plsmido pclEco que contiene la
informacin estructural para la cpside del virus.

1. Transformacin:
Se transformaron bacterias E.coli de la cepa Mn522 y DH5

con los

plsmidos antes mencionados.

La insercin del plsmido en las bacterias se logr a travs de choque
trmico.
1. Para ello se prendi el bao a 42 C.
2. Se prepararon 2 tubos falcon de 15ml estriles con 20 l de agua
estril, se agreg 1 l de plsmido.
3. Las bacterias fueron resuspendidas con cuidado y se agreg 100l
de bacterias a cada tubo y se resuspendi todo, esta mezcla fue
incubada en hielo por 10 minutos.
4. Posteriormente se mantuvieron a 42 C de 30 a 60 segundos.
5. Pasado ese tiempo se adiciono 1ml de medio LB sin bactoagar (medio
LB: 1L de agua, 10g de triptona, 5g de NaCl, 5g de extracto de
levadura y 1ml de NaOH 1N), para hacer crecer las bacterias, en
agitacin a 37 C durante 1 o 2 horas.
6. Se prepararon dos placas de medio LB con bactoagar, (medio LB con
bactoagar: 1L de agua, 15g de bactoagar, 10g de triptona, 5g de
NaCl, 5g de extracto de levadura y 1ml de NaOH 1N una que
contena ampicilina (200-250 g/ml) y otra con las mismas
caractersticas pero sin ampicilina que nos sirvi como control, ya

13

que las bacterias que introducen el plsmido adquieren resistencia

a la ampicilina.
7. Una vez solidificado el bactoagar, en esterilidad con un mechero,
fueron sembradas las bacterias en una dilucin 1:100, en LB sin
bactoagar de manera que se generaran colonias discretas. Para ello
se dejaron incubar por 12 horas a 37 C y posteriormente se
pasaron a refrigeracin.
8. Ya obtenidas las colonias, se inoculo una colonia bacteriana
transformada en 3ml de medio LB suplementado con ampicilina
(100l/ml).
9. Se dej crecer el cultivo durante toda la noche a 37 C en agitacin
constante.
A partir de aqu se prosigui a realizar la tcnica de lisis alcalina para
obtener el plsmido.

2. Purificacin del ADN plasmdico por lisis alcalina con SDS:

Se utilizo la tcnica de lisis alcalina en combinacin con el detergente SDS,
para aislar el ADN plasmdico de E.coli (Sambrook, 2001). Se expuso la
suspensin bacteriana a un detergente aninico con un pH alto que abre
la pared celular, desnaturalizando el ADN cromosomal y las protenas,
permitiendo la salida del ADN plasmdico hacia el sobrenadante. La
solucin alcalina rompe completamente la unin entre los pares de bases
del ADN genmico, sin embargo, las hebras del ADN plasmdico por ser
circular no se alteran ya que estas se encuentran topolgicamente
entrelazadas.
Soluciones:
2ml de la solucin GTE: 50mM glucosa, 25mM Tris-HCl, pH 8.0, 10mM
EDTA, pH 8.0
10ml de solucin TE: 10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, pH 8.0

14

2ml de solucin NaOH/SDS: 0.2N NaOH, 1% SDS

1.

Se tomaron 1.5ml del cultivo bacteriano en un tubo Eppendorf

estril de 1.5ml.

2.

Se centrifug a 14,000rpm por 20 seg. en una microcentrfuga

marca eppendorf a temperatura ambiente.

3.

El sobrenadante se decanto y el pellet se resuspendi en 100l de

la solucin GTE.

4.

Se

agregaron

200l

de

una

solucin

recin

preparada

de

NaOH/SDS y se mezclo por inversin.

5.

Se paso a hielo frape durante 5 minutos y se agregaron 200l de

acetato de sodio 5M, pH 8.0, mantenindolo en hielo 5 minutos,
formndose un precipitado denso.

6.

Se agito en vortex 2 segundos y se regreso al hielo 5 minutos.

7.

El tubo fue centrifugado a 14,000 rpm durante 3 minutos a TA.

8.

El sobrenadante fue recuperado en un tubo nuevo y se agregaron

0.8ml de etanol absoluto, agitndolo por inversin.

9.

Se mantuvo a -70 C por 10 minutos.

10. Se centrifug a 14,000 rpm por 10 minutos a TA.

11. El sobrenadante se decanto y el pellet fue lavado con 1ml de etanol
al 70%.
12. Se centrifug a 14,000 rpm por 5 minutos a TA.
13. El sobrenadante se decanto y se resuspendi el pellet en 30l de
TE, pH 8.0
14. Se

cuantific

la

concentracin

de

ADN

obtenido

por

espectrofotometra (absorbancia 260-280nm), utilizando 2l del

plsmido y 298 l de H2O.
15. El plsmido se guard a -20 C.
Otra forma de cuantificar el plsmido fue corriendo una electroforesis en
un gel de agrosa al 0.8% y 2l de bromuro de etidio, esto es tambin para

15

asegurar que fuera el plsmido de nuestro inters. Para ello se digiri el

plsmido con las enzimas de restriccin con que fue manipulado
anteriormente.
1.

Se prepar una cmara de electroforesis con un gel de agarosa al

0.8%, en donde se pusieron 0.2gr de agarosa y se le adicionaron
25ml de TBE 0.5X (para un litro de TBE 5X: 0.5 M cido brico
30.9g/l, PM 61.8; 0.5M Tris base 60.5g/l, PM 121.1 y 10mM EDTA
3.73g/l, PM 372.2).

2.

Se disolvi la agarosa calentando en un horno de microondas

aproximadamente 40 segundos, y se le agregaron 2l de bromuro
de etidio, se dejo enfriar la agarosa hasta que se soporto la
temperatura al toque con la palma de la mano y se vaci en el
contenedor del gel.

3.

Se agreg la solucin de TBE 0.5X a la cmara, en suficiente

cantidad hasta que se cubri el gel.

4.

En seguida se prepararon las muestras de los plsmidos de la

siguiente manera.

5.

Para Bcl-2 en el tubo 1(plsmido digerido): se tomaron 2l del

plsmido de Bcl-2, se agreg 1l de la enzima EcoRI, 1l de buffer
H y 6l de agua, para llevarlo a 10 l.

6.

El tubo 2 (plsmido sin digerir): se agreg 2 l del plsmido de Bcl2, se agreg 1l de buffer H y 7l de agua, para llevarlo a 10 l.

7.

EL tubo 3 (plsmido sin digerir): se agreg 2 l del plsmido de Bcl2 y 8l de agua, para llevarlo a 10l.

8.

Para GFP en el tubo 1(plsmido digerido I): se agreg 2l del

plsmido de Gfp, con 1l de la enzima Cla-I, 1l de buffer 1 y 6l de
agua.

16

9.

Para el tubo 2 (plsmido digerido II): se agreg 2l del plsmido de

Gfp, con 1l de la enzima Xho-I, 1l de buffer 2 y 6l de agua.

10. Para el tubo 3 (plsmido digerido): se agreg 2l del plsmido de

Gfp, con 1l de la enzima Cla-I, 1l de buffer 1, 1l de la enzima
Xho-I, y 5l de agua.
11. Para el tubo 4 (plsmido sin digerir): se agreg 2l del plsmido de
Gfp y 8l de agua.
12. Para pclEco en el tubo 1 (plsmido digerido): se agreg 2l del
plsmido de pclEco, con 1l de la enzima XBa-I, 1l de buffer H y
6l de agua.
13. Para el tubo 2 (plsmido sin digerir): se agreg 2l del plsmido de
pclEco, 1l de buffer H y 7l de agua.
14. Para el tubo 3 (plsmido sin digerir): se agreg 2l del plsmido de
pclEco y 8l de agua.
15. Se us un marcador de peso molecular llamado Hind III
agregando 3l de este ms 3l de agua y 1l de LB-ADN que es la
solucin de carga para ADN (para 10ml de 6X LB-ADN: 0.25% azul
de bromofenol, PM 691.9; 0.25% xilen cianol FF, PM 538.6 y
glicerol PM 92.09; densidad 92.09).
16. Ya preparado cada tubo de los plsmidos se incubaron a 37 C por
1 hora, esto es para activar la enzima, posteriormente para detener
la reaccin se calentaron a 95 C por 5 minutos, en seguida se
meti a enfriar a 4 C por 5 minutos, para desactivar la enzima.
17. Posteriormente se tomaron 5l de cada tubo y se le agreg 1l de
LB-DNA, cada muestra se deposito en el gel y se corri a 100V
aproximadamente 45 min.

17

18. Hecha la cuantificacin se purific el plsmido a travs de filtros

estriles de 0.22

m de la marca Milliport y entonces se obtuvo el

plsmido puro y estril para continuar con la transfeccin del

mismo.

5.4 CO-TRANSFECCIN
Los plsmidos fueron introducidos en clulas empaquetadoras (293-T) a
travs de la tcnica de fosfato de calcio. Esta tcnica permite que la
permeabilidad de la membrana cambie y as se introduzca el plsmido.
Cabe mencionar que fueron insertados dos plsmidos en las clulas 293 T,
gfp-bcl-2 y el plsmido pclEco. Como control se hizo otro tipo de
cotransfeccin en la que se us el plsmido gfp sin bcl-2 y pclEco.
1.

Un da antes se sembraron 10 pozos en placas de 6 con 400,000

clulas de 293T en cada uno.

2.

4 horas antes de la co-transfeccin se cambio el medio a las clulas

por medio nuevo sin antibac (DMEM ms 15% de SFB).

3.

Se preparo solucin del kit Calcium phosphate transfection system

(GIBCO BRL) de la tcnica de fosfato de calcio para 10 pozos, los
cuales se hicieron para 4 pozos de gfp, 4 pozos para bcl-2 y 2 pozos
control.

4.

La solucin se hizo con 880l de agua, 100l de HSB 10 X y se

vortexeo, ms 15 l de NaOH dando vortex, ms 20l de fosfatos,
volviendo a dar vortex.

5.

Ya lista la solucin se prepararon 3 tubos 1, de los cuales un tubo

fue para bcl-2 con 400l de la solucin, otro fue para gfp con 400l
de la solucin y el ltimo tubo para el control con 200l de la
solucin.

6.

En seguida se prepararon 3 tubos 2, de los cuales uno era para bcl2 al que se le agreg 343.2l de agua, 0.4l de ADN acarreador,

18

40l de ADN plasmdico de bcl-2 y 57.12l de pclEco. (que

corresponde a 5ng de ADN plasmdico para cada uno).
7.

Para el tubo 2 de gfp, se agreg 343.2l de agua, 0.4l de ADN

acarreador, 57.12l de ADN plasmdico de gfp y 57.12l de pclEco.
(que corresponde a 5ng de ADN plasmdico para cada uno).

8.

Para el tubo 2 del control, se agreg 2l de Ca2+ resuspendiendo 5

veces, agregndole 10l de Ca2+ resuspendiendo nuevamente.

9.

Al tubo 2 de bcl-2 se le agregaron 4l de Ca2+, resuspendiendo 5

veces, mas 20l de Ca2+, resuspendiendo nuevamente.

10. Al tubo 2 de gfp se le agregaron 4l de Ca2+, resuspendiendo 5

veces, mas 20l de Ca2+, resuspendiendo nuevamente.
11. Despus cada tubo 1 fue burbujeado con una pipeta pasteur y
goteando con su respectivo tubo 2 lentamente.
12. Para que precipitara se dejo 20 minutos a temperatura ambiente.
13. A 4 pozos se le agrego 185l de bcl-2, a otros 4 pozos se le agreg
185l de gfp y a un pozo 185l de control.
14. Al da siguiente se cambio el medio de cada pozo.
15. A

las

48

horas

se

recogieron

las

partculas,

tomando

el

sobrenadante el cual fue centrifugado a 3,000rpm por 5 min. A

temperatura ambiente, de ah se congelo el sobrenadante a -70 C.

Con ello se obtuvieron en el medio de cultivo los retrovirus conteniendo

los genes de inters, el cual fue recolectado y almacenado a una
temperatura de 70 C para su uso posterior en el cultivo primario.

19

5.5 INFECCIN
Una vez establecido el cultivo primario de fibroblastos de pulmn de ratn,
se procedi a realizar la infeccin de estas clulas con las partculas virales
obtenidas. Para tener mejores resultados en cuanto a la insercin del
plsmido fue necesario cambiar el medio de cultivo de los pozos 24 hrs.,
antes de realizar la infeccin.
Se seleccionaron los pozos correspondientes para cada tratamiento, Bcl-2,
GFP y control. Se consider un volumen total de 1ml para cada pozo, por
lo que se adicionaron 500l de medio con Polibrent en una concentracin
de 2l/ml de medio y 500l de partculas virales para las clulas que
sobreexpresaran la protena Bcl-2, de igual forma para las clulas
especficas de GFP (500 l de medio con polibrent y 500 l de partculas
virales con el plsmido para la protena verde fluorescente) y por ltimo a
las clulas control se les adicionaron 500l de medio con polibrent y 500l
de medio. Cabe sealar que el medio utilizado no contena antibitico para
asegurar la infeccin y no estresar ms a las clulas.
Una vez realizada la infeccin, las clulas fueron incubadas durante 24
hrs. Pasado este tiempo se retir el tratamiento y se adicion nuevamente
medio de cultivo con todos los requerimientos (DMEM ms suero fetal
bovino 15%, aminocidos no esenciales y antibac). Se dejaron incubar
durante 5 das en las mismas condiciones para poder asegurar la
expresin de los genes introducidos en las clulas. Una vez transcurrido
ese tiempo se prosigui a realizar los ensayos para determinar los
parmetros de envejecimiento de los fibroblastos tales como: proliferacin
celular, senescencia asociada a la enzima -galactosidasa (SA--gal) y
funcionalidad celular.
Para corroborar que el plsmido que contena los genes bcl-2 y gfp

se

encontraban dentro de las clulas, fueron sembradas 40,000 clulas de

cada uno de los tratamientos (control, gfp y bcl-2) en laminillas que fueron

20

observadas al microscopio de fluorescencia debido a que las clulas

infectadas deban fluorescer por la presencia de la protena GFP, en
comparacin con las clulas control tratadas nicamente con polibrent.

6. SEMBRADO DE CLULAS PARA LAS DETERMINACIONES A LO

LARGO DEL TIEMPO DE CULTIVO.
Para los ensayos de proliferacin celular, funcionalidad celular y SA- galactosidasa, se sembraron aproximadamente 5000 clulas/pozo en
placas de 48 pozos. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y
en al menos 3 experimentos independientes.
1.

Despus de 5 6 das de realizados los cultivos primarios, las

clulas se lavaron cuidadosamente con PBS.

2.

Se despegaron agregando 0.3ml de tripsina-EDTA 0.25% (Sigma)

para cada caja petri.

3.

Las clulas se contaron utilizando un hemocitmetro.

4.

Se repartieron aproximadamente 5000cels/pozo en placas de 48

pozos para todos los das del experimento.

5.

Se realizaron las determinaciones correspondientes cada tercer da.

21

Clulas control 40 x

Clulas GFP 40 x EPIFLUORESCENCIA

Clulas BCL-2 40 x EIPIFLUORESCENCIA

22

7. PARMETROS DE ENVEJECIMIENTO.
7.1 PROLIFERACIN CELULAR
La proliferacin celular se determin contando clulas vivas a lo largo del
tiempo de vida de los cultivos, utilizando azul tripano que es un colorante
vital que es excluido activamente de las clulas vivas. En las clulas
muertas, el colorante difunde fcilmente hacia el citoplasma (Doyle, et al;
1994). Esta tcnica evita contar falsos positivos.
Tcnica para determinar la proliferacin y la viabilidad celular
1.

Las clulas se lavaron con PBS una vez y se despegaron con 200 l
de tripsina-EDTA 0.25% (Sigma).

2.

Para inactivar la enzima se agregaron 200 l de DMEM + Suero de

ternera al 10%.

3.

Se tom una alcuota de 20 l de suspensin celular y 20 l de azul

tripano y se homogenizaron.

4.

De esta suspensin se tomaron 10 l y se contaron las clulas

utilizando un hemocitmetro y un microscopio ptico.

5.

El resultado de x de los campos contados se multiplico por 2

(dilucin) y ese resultado se multiplico por 1 x 104 clulas/ml.

7.2 FUNCIONALIDAD CELULAR

Para evaluar la funcionalidad celular, se cuantific la actividad de la
enzima succinato deshidrogenasa mitocondrial mediante la tcnica del 3(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil bromuro de tetrazolio (MTT) (Sigma).
Esta enzima participa en la transferencia de electrones en la cadena
respiratoria mitocondrial, reduciendo a la ubiquinona (Konigsberg, 1992).
La enzima que se encuentra en las clulas funcionales reduce el sustrato
MTT y como resultado se produce formazn de color azul, que se mide
espectrofotomtricamente a 570nm (Mosman, 1983).

23

Tcnica de la funcionalidad celular (MTT)

1.

A las clulas se les retir el medio y se lavaron cuidadosamente con

PBS.

2.

Se retir el PBS y se agreg 1ml de solucin MTT (Sigma) (0.5mg de

MTT/ml PBS) pH 7.5.

3.

Las clulas se incubaron durante 3 horas a 37 C.

4.

Se retir el MTT y se lavaron las clulas cuidadosamente con PBS

una vez.

5.

Se agregaron 800 l de solucin de extraccin (HCl 0.04 M en

isopropanol) a cada pozo.

6.

Las placas de cultivo se colocaron sobre un plato de agitacin

(Thermolyne AROS 160) durante 15 min. a temperatura ambiente
para disolver el formazn.

7.

El contenido de cada pozo se deposit en celdas de vidrio para su

lectura a 570nm utilizando un espectrofotmetro (Beckman DU
640).

8.

La funcionalidad se determin normalizando los datos por clula (el

valor de MTT/nmero de clulas de la proliferacin de ese da).

7.3 CUANTIFICACIN DE LA SENESCENCIA EN LAS CLULAS DE

CULTIVO PRIMARIO
Como marcador de senescencia se us el ensayo de

-galactosidasa

asociada a la senescencia (SA- -gal). La tcnica consiste en la hidrlisis

del reactivo x-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactsido) por la
enzima

-galactosidasa cuya presencia se encuentra considerablemente

aumentada en las clulas envejecidas o con senescencia replicativa. Tras

la reaccin se produce un precipitado verde-azul (Dimri, 1995) que se
cuantifica contando las clulas teidas con la ayuda de un microscopio
ptico.
24

Tcnica de ensayo SA- -gal

1.

Se agregaron 300 l de solucin fijadora (paraformaldehdo 2%,

MgCl2 2mM, EGTA 1.35mM y Buffer piperazina-N, N-bis (2-etanolcido sulfnico)(PIPES) 0.1M provenientes de soluciones stock a pH
6.9 y pH 8, respectivamente) a cada pozo.

2.

Las clulas se incubaron 1 hora a temperatura ambiente.

3.

Pasado ese tiempo se retir la solucin y se lavaron 3 veces con

PBS.

4.

Se agregaron 300 l de solucin X-gal que contena 5mM de

K3Fe(CN)6, 5mM de K3Fe(CN)63H2O, 2mM MgCl2 y 1mg/ml de X-gal
(PROMEGA) el pH ajustado a 6.

5.

Las clulas se mantuvieron en incubacin a 37C durante toda la

noche.

6.

Al siguiente da se contaron las clulas teidas con ayuda de un

microscopio ptico.

25

8. RESULTADOS
OBTENCION DEL CULTIVO PRIMARIO
La obtencin de fibroblastos fue bsica para la elaboracin de la presente
investigacin.

SOBREEXPRESION DE LA PROTENA Bcl-2

En primer lugar, cabe aclarar que los plsmidos fueron donados por la
Dra. Mara del Carmen Aguayo del laboratorio del Dr. Luis Covarrubias.
Para aumentar la cantidad de los mismos fue necesario realizar su
amplificacin, utilizando la tcnica de lisis alcalina. Una vez aislados los
plsmidos se tom una muestra de cada uno de ellos y se digiri con las
enzimas correspondientes para saber si el plsmido obtenido era el de
nuestro inters y as mismo cuantificarlo. Para ello se hizo una
electroforesis en gel de agrosa al 0.8 % como se muestra en la figura 1. En
el carril 1 se observa el marcador de peso molecular ( Hind III); en el carril
3 se encuentra pclEco sin digerir, que es todo el plsmido, en el carril 4 se
muestra pclEco digerido con Xba, que es la enzima que ha cortado el
plsmido para poder identificar el peso molecular para el gen pclEco. El
carril 7 se muestra a gfp cortado con la enzima Xba I y Cla I para
identificar el peso molecular del gen gfp, por ltimo en el carril 8 se
muestra el plsmido gfp sin digerir, por lo cual se puede observar todo el
ADN plasmdico.

26

3 4

6 7

Fig. 1
Electroforesis en agarosa al 0.8 % para evidenciar a los plsmidos digeridos con diferentes enzimas
de restriccin como aparece en el texto.

PARAMETROS DE ENVEJECIMIENTO
PROLIFERACIN CELULAR
En cuanto a la proliferacin, en la grfica 1 podemos observar que la curva
del cultivo control, presenta un periodo de establecimiento a partir del da
7 al 15, despus de este y hasta el da 18 comienza a tener un crecimiento
exponencial, despus se observa en el da 21 que las clulas entran en
senescencia y muerte, la que puede apreciarse al presentarse una fase
estacionaria, indicando el cese de la proliferacin.
En la misma grfica se muestra la curva del cultivo infectado con bcl-2,
donde se observa que del da 15 al 21 de cultivo las clulas presentan un
comportamiento de retardo de crecimiento en comparacin con el control,

27

para el da 21 entran en crecimiento exponencial hasta el da 23, para el

da 25 se ve una cada en la proliferacin, en la cual las clulas han
entrado en senescencia.
Mientras para las clulas gfp que son el control de infeccin, se puede
observar que a partir del da 15 tienen una proliferacin menor que las
infectadas con bcl-2 y a partir del da 21 entran en senescencia.
En cuanto a diferencias estadsticas para el da 15 no hubo diferencia en
cuanto a la proliferacin entre el control, gfp y bcl-2. Para el da 18 se
muestra que si hubo diferencia del

control con gfp, pero no se mostr

ninguna diferencia con bcl-2 esto indica que la diferencia que se observa
con el control est dada nicamente por la infeccin. Para el da 21, se
mostr una diferencia entre bcl-2 y gfp con el control, pero no hubo alguna
diferencia entre ellos.
En el da 24 el control muestra una diferencia de proliferacin con el grupo
gfp, pero no as con el de bcl-2, aunque si hay diferencia estadstica entre
las clulas infectadas.
En el da 28 tanto las infectadas con bcl-2 como con gfp presentan
diferencia estadstica con el control y as mismo se muestra diferencia
entre ellos.

28

PROLIFERACIN CELULAR

m.
de
c
lul
as
x
10 5

6
5
control
{

3
*
*

*
*

bcl2

*
*
*
*
* *

gfp

0
0
Grfica 1.

2
Das de
0cultivo

4
0

Diferencia estadstica con el control

Diferencia estadstica con las clulas que sobreexpresan gfp
p<0.05

29

FUNCIONALIDAD CELULAR
En la grfica 2 se muestra la funcionalidad de las clulas. Estos datos
representan la absorbancia a 570nm por nmero de clula, adems se
normalizaron con el control tomando al da 15 (inicio del experimento)
como el valor de 1.0.
No se observa una mejora estadstica en la funcionalidad de las clulas
que sobreexpresan bcl-2, pero tampoco un detrimento. Lo mismo ocurre
para las infectadas con gfp.

FUNCIONALIDAD CELULAR

N
o
r
m
a
li
z
a
d
o
D
O
/
c

l
u
l
a

4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

Control

bcl2

gfp

10

15

20

25

30

Das de cultivo
Grfica 2. Funcionalidad celular por el ensayo
MTT.

30

SENESCENCIA CELULAR
En la grfica 3 se puede observar que para las clulas control el nmero
de clulas positivas a -galactosidasa aumenta e manera constante a lo
largo del cultivo. Mientras que para las clulas infectadas con bcl-2 y gfp
se observa que a los mismos tiempos hay un mayor nmero de clulas
positivas a

-galactosidasa. Esto es: para el da 15 ambos cultivos

infectados tienen 20% mas de clulas senescentes que el control para el

mismo da y para el da 18 las clulas que sobreexpresan gfp tienen 12%
ms de clulas senescentes que el control y las que sobreexpresan bcl-2
tienen 32% mas clulas senescentes que el control, esta diferencia se
mantiene ms o menos estable a lo largo del cultivo, sin embargo, para el
da 28 no hay diferencia con las control.
Al hacer la comparacin estadstica, se observa que en el da 15 hay una
diferencia significativa de p=0.08 entre las clulas senescentes que
sobreexpresan bcl-2 y gfp con el control. Mientras que para el da 18 solo
hay diferencia significativa de las que sobreexpresan bcl-2 con el control,
pero no de las que sobreexpresan gfp con el control. Para los das
siguientes no se presenta alguna diferencia entre el control y las clulas
infectadas.

31

SENESCENCIA ASOCIADA A LA -GALACTOSIDASA

80

70
60

**

50
%
de
c
lul
as
se
ne
sc
en
te

contro
l

40

bcl
2

30

gf
p

20
10
0
0

10

20

30

Das de cultivo
Grfica 3.
Diferencia estadstica con el control

Diferencia estadstica con las clulas que sobreexpresan gfp

p<0.05

32

9. DISCUSION Y CONCLUSION
Para iniciarla discusin me gustara aclarar que el trabajar con ratones
viejos es difcil, puesto que en primer lugar hay que esperar a que
envejezcan. En segundo lugar, los cultivos de fibroblastos de pulmn de
ratn que se obtienen cuentan con pocas clulas, ya que estn muy
daadas y se mueren, adems de que son muy susceptibles a
contaminarse.
Con respecto al manejo de los plsmidos y su amplificacin, se obtuvieron
con xito los plsmidos aislados para poder formar las partculas virales y
sebreexpresar las protenas en los cultivos primarios.
En la grfica 4 podemos apreciar el comportamiento que tienen las clulas
controles de cultivos primarios de fibroblastos de ratones viejos como de
jvenes. En ella se puede observar la diferencia de proliferacin entre una
poblacin y otra. Las clulas jvenes presentan una mayor proliferacin en
comparacin con las clulas viejas. Adems, en esta misma grfica se
observa disminuida la proliferacin en el cultivo de las clulas infectadas
en comparacin con el control. Al comparar bcl-2 con su control de
infeccin gfp se puede apreciar una ligera proteccin que es mnima s se
compara con las clulas sin infectar.
Los cultivos de fibroblastos de ratones viejos tienen un deterioro mayor,
adems que al momento de realizar la infeccin las clulas se daan an
ms, provocando que muchas clulas no resistan. Las que resistieron se

33

mantuvieron ms o menos estables, por lo que se puede decir que bcl-2

trat de proteger a las clulas pero no revirti el dao que ya tienen.
Analizando

lo

obtenido

para

las

clulas

control

en

proliferacin,

funcionalidad y senescencia celular, se observa que efectivamente cuando

las clulas entran en senescencia son alteradas sus funciones fisiolgicas
y su capacidad proliferativa cesa, como algunos investigadores han
propuesto (Campisi, 2000; Lundberg et al., 2000).

En cuanto al comportamiento de las clulas infectadas, podemos decir que

hay un impacto en las clulas, provocndoles un dao mayor. Pero a pesar
de eso, pudimos observar que en la proliferacin al sobreexpresar la
protena bcl-2 se tiene un pequeo efecto de proteccin, pero que despus
decae. Por lo que se puede decir, que bcl-2 no retarda la entrada a la
senescencia, ya que esta protena se presenta a lo largo del cultivo de una
manera constante, por lo cual no se encontr un aumento en la
funcionalidad.
Como se mostr en las grficas anteriores, las clulas infectadas con bcl2
trataron de proliferar, pero debido a la infeccin las clulas sufrieron un
dao y estrs por lo que ya no crecieron lo necesario, as que bcl2
proporciono un pequeo efecto protector por un tiempo, pero despus
decay.

34

bcl2
No.3
de
cl
ula
s x2
5
10

gfp
jvenes

1
viejas

0
7

11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
Das de cultivo

Grfica 4. Control de cultivo control de viejas y jvenes se puede observar el comportamiento de las
clulas jvenes y las clulas viejas sin infectar.

35

10. REFERENCIAS
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38

11. AGRADECIMIENTOS
v A mis padres por su gran apoyo.
v A mi esposo.
v M. en C. Mina Konigsberg Faisntein.
v M. En B.E. Norma Edith Guerrero-Daz Lpez.
v Biol. Exp. Ma. Cristina Aguilar Calles.
v Dr. Pablo Damian Matsumura.
v M.V.Z. Rocio Vieria.
v CONACYT 400200-5-J34194-M

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