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Chromatographie

MTHODES PHYSIQUES DE SPARATION


ET D'ANALYSE ET MTHODES DE
DOSAGE DES BIOMOLCULES
6-LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE / MCANISMES ET MODALITS
6-2-Les diffrents modes de chromatographie liquide
On dispose d'un grand nombre de modes de chromatographie. Certains ont un champ d'application trs large, d'autres
au contraire correspondent des applications trs spcialises.
On distinguera dans ce qui suit :
1
2
3
4
5
6
7

chromatographie
chromatographie
chromatographie
chromatographie
chromatographie
chromatographie
chromatographie

d'adsorption
de partage (en phase directe (2A) ou inverse (2B))
d'change d'ions (+ chromatographie ionique)
de paires d'ions
d'exclusion (sparation selon la taille)
d'affinit
adapte la sparation d'nantiomres

Le choix de tel ou tel mode obit des rgles logiques directement lies la nature des composs sparer :

6-2-1-La chromatographie d'adsorption


C'est la premire chromatographie ralise : sparation des pigments vgtaux par adsorption sur de la craie (Tswett
1906).
Dfinition : Ce mode de chromatographie met en jeu un mcanisme d'adsorption du solut sur la phase
stationnaire solide et un mcanisme d'lution (dsorption) par la phase mobile liquide ou gazeuse (luant).
Principe :
- L'adsorption est la fixation plus ou moins nergique d'un gaz, d'un liquide ou d'un solut sur une surface solide; elle
met en jeu des liaisons faible nergie (liaisons hydrogne, interactions lectrostatiques...). Pour tre utilisable des
fins sparatives, l'adsorption doit tre rversible.
- L'lution ou dsorption consiste extraire le solut adsorb l'aide d'un solvant appel luant.
- Les diffrents soluts sont plus ou moins adsorbs sur la phase stationnaire, et plus ou moins solubles dans la phase
mobile; il en rsulte une migration diffrentielle des soluts en fonction de la rsultante entre les deux forces (de
rtention et d'entranement) et donc une sparation de ces soluts.
Le schma ci-aprs rsume les interactions entre le solut, le solide adsorbant et l'luant :

Adsorbants :
- Les adsorbants doivent tre insolubles dans le solvant et chimiquement inertes vis--vis du solvant et des
soluts.
- Leur granulomtrie varie entre 5 et 100 m et leur surface spcifique de 50 1000 m2 /g,
- L'activit d'un adsorbant dpend de sa nature et de sa teneur en eau.
N. B. Dans certains cas, on cherche diminuer l'activit adsorbante, et on fait au contraire une dsactivation.
-La capacit d'adsorption peut tre :
- faible (carbonate de calcium...)
- forte (silice, alumine, charbon ...)
-La polarit peut tre
- faible (charbon...)
- forte (silice SiO2, utilise sous forme hydrate : gel de silice, qui prsente des fonctions "silanol" :
Si-OH , alumine Al2O3, n H2O...)
Solvants :
On utilise gnralement des mlanges de solvants, de polarit voisine de celle des soluts sparer (ceux-ci doivent
tre solubles dans l'luant !). On classe les diffrents solvants selon leur "force luante" qui traduit leur polarit:
Srie luotrope sur alumine de quelques solvants, classs par ordre de polarit croissante :
solvant

force luante

solvant

force luante

Ether de ptrole

0,01

Actone

0,56

Hexane

0,01

Dioxane

0,56

Cyclohexane

0,04

Butanol

0,56

Ttrachlorure de carbone

0,18

Actate d'thyle

0,58

Ether isopropylique

0,28

Actonitrile

0,65

Tolune

0,29

Pyridine

0,71

Benzne

0,32

Dimthylsulfoxyde

0,75

Ether thylique

0,38

Isopropanol

0,82

Chloroforme

0,40

Ethanol

0,88

Chlorure de mthylne

0,42

Mthanol

0,95

Dichlorothane

0,49

Eau

> 0,95

Acide actique

> 0,95

Selon la nature des composs sparer, on choisit des solvants de force luante ( o ) approprie. C'est rarement un
solvant pur, mais en fait un mlange de 2 4 solvants, optimis par tests successifs vis--vis des composs tudis,
sans que cela obisse des rgles permettant de prdire les rsultats. Des abaques permettent de calculer la force
luante d'un mlange binaire :

Dans les mlanges contenant plus de deux solvants, les derniers sont prsents dans de trs faibles proportions (< 2%)
et correspondent des solvants de forte polarit (eau, acide) destins amliorer la symtrie des pics. Le choix du
solvant doit obir certaines contraintes :
- miscibilit des composantes lmentaires
- compatibilit avec le systme de dtection ("cut-off" en UV)*
* N.B. Cette contrainte n'existe pas avec la chromatographie sur couche mince, pour laquelle le choix des solvants est
donc plus tendu.
Applications :
La chromatographie d'adsorption est utilise pour sparer des molcules organiques de masse molaire 100
1000 g/mol et de polarit moyenne;
-les molcules apolaires sont pas ou peu retenues, et sont lues les premires (= elles migrent au front
en CCM).
-Les molcules trop polaires risquent d'tre adsorbes de faon irrversible, et ne sont donc pas lues
(= elles resteraient sur la ligne de dpt en CCM).
Exemples :
- lipides : strols et strodes, carotnodes, phospholipides...
- pigments, mdicaments...
- oses et oligosides, acides amins et oligopeptides
L'utilisation de ce mode de chromatographie est assez large, en raison de sa facilit d'emploi et du fait que la
transposition depuis la chromatographie sur couche mince est trs aise.

6-2-2-La chromatographie de partage


La chromatographie de partage (ou chromatographie liquide-liquide) met en jeu un mcanisme de partition entre
solvants que constituent respectivement par la phase stationnaire et la phase mobile. La phase stationnaire peut tre
constitue par un film liquide (non miscible avec la phase mobile bien sr) imprgn sur un support rigide (silice) ou
fix par liaison covalente (phases greffes). C'est ce second type qui est utilis actuellement. Le greffage est ralis
par tablissement de ponts siloxane (Si-O-Si) :
->Si-OH + X-Si(CH3 )2 -R --> ->Si-O-Si(CH 3)2-R + HX
Selon la nature des radicaux R, on distinguera :
- les phases greffes polaires (-diol, -cyanopropyl, aminopropyl,)
- les phases greffes apolaires (-alkyl, -phnyl, )
Les premires sont utilises avec des solvants peu polaires (cf adsorption) et permettent de raliser de la
chromatograhie en phase normale ou directe.
Les secondes s'emploient avec des solvants polaires et l'on a alors de la chromatographie en phase inverse ou
rverse.
En premire approximation, l'ordre d'lution des composs est invers entre les deux modes, les composs polaires
tant lus en premier dans les systmes en phase rverse.
LES PHASES GREFFEES POLAIRES
Elles s'utilisent comme les colonnes de silice prcdentes. La prsence de fonctions particulires sur le greffage (-CN,
-NH2,) peut apporter une slectivit intressante. De plus, il est possible de travailler avec un gradient de force
luante, donc d'analyser en une seule fois des mlanges contenant des composs de polarits trs diffrentes. Il n'y a
pas de phnomnes d'adsorption irrversible et on peut rincer les colonnes avec des solvants trs luants comme du
mthanol pur.
LES PHASES GREFFEES APOLAIRES
Ce sont les supports les plus couramment utiliss, principalement avec un greffage alkyl (octadcylsilane ou -ODS ou
-C18). Dans ces systmes, le solvant le plus polaire (l'eau) est le moins luant et la force luante de la phase mobile
est augmente par ajout d'un solvant organique (mthanol, actonitrile).
La phase stationnaire (type de greffage, taux de greffage, porosit) et la phase mobile (type de solvant organique,
pH, temprature,) concourent toutes deux la slectivit de l'ensemble et les possibilits sont innombrables, ce qui
explique la popularit de ce mode chromatographique.
Le contrle de pH permet de faire varier volont le k' des composs ionisables. Il convient dans le cas de greffage
sur silice de rester dans des limites compatibles avec la non-dissolution de la colonne ( 2 < pH < 8 ). Il existe par
ailleurs des phases greffes sur des rsines polymrises qui n'ont pas cet inconvnient et permettent de travailler
dans une gamme de pH bien plus large (1-13).
Certains greffages comme le greffage -CN ont des proprits hybrides qui permettent de les utiliser aussi bien en

phase directe qu'en phase inverse.

6-2-3-La chromatographie d'change d'ions


Dfinitions : Dans la chromatographie d'change d'ions, la phase stationnaire comporte des groupements ioniss (+
ou -) fixes; des ions mobiles de charge oppose assurent l'lectroneutralit. Les ions retenus au voisinage des charges
fixes sont changeables avec les ions prsents dans la phase mobile.
La sparation est base sur cette proprit d'change d'ions et ne peut donc s'appliquer qu' des soluts ionisables.
Les changeurs d'ions :
Nature :
La phase stationnaire est constitue d'un support insoluble dans l'eau, sur lequel sont greffs des
groupements fonctionnels ionisables.

-Les supports peuvent tre :


minraux : silice
organiques : rsine polystyrnique, cellulose, dextrane
-Les groupements fonctionnels sont fixs par des liaisons covalentes sur la matrice; ils sont de deux types :
les changeurs de cations portent des groupements chargs (-)
les changeurs d'anions portent des groupements chargs (+)
Exemples :
ECHANGEURS DE CATIONS

ECHANGEURS D'ANIONS
FORTS

FAIBLES

Les changeurs forts sont ioniss quel que soit le pH, alors que les carboxylates ne le sont qu' pH > 3 et les amines
tertiaires ne sont protones qu' pH acide. On utilise les changeurs d'anions forts pour sparer des acides faibles (ex
acides carboxyliques) et les changeurs faibles pour sparer des acides forts (ex esters phosphate). Le mme type de
raisonnement s'applique aux changeurs de cations.
La nature de l'ion changeable est variable : par exemple une rsine cationique peut tre utilise sous forme acide
(lie H+) ou sous forme sodique (lie Na+); il faut donc conditionner la rsine sous la forme ionique adquate
avant son utilisation, et la rgnrer aprs usage.

Caractristiques :
-Porosit : le support est un polymre plus ou moins rticul ; la porosit dpend du taux de pontage : un polymre
trs rticul a des pores de petite taille et convient pour des petites molcules.
-Granulomtrie : le support est commercialis sous forme de grains de diamtre variant de 30 800 m
(chromatographie basse pression) Celui des colonnes HPLC a une granulomtrie de 5-10 m (supports totalement
poreux) ou lgrement suprieure (supports pelliculaires, en couche de 1 m sur des billes de verre). Les changes
sont d'autant plus rapides et efficaces que les grains sont petits.
-Capacit de rtention : c'est la quantit maximale d'ions que peut fixer l'changeur d'ions, exprime en mEq/g de
poids sec ou en mEq/ml de poids humide. Elle dpend de la densit du support en groupements fonctionnels et il faut
en tenir compte pour ne pas trop charger une colonne.
L'affinit d'un changeur pour un ion donn dpend de plusieurs facteurs:
de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-mme dpend :
L'affinit d'un changeur pour un ion donn dpend de plusieurs facteurs:
de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-mme dpend :
- de leur nature (pKa)
- du pH de la solution
de la densit de charge de l'ion considr, qui dpend:
-

de
de
du
de

la charge de cet ion c'est--dire :


la nature de l'ion (pKa, pHi)
pH de la solution
la taille de l'ion (un ion est d'autant plus fix qu'il est charg, ou/et qu'il est petit)

de la concentration des ions


de l'accessibilit des groupements fonctionnels ( cf : porosit et granulomtrie)
Raction d'change d'ions :

Le systme peut s'crire :

(r = fix sur la rsine; s = en solution)

La constante de slectivit est donne par la relation :

et
si

> 1 la rsine a une affinit prfrentielle pour le solut A

si

< 1 la rsine a une affinit prfrentielle pour le solut B

Les luants sont des solutions aqueuses qui contiennent des ions changeables avec les soluts fixs sur l'changeur :
-solutions contenant un ion de densit de charge plus leve et (ou) de concentration plus leve.
-solutions d'un pH tel qu'il modifie la charge des ions fixs et (ou) des groupements fonctionnels et provoque leur
libration dans l'luat.
On peut luer avec une solution de composition constante (conditions isocratiques) ou avec un gradient de pH et (ou)
de force ionique, pour dcrocher successivement les diffrents ions fixs sur l'changeur.
Applications : La chromatographie d'change d'ions est utilise pour sparer des molcules ionisables, quelle que
soit leur taille : ions minraux, acides amins, peptides, protines, nuclotides, acides nucliques, glucides ioniss et
lipides ioniss.

6-2-4-La chromatographie de paires d'ions

On appelle paire d'ions une entit forme par l'association de deux ions de charge oppose. La paire d'ions a donc
une charge nette nulle et peut dans ce cas prsenter des proprits hydrophobes qui permettent de l'analyser par
sur une colonne de chromatographie en phase inverse.
Pour arriver cette utilisation, on emploie des phases mobiles qui contiennent un dtergent anionique ou
cationique. Ces dtergents sont des molcules ionises qui comportent par ailleurs des chanes carbones
hydrophobes (ex ttrabutylammonium, laurylsulfonate,) et forment avec les composs sparer des paires d'ions
hydrophobes.
On peut dans ce mode chromatographique jouer sur un trs grand nombre de paramtres :
-

nature et concentration du dtergent


pH et force ionique du tampon
temprature
modifiant organique (alcool, actonitrile,)

De tels systmes s'avrent plus performants (N) que les systmes d'change d'ions et ont des capacits plus grandes (
= ils permettent d'injecter de plus grandes quantits d'chantillon sur une colonne de mme dimension).
6-2-5-La chromatographie d'exclusion
La chromatographie d'exclusion est aussi appele FILTRATION SUR GEL ou TAMISAGE MOLECULAIRE. Cette
technique est apparue en 1959 avec un produit nouveau : le Sephadex.
Le Sephadex est un gel de dextrane (polymre de glucose a-1-6 produit par Leuconostoc mesenterodes), auquel on
fait subir une rticulation. Il se prsente sous forme de billes poreuses, dont la porosit dpend du degr de
rticulation. Ces billes sont trs hydrophiles et gonflent dans l'eau. Il en existe diffrents types en fonction de la taille
des billes et de leur porosit.
Principe de la chromatographie d'exclusion :

1 : Dpt d'un mlange de deux molcules (des grosses et des petites) sur une
colonne remplie d'un gel de Sephadex.
2 : Les petites molcules peuvent pntrer dans les billes de Sephadex car leur
diamtre est infrieur celui des pores du gel. Les grosses molcules ne le
peuvent pas en raison de leur grande taille; elles sont donc exclues du gel (d'o
le nom de chromatographie d'exclusion).
3 : Les grosses molcules ont donc un trajet plus court parcourir pour arriver en
bas de la colonne; elles sont donc lues les premires.
4 : Les petites molcules sont lues ensuite car elles ont une plus grande distance
parcourir pour arriver en bas de la colonne.
D'une faon plus gnrale :
-Les molcules de taille suprieure celle des pores des billes de Sephadex sont totalement exclues du gel et
ne se rpartissent que dans le volume extrieur aux billes, c'est--dire dans la phase mobile (luant). Elles sortent les
premires, un volume d'lution Vo appel volume mort de la colonne.
-Les molcules de taille infrieure celle des pores des billes de Sephadex peuvent pntrer librement dans les
billes et se rpartissent dans l'ensemble des liquides de la colonne (volume de liquide l'intrieur des billes ou phase
stationnaire + volume de liquide l'extrieur des billes ou phase mobile). Elles sortent donc les dernires, un
volume d'lution Vt ou volume total des liquides de la colonne.
-Les molcules de taille intermdiaire pntrent un peu dans les billes, en fonction de leur taille et de leur forme;
elles pntrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses, et elles sont lues dans l'ordre des masses molaires
dcroissantes.

1 : Les molcules de masse molaire


faible sortent toutes Vt.
3 : Les molcules de masse molaire
leve sortent toutes Vo .
2 : Les molcules de masse molaire
intermdiaire sortent des Ve
intermdiaires et sont effectivement
spares.

Applications de la chromatographie d'exclusion :


-Cette technique est trs utilise pour la sparation ou l'limination de sels ou de petites molcules dans les solutions
protiques : DESSALAGE, ECHANGE de TAMPONS ...
-Cette technique est galement applique au FRACTIONNEMENT de MELANGES de MACROMOLECULES et la
DETERMINATION (approximative) de la MASSE MOLAIRE des protines. Dans ce dernier cas, il faut d'abord
talonner la colonne avec des protines de masse molaire connue, tracer la courbe Ve = f(logM), puis effectuer une
dtermination graphique.
Ce qui prcde concernant le Sephadex est en fait trs gnral et s'applique de nombreux supports, en particulier
des supports base de silice ou de polymres organiques rigides, qui permettent l'utilisation de ces supports en HPLC
(ce n'est pas le cas du Sephadex). Ces colonnes, le plus souvent de taille rduite par rapport aux prcdentes, mais
galement plus rsolutives et donnant des sparations plus rapides (car autorisant l'emploi de dbits linaires
beaucoup plus levs) sont utilises des fins analytiques :
- avec des phase mobiles aqueuses pour les macromolcules biologiques (essentiellement protines) et avec des
phases stationnaires conues pour minimiser les phnomnes d'adsorption et de dnaturation.
- avec des phases mobiles organiques pour l'analyse des polymres en chimie organique (ex polystyrnes).

6-2-6-La chromatographie d'affinit


Ce mode de chromatographie connat depuis 1970 un dveloppement sans prcdent et est appel prendre une
place encore plus grande avec l'essor des biotechnologies.
Le principe consiste utiliser une phase stationnaire constitue d'un support (silice, polymre) sur lequel on a greff
une molcule organique particulire qui prsente une affinit slective pour certains constituants d'un mlange dont on
cherche les isoler. Ceux-ci vont tre slectivement adsorbs ou tout au moins retenus sur la colonne, tandis que les
autres composants sont trs rapidement lus. Un changement de la phase mobile (pH, force ionique ou ajout d'un
comptiteur) permet ensuite d'luer les substances intressantes, avec un facteur de purification pouvant atteindre
1000.
La chromatographie d'affinit s'utilise avec des colonnes basse pression ou des supports haute performance
(HPLAC). Nous allons illustrer cette technique avec quelques exemples trs classiques ou moins courants.
Techniques en basse pression :

- isolement des ARNm polyA+ sur colonne d'oligodT- ou polyU- sepharose partir d'un extrait d'ARN total (les ARNm
reprsentent 1% du total)
- purification de rcepteurs hormonaux avec des colonnes sur lesquelles on a fix des molcules d'hormones
- un degr de spcificit trs infrieur, les colonnes sur lesquelles sont greffes des ions boronate ont une affinit
pour les diols cis et permettent de fixer entre autres les sucres.
Techniques en haute pression ( titre d'exemple) On donnera ici comme exemple le choix offert par un fabricant
(Pierce Eurochemie) :
Type de phase stationnaire

Type d'application

Protine A (de Staphylococcus aureus)

Immunoglobulines

Bleu Cibacron

Enzymes (ex. dshydrognases)

Boronates (affinit pour diols 1,2 ou


1,3)

Nuclosides, nuclotides, ARNt,


Glycoprotines, sucres

Concanavaline A (lectine)

Glycoprotines, sucres

Trsyle activ (pour faire sa colonne)

Sert fixer amines primaires et thiols

6-2-7-Techniques pour la sparation d'nantiomres


La sparation d'isomres optiques est un problme qui se pose souvent en biologie, o beaucoup de molcules
possdent un (ou plusieurs) carbone(s) asymtrique(s) : exemple des acides amins, des hydrocarbures insaturs,...
La synthse chimique, pour sa part, conduit souvent des mlanges d'isomres qu'il faut ensuite de sparer afin
d'isoler le compos biologiquement actif (exemple des phromones). Or ces substances ont des proprits chimiques
souvent trs voisines et ne sont que mal spares par les techniques de chromatographie liquide conventionnelles. On
a recours alors des mthodes plus sophistiques qui font souvent appel l'utilisation de substances optiquement
actives, soit dans la constitution de la phase stationnaire, soit mises en solution dans la phase mobile. Nous nous
bornerons ici donner quelques exemples, les possibilits tant en fait trs nombreuses.

Sparation des aminoacides D et L


Le mode de chromatographie utilis est celui dit de "l'change de ligandes". On met profit l'existence d'une
formation de complexes entre les mtaux de transition (Cu, Zn, Cd, Ni) et les aminoacides.
- dans le mode statique, la phase stationnaire est greffe avec de la L-Proline par l'intermdiaire d'un
bras et forme un complexe avec des ions Cu++. Cette structure qui comporte deux carbones
asymtriques est hautement stroslective et interagit de faon trs diffrente avec les aminoacides
des sries D et L, qui sont donc retenus de faon trs distincte.
- dans le mode dynamique, la phase stationnaire est un changeur de cations et contient des ions Cu++
ainsi que de la L- ou D-proline. Les complexes forms sont retenus diffremment des formes non
complexes, et ceci a pour consquence de sparer les formes D et L des aminoacides injects sur la
colonne.
Sparation d'isomres en utilisant des complexes d'inclusion
Cette mthode utilise des cyclodextrines (polyosides cycliques forms de 6, 7 ou 8 units glucose) formant une
structure torique au sein de laquelle certaines molcules peuvent s'inclure de faon rversible et d'une faon qui
dpend fortement de leur structure spatiale.
- dans le mode statique, la mthode utilise des phases greffes avec des cyclodextrines
- dans le mode dynamique, on dissout une cyclodextrine dans le solvant.
Dans un certain nombre de cas, cette mthode s'avre trs efficace pour sparer des isomres.
Ce mode de chromatographie est encore peu utilis, mais il est en fait assez rcent (surtout l'usage des
cyclodextrines) et son utilisation devrait se dvelopper assez rapidement.

Ren Lafont

Dernires modifications : 28 juin 2005


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