UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ECOLOGIA E RECURSOS

NATURAIS

APOSTILA
MTODO ESTEREOLGICO

Prof. Dr. Steven F. Perry

ALUNOS:
Aurlia de Ftima Mazon
Carla Cristina Cavalcante Cerqueira
Cssio Arilson de Andrade
Eliane A. Santos Monteiro
Fbio de Jesus Castro
Flvia Santanna Rios
Guilherme Henrique Dyonisio Pinheiro
Jesiel Mamedes Silva
Jorge Takasusuki
Marcos Flvio Pdua Ges de Moraes
Marise Margareth Sakuragui
Odila Rigolin de S
Oscar Tadeu Ferreira da Costa
Roger Nicolas Bulin
Sandro Estevan Moron

ESTEREOLOGIA

PRNCIPIOS GERAIS

Atravs de uma produtiva cooperao entre gelogos, metalrgicos, anatomistas,

bilogos, matemticos e vrios outros profissionais ligados aos aspectos geomtricos das
estruturas, surgiu uma cincia relativamente recente, a Estereologia. Uma melhor
descrio do significado deste termo pode ser obtida pelos conceitos a seguir:
WEIBEL: "Estereologia um conjunto de mtodos matemticos que relaciona
parmetros tridimensionais que definem a estrutura a partir de medidas bidimensionais
obtidas em cortes da estrutura".
HANS ELIAS (International Society for Stereology): "A estereologia, sensu
stricto, trata de uma srie de mtodos que permitem a extrapolao da
tridimensionalidade a partir de seces bidimensionais de um corpo ou de suas projees
numa determinada superfcie. Desta forma, a estereologia pode tambm ser chamada de
extrapolao do espao bidimensional ao tridimensional".
LEWIS WOLPERT: "A estereologia uma ferramenta absolutamente essencial
para todo bilogo que precisam conhecer as unidades de um sistema qualquer, sejam elas,
unidades funcionais ou simples estruturas. uma tcnica que permite a obteno de
dados sobre um conjunto de objetos "identificveis" de uma estrutura tridimensional
atravs de uma amostra bidimensional. Apresenta como grande virtude um rigoroso
fundamento matemtico, que aliado a regras particulares de contagem, fornece medidas
realistas e indicadores de preciso do objeto estudado".
Na prtica, os mtodos estereolgicos fornecem uma estimao de volume, rea
superficial, comprimento e quantidade por unidade ou volume de referncia e isto,
baseado em valores bidimensionais de "amostras fiis" (unbiased samples). importante
salientar que a estereologia uma cincia de probabilidades e no um mtodo de
reconstruo de objetos tridimensionais. O conjunto de tcnicas e mtodos utilizados na
estereologia moderna, sero descritos a seguir, atravs de uma srie de exemplos
utilizados na pesquisa biolgica.
Exemplo tpico de aplicao: Calculo da rea da superfcie pulmonar de
ovinos.
Crianas nascidas prematuramente com oito meses de gestao, possuem menos
chance de sobrevivncia do que as que nascem prematuramente aos sete meses de
gestao. Elas morrem por insuficincia pulmonar. Uma razo para isto pode ser que nos
pulmes de crianas mais desenvolvidas (8 meses) os alvolos so menores e mais
difceis de inflar, que os alvolos grandes observados em crianas menos desenvolvidas
(7 meses de gestao). Com a finalidade de testar esta hiptese foram realizados

experimentos com ovinos. Micrografias foram tiradas dos pulmes de ovinos recmnascidos por meio de cesariana com 80 e 100% da gestao. Baseado nestas fotografias,
podemos determinar a rea da superfcie pulmonar durante a ltimo perodo de gestao.
Este exerccio visa verificar se houve alterao na rea de superfcie pulmonar
durante os ltimos 20% do perodo de gestao.
A superfcie expressa como se segue: 1) pelo volume relativo do pulmo; 2)
pelo volume relativo ou absoluto da massa corporal.
A rea de superfcie relativa ao volume do pulmo, ser considerada como a
relao superfcie por volume (SV). A superfcie absoluta (SL) dada pela equao SL=
SV . VL, onde VL o volume do parnquima pulmonar. A rea de superfcie (SM) em
relao a massa corporal (MB) dada por SL/MB.
O "parnquima" pulmonar (+/- 20% do pulmo) constitudo de tecido
respiratrio (paredes alveolares e capilares) e pelo espao ocupado pelo ar. As estruturas
de conduo de ar e sangue, assim como o tecido conectivo so definidos como "no
parnquima".
Colocando-se aleatoriamente uma transparncia contendo uma grade de teste (test
lines) sobre a fotografia podemos determinar a SV dos pulmes.
1. Coloque sobre a fotografia a grade de teste (Figura 1) .

Figura 1 Fotomicrografia de pulmo de ovino e grade de teste.

Dados:
- MB : 4,779 kg
- VL : 81.5 cm3
- d : 12,6 . 10-4, corresponde ao comprimento de cada linha teste, considerando
inclusive o aumento da fotografia
- PT: 168, corresponde aos pontos iniciais e finais das linhas teste sobre
"parnquima"

2. Calcule o comprimento das linhas teste LT, que caem sobre o parnquima pulmonar
da seguinte maneira:
a) Identifique as partes no parnquimticas (ductos de ar, vasos sangneos e tecido
conectivo), marcando as na transparncia.
b) Conte os pontos (iniciais e finais) PT das linhas de teste que caem sobre o
parnquima.
c) Calcule o comprimento das linhas de teste LT que incidiram sobre o parnquima
-4
LT = d/2 . PT = 1058,4 . 10

Onde: d corresponde ao comprimento de cada segmento de linha teste em cm. No

esquea de considerar o aumento da fotografia.
3. Conte as interseces (I) das linhas teste com a superfcie pulmonar. Lembre-se que
as paredes entre os alvolos possuem duas superfcies de troca gasosa.
I = 50
4. Calcule a interseco (IL) por unidade (e.g. cm) de comprimento do total de linhas
teste (LT).
Onde : I o nmero de interseces e LT representa o comprimento das linhas teste,
considerando o aumento da fotografia.
IL = I/LT =

0,047 . 10-4 cm-1

5. Calcule a relao entre a rea de superfcie (SL) e o volume pulmonar (VL) a partir da
frmula:
-4
-1
2 IL = SV = SL/ VL = 0,094 . 10 = 940 cm

6. a) Calcule a rea de superfcie absoluta (SL) para a fotografia a partir da frmula:

SL= SV . VL = 7,66
b) Calcule a superfcie do pulmo por unidade de massa corporal (SM)
SM = SL/ MB = 1,602
Unidades:
MB (kg) ; VL (cm3); SV (cm-1); SL (m2); SL /MB (m2 / kg)
OBSERVAO: Aps ter-se estimado a superfcie pulmonar respiratria dos ovinos
com 80 e 100% de gestao, compare os resultados obtidos para averiguar a veracidade
da hiptese testada.

AMOSTRAGEM

Toda anlise cientfica quantitativa requer grande objetividade e rigor

metodolgico. Este rigor se estende desde o planejamento do estudo, passando pela
amostragem de unidades fundamentais e suas respectivas sub-unidades at a obteno
dos dados e sua anlise.
Nos trabalhos envolvendo microscopia, impossvel se examinar a integralidade
do objeto de interesse, consequentemente, uma amostra descritiva deve ser retirada. A
natureza da amostra de fundamental importncia na determinao da qualidade da
estimativa e, portanto, na validade da investigao.
O sistema ou forma de amostragem mais simples, e que se enquadra nos
requerimentos estatsticos necessrios em investigaes cientficas aquele onde os
campos so amostrados sistematicamente e independentemente do contedo e da
influncia do observador, porm, todos devem estar contidos em uma regio corretamente
definida. Uma boa amostragem precisa preencher dois requerimentos bsicos: preciso e
eficincia.

1. Amostragem randmica uniforme

Amostragem casual necessria porque os objetos biolgicos variam com a
posio e orientao espacial. Se o contedo no variar com a posio, o objeto dito
ser homogneo. Ex. O crtex cerebral muito homogneo em termos de sua
citoarquitetura. Se o contedo no variar com a orientao o objeto dito ser
isotrpico. O crtex cerebral no isotrpico porque formado por vrias camadas,
e entre essas camadas processos celulares esto alinhados paralelo e ortogonalmente
sua superfcie apical. Nervos perifricos, pele, trato gastro-intestinal e msculo
esqueltico so exemplos de sistemas anisotrpicos.
Embora a combinao de homogeneidade e isotropia seja rara em sistemas
biolgicos, a amostragem casual permite-nos negociar com a realidade prtica e
heterogeneidade estrutural e anisotrpica.
O objetivo da amostragem casual simples dada a todas as partes do
especimen a mesma chance de ser selecionada para a anlise. Qualquer falha neste
processo invalida qualquer tentativa da amostra selecionada ser representativa.
Uma amostra casual uma amostra imparcial (unbiased) capaz de gerar resultados
satisfatrios. Uma amostra influenciada pode ser precisa (reproduzvel) mas no
acurada.

O procedimento para preparar especimens para microscopia

essencialmente hierrquico. Blocos so retirados do especimen principal, seces so
feitas dos blocos, campos das seces so examinados e medidas so feitas nos
campos (Figura 2).

Figura 2. Demonstrao de amostragem para microscopia. Para quantificao

importante que a seleo dos objetos, blocos, seces, etc., sejam randomicamente
amostrados.
Todo passo introduzir erro na amostragem, o qual adicionado s diferenas
naturais as quais existem entre os organismos. Dessa forma como no temos controle
sobre o ltimo, a forma mais efetiva de minimizar diferenas individuais estudar um
nmero adequado de organismos.
Em estereologia, a casualidade introduzida de 2 formas: na posio e orientao
dos cortes.
2. Amostragem randmica sistemtica
Em uma amostragem casual, a posio de cada item na amostra uma escolha
independente. Embora imparcial (unbiased), este tipo de amostragem geralmente no o
mais eficiente, pois algumas reas do especimen podem ser super-amostradas e outras subamostradas. Para que todas as reas sejam mais uniformemente amostradas, utiliza-se a
amostragem randmica sistemtica. Na amostragem sistemtica, o primeiro item da
amostra escolhido randomicamente (atravs de uma tabela de nmeros aleatrios anexo
1), mas determina as posies ou orientaes de todos os outros itens.
EXEMPLO: Queremos realizar uma amostragem randmica sistemtica de segmentos de
uma linha (comprimento da linha = 1m ou 1000 mm) e queremos amostrar oito segmentos
no total, os quais constituem uma frao de 8/1000 da linha total. O espao entre os
segmentos ser 1000/8, o qual 125 mm. Para simplificar vamos arredondar para 120 mm.
Para obtermos uma amostragem randmica sistemtica ns precisamos de um nmero
randmico entre 1 e 120. Isto pode ser obtido multiplicando-se um nmero randmico Z,
entre 0 e 1, por 120. Por exemplo, se o nmero randmico for 0,392 o primeiro segmento

seria 120 x 0,392 = 47 ou simplesmente escolha atravs de uma tabela de nmero

randmicos um nmero entre 001 e 120. O outro segmento seria uma distncia sistemtica
de 120 mm partir dos 47 mm, o qual definiu o primeiro ponto. Assim, a linha seria
amostrada em 47, 167, 287, 407, ...., 887 mm. Estes oito segmentos constituem uma
amostragem randmica sistemtica da linha.
1 metro

47

167......

887

Variaes
Podem ocorrer dois tipos de variaes:
- Variao Biolgica - os estereologistas assumem uma variao de 15% em
uma populao
Este tipo de variao pode ser reduzido aumentando-se o tamanho da amostra.
- Variao sistemtica - relacionada ao erro humano e estimada em 10%
OBS: Recomenda-se uma pausa a cada hora e meia quando se faz estereologia, pois
os erros aumentam significativamente aps este perodo.
"O Fractionator"
O "fractionator" o sistema de amostragem mais simples utilizado em
estereologia, e talvez por esta razo, o mais preciso. O princpio o seguinte: Retira-se
uma frao do objeto, por exemplo, um milsimo. Conta-se todas as partculas presentes
nesta frao. Uma estimativa imparcial do nmero total de partculas presentes no objeto,
consistir no nmero de partculas contadas multiplicado pela frao, no caso 1000.
Entretanto, imprescindvel que a frao obtida seja conhecida e que satisfaa uma
probabilidade randomicamente uniforme, ou seja, que toda parte do objeto tenha tido a
mesma chance ou probabilidade de ter sido includa na amostragem.
Para ilustrar melhor o princpio, utilizaremos o seguinte exemplo:
As letras presentes em uma folha de jornal representam uma populao de
partculas. O objetivo estimar o nmero total N de partculas (letras) da folha.
Procedimento:
1. Prepare a folha, retirando figuras e eventuais espaos em branco.
2. Corte a folha ao meio e em seguida corte uma das metades em 20-30 pedaos.
- arranje os pedaos por ordem de tamanho como demonstardo abaixo

ooooooooo)

(ooooo

- colete uma amostra retirando um pedao a cada dois (veja setas acima). Esta
amostragem sistemtica chamada "fractionator"
(ooooooo) Frao amostrada = 1/2
3. Sub-amostragem
A. Corte a amostra acima em 20-30 pedaos
B. Arranje como feito anteriormente
C. Retire sistematicamente 1/3 dos pedaos
- para iniciar a amostragem, escolha randomicamente com o auxlio de uma
tabela de nmeros randmicos, um nmero entre 1 e 3
- colete os pedaos e dispense o restante
- a frao amostrada agora corresponde a 1/2 x1/3 = 1/6
4. Repita os itens A-C, porm, sub-amostre 1/4 do material
- frao amostrada = 1/4 x 1/6 = 1/24
5. Repita A-C, amostrando 1/5 do material
- frao amostrada = 1/24 x 1/5 = 1/120
6. Conte o nmero de partculas (letras) na amostra. Toda letra que tiver pelo menos sua
parte inferior direita representada na amostra ser considerada.
- Nmero de partculas = X
- Estimao do nmero total No = 120 . X
7. Pegue a segunda metade da folha e repita o procedimento
- frao amostrada = 1/120
- nmero de partculas = Y
- estimao do nmero total Ne = 120 . Y
- O nmero total final estimado N :
N = 1/2( No + Ne)
8. Pode se estimar o coeficiente de variao pela frmula abaixo:
CV = [1/3n (No - Ne / No + Ne )2]1/2
onde n corresponde ao nmero de folhas (neste exemplo n =1)
Este mesmo procedimento pode ser aplicado a vrios tipos de objetos de estudo
(e.g. rim, bao, fgado, etc...).
Uma caracterstica importante do "fractionator" a no necessidade de medidas
dimensionais (aumento do microscpio, espessura da seco, etc.) o que torna a

estimativa totalmente independente das deformaes que por ventura possam existir ( ex.
encolhimento e/ ou inchao).

VOLUME DE REFERNCIA
Para estimar-se o volume de uma determinada estrutura, necessrio conhecer
um Volume de Referncia.
O mtodo para estimar o volume de referncia mais comumente usado em
estereologia o Mtodo de Cavalieri (Cavalieri, 1635; Gundersen and Jensen, 1987).
Outros mtodos que podem ser mais apropriados, incluem simplesmente pesagem e
imerso em gua. Se o rgo apresenta consistncia e densidade conhecidas, ento
determina-se o volume diretamente atravs da pesagem. A volumetria usando imerso em
gua baseia-se no Princpio de Arquimedes do deslocamento dos fluidos. Contudo, se o
rgo possuir cavidades que se abrem para o meio externo, como o pulmo, o volume
subestimado atravs deste mtodo.
Para a determinao do Volume de Referncia os mtodos mais freqentemente
empregados so : Deslocamento de Volume e do Princpio de Cavalieri:
1. DESLOCAMENTO DE VOLUME
Recomenda-se a utilizao de tecidos frescos. Se forem utilizados tecidos
fixados, deve-se ter o cuidado de utilizar um fixador que provoque o mnimo de retrao
no material. Para mamferos, o fixador recomendado Glutaraldedo a 2% em tampo
levemente hipertnico, aproximadamente 350 mOsm.
Mtodo:
O volume determinado atravs da imerso do corpo em fluido e registro do peso em
balana (Fig. 3).
1) Sobre o prato de uma balana, colocar um frasco contendo soluo fisiolgica ou
tampo.
2) Tarar a balana
3) Prender o rgo no suporte e mergulhar na soluo, sem que ele toque no fundo ou
nas paredes do frasco.
4) A diferena de massa indicada pela balana revela o volume do rgo.

Tampo

Figura 3. Esquema de utilizao do mtodo de deslocamento de volume.

Ex: Determinar o nmero de clulas de Purkinje no cerebelo.
(MB = massa corporal, VCB = vol. cerebelo, VPC = vol. clula de Purkinje)

2. PRINCPIO DE CAVALIERI
Em certos casos no possvel medir o volume de uma estrutura pelo Mtodo do
Deslocamento, por exemplo quando o rgo muito pequeno ou quando impossvel
separar a estrutura estudada de outros rgos ou tecidos. Nestes casos, utiliza-se o
Princpio de Cavalieri. Este mtodo possibilita a estimativa de volumes confiveis,
mesmo em rgo com formas irregulares.
O matemtico italiano Cavalieri (1598-1647) mostrou que o volume de um
objeto (V) pode ser estimado a partir de seces paralelas separadas por uma distncia
conhecida (t), somando-se as reas de todas as seces transversais do objeto (
A) e
multiplicando este resultado por t (Gundersen et al., 1988).
A nica condio imposta por este mtodo que o primeiro corte seja randmico
no objeto. A estimativa completamente independente da orientao do conjunto de
cortes e da forma do objeto (Figuras 4A e 4B).

t1

t2 ..................... t n

Figura 4A. Esquema de utilizao do mtodo de Cavalieri. (t1 = t2 = t3......t n )

T = ti
_
_
V = t A (V= volume, t = espessura, A = rea)

Figura 4B . Seco transversal do objeto

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Mtodo:
1) Mede-se o comprimento do rgo com uma rgua, na direo perpendicular a que se
vai cort-lo.
2) Utilizando-se um Normograma (4C), determinar o nmero de cortes necessrios de
acordo com a complexidade do rgo.
3) Calcular a espessura (t) do corte dividindo-se o comprimento do rgo pelo nmero
de cortes que sero feitos.
4) Para determinar-se o ponto de incio dos cortes, escolhe-se um nmero menor ou
igual a t na tabela de nmeros randmicos (anexo 1), multiplica-se este nmero por t
e divide-se por 10.
5) Os cortes devem ser virados, de modo que a mesma face de todos os cortes fique
voltada para cima.
6) O corte que no possuir uma rea de corte na face correspondente aos demais deve ser
descartado.
7) Utilizando-se novamente o normograma, determina-se o nmero de pontos que
necessitam ser contados, de acordo com o Coeficiente de Erro (CE) permitido.
8) Escolhe-se uma grade isotrpica cujo nmero de pontos coincidentes com todos os
cortes ao mesmo tempo seja semelhante ao nmero de pontos encontrados no
normograma. Mede-se a distncia entre dois pontos na grade (d).
9) Conta-se o nmero total de pontos (P) coincidentes com todos os cortes.
10) Calcula-se a rea (A) dos cortes:
A = P x d2
11) Calcula-se o Volume (V) do rgo:
V=txA

11

Figura 4C. Normograma para predizer o nmero de cortes necessrios de acordo com a
complexidade do rgo. Quanto mais complexo o rgo maior nmero de pontos devem
ser utilizados. (Gundersen & Jensen, 1987).

12

Exemplo:
1) Mediu-se o comprimento de um modelo de um rgo feito com massa plstica,
obtendo-se 46 mm ou 4,6 cm.
2) Considerando-o como um rgo de baixa complexidade, encontrou-se no
normograma que so necessrios cerca de 5 cortes.
3) Calculo-se a espessura de cada corte:
t = comprimento (mm) / no de cortes => t = 46/5 t = 9,2 mm ou 0,92 cm
4) Escolheu-se um nmero randmico na tabela, obtendo-se 7, o qual foi multiplicado
por t para obter-se o ponto de incio dos cortes:
Ponto de Incio = 7 x 9,2 mm /10
Ponto de Incio = 6,4 mm ou 0,64 cm
5) Foram feitos, ento, 5 cortes com espessura de 9,2 mm a partir do ponto de incio.
6) Atravs do normograma determinou-se que seriam necessrios de 20 a 30 pontos para
um CE=0,05.
7) Uma grade isotrpica, cujo d = 0,6 cm, foi colocada foi colocada sobre os cortes e os
pontos foram contados, obtendo-se P = 20
8) A rea foi calculada: A = 20 x (0,6)2 => A = 7, 20 cm2
9) O volume foi calculado: V = 0,92 x 0,72=> V = 6,62 cm3.

Aps a determinao do volume de referncia, pode-se estimar o nmero de

clulas de Purkinjie, nmero de clulas cloreto, etc. por unidade de volume de referncia,
como nos exemplos a seguir:
Exemplo A: Quantas clulas de Purkinje existem no cerebelo de um rato ?
1) Quantas clulas de Purkinje por unidade de peso do animal ?
VCB/MB * VPC/VCB = VPC/MB
onde VCB o Volume do Cerebelo; MB a Massa do Corpo e VPC o volume ocupado
pelas clulas de Purkinje.
2) Quantas clulas de Purkinje existem no vermis comparado com a aurcula ?
VPC/VAU * VAU/VCB * VCB/MB = VPCAU/MB
onde VAU o Volume ocupado pela aurcula e VPCAU o Volume ocupado pelas clulas
de Purkinje na aurcula.
Exemplo B: Quantas clulas de cloreto existem nas brnquias de um determinado peixe ?
VGI / MB * VFI

+ SL /VGI

* VFI / VFI

+ SL

= VFI /MB

13

ou
VGI / MB * VFI

+ SL /VGI

* VSL / VFI

+ SL

= VSL /MB

onde VGI o Volume das Brnquias; MB a Massa do Corpo; VFI o Volume ocupado
pelos filamentos branquiais; VSL o volume ocupado pelas lamelas secundarias e VFI + SL
o volume ocupado pelos filamentos e lamelas respiratrias simultaneamente.

VOLUMETRIA
MTODO DELESSE:
Teorema de Delesse:
Num plano seccional mdio, a frao de rea de um componente igual a
frao de volume que este componente ocupa dentro do todo.
A / AREF = V/ VREF
onde A a rea; AREF a rea de referncia; V o volume e VREF o
volume de referncia.
Exemplo: Medir o Volume de Mitocndrias nos Hepatcitos
VLIV / MB x VHEP / VLIV x VML / VHEP = VML / MB
onde VLIV o volume do fgado; MB a massa do corpo; VHEP o volume
ocupado pelos hepatcitos e VML o volume ocupado pelas mitocndrias .
A amostra precisa ser bem representativa do total (uniforme).
A amostra deve ter uma Distribuio Uniforme
Direo Isotrpica e
Distribuio Randmica
A grade (Test Probe) tambm deve ser Uniforme
Isotrpica
Randmica
em relao amostra.
Exemplo:
Tem-se um cubo de parafina com as seguintes dimenses: 102,29 x 99,70 x
81,48 mm. Este cubo contm 50 pequenos cubos pretos, sendo que cada um possui
as seguintes dimenses: 1,5 x 1,4 x 1,4 mm. Deseja-se saber qual o volume
ocupado pelos 50 cubos pequenos dentro do cubo maior. O volume do cubo maior
ser o volume de referncia.

14

Volume de Referncia: 102,29 x 99,70 x 81,48

VREF = 830,9 cm3
O cubo grande foi cortado em 7 seces com 1 cm de espessura. O volume
dos cubos pretos foi determinado atravs da avaliao da sua rea superficial em
cada corte (Figura 6A). Para medir a rea, utilizou-se duas grades (P4 e P5) para
verificar qual a mais eficiente (Figura 6B e 6C). Cada grade possua dois tipos de
pontos, grossos e finos. Foram contados o nmero total de pontos que incidiam
sobre cada corte (Pt) e o nmero de pontos sobre os cortes dos cubos pretos (Pi).
As reas so determinadas pela contagem de pontos e a relao dos pontos
testes com os pontos de referncia a mesma da rea teste com a rea de referncia.

Figura 6A. Esquema do cubo de parafina.

Figura 6B. Grade P4 observe que os pontos esto mais espalhados (menor
15
nmero de pontos por unidade de rea)

Figura 6C. Grade P5 Observe que os pontos esto mais concentrados.

Maior nmero de pontos por unidade de rea.

Tabela I. Clculos do volume de referncia do cubo de parafina.

Grade P4

Grade P5

Grosso
Corte
1
2
3
4
5
6
7

Fino

Grosso

Fino

Face
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B

Pi
1
3.5
1.66
3
1.25
5
2.8

Pt
13.8
15
12
14
14
14
14

Pi
28.4
25
18.6
30.7
29.5
30
22.8

Pt
132.2
128
126.6
127.2
130
125
134

Pi
1.4
1
1.25
1.25
1.25
2.25
2.25

Pt
6
6.3
6.75
7.5
6.75
7.5
7.5

Pi
32
31.5
25.75
32
33.2
32.75
30.25

Pt
155
154
154.25
154
149
157.5
154

X=

2.6

13.8

26.4

129.7

1.52

6.9

31.06

153.96

SD
XPi/xPt
V CUB

1.42

0.89

4.5

3.2

0.51

0.61

2.52
2.53
0.235

0.19

0.205
168.7

0.22

16

Ateno!! No se esquea que voce analisa somente uma das faces cortadas, ou seja,
as faces A ou as faces B, pois teoricamente a face 1B e a face 2A, por exemplo, contm a
mesma estrutura. Observe a tabela acima e veja que foram analisadas somente as faces B do
cubo.
Vcubo / VREF x VREF = Vcubo
(xPi/xPt) x VREF = 0.203 x 830.9 Vcubo = 168.7 cm3
Atravs da estereologia o volume do cubo foi estimado em 168.7 cm3, enquanto o
volume do cubo calculado foi: 50 cubos x 1.4 cm x 1.4 cm x 1.5 cm = 147 cm3.

REA SUPERFICIAL : SUPERFCIE EM VOLUME

A estimativa da superfcie requer uma srie de grades lineares. A relao entre o
nmero de interseces (entre a superfcie de interesse e os elementos da grade linear) e a
rea superficial por unidade de volume dada pela equao:
SV = 2 IL
que significa que a densidade superficial equivale ao dobro do nmero de interseces
por unidade de comprimento da linha-teste no espao de referncia.
Esta equao um estimador imparcial da densidade superficial somente se a
superfcie, ou as linhas da grade ou ambas forem isotrpicas. Neste contexto, as linhas
devem ser isotrpicas no espao tridimensional.

Determinao da Orientao de uma estrutura atravs do Diagrama de Rose:

Este mtodo determina se uma estrutura assume uma orientao isotrpica ou
anisotrpica (vertical), e deste modo, decidir-se que tipo de grade mais adequada.

1) O Diagrama de Rose deve ser colocado sobre a micrografia.

2) Verificar o nmero de interseces da estrutura de interesse com cada raio (ngulo) do
diagrama.
3) Construir um grfico a partir do nmero de interseces contra os ngulos.
4) De acordo com o tipo de curva obtida, determina-se se a estrutura isotrpica ou
anisotrpica (vertical).

17

Grfico 1
Exemplo de Orientao Isotrpica

Grfico 2
Exemplo de Orientao Anisotrpica
18

16

3.5

14

Nmero de
Interseces

3
2.5
2
1.5
1

12
10
8
6
4
2

0.5

338

67.5
90

248

113
225

135
158

270

113
225

135
203

158
180

180

IUR
Usa-se qualquer tipo de grade
Ex.: matriz retangular, expanded circular Merz Grid

90

248

VUR
Usa-se grade ciclide

Figura 7. Grficos de orientao e diagramas de Rose.

DETERMINAO DA REA SUPERFICIAL: IUR OU VUR?

O conhecimento da rea superficial de uma estrutura um indicador valioso da
eficincia desta superfcie em determinado processo fisiolgico. Um dos mais rotineiros
exemplos a estimao da superfcie total para trocas gasosas no pulmo de mamferos.
O valor obtido um excelente parmetro para se avaliar a eficincia das trocas gasosas
em determinada circunstncia.
A estimao da rea superficial exige que sejam adotados mtodos que forneam
algum grau de casualidade (randomness) na orientao das seces obtidas. Esse fato
contrasta com os mtodos para a estimao do volume e nmero de partculas que no
exigem este requerimento. Sendo assim, descrevemos abaixo dois mtodos que obedecem
tais requerimentos.

18

315

337.5

270

67.5

292.5

225

247.5

45

203

22.5

10

293

1
270

20
15

315

45

293

180

0
22.5

315

202.5

Diagrama de Rose
Orientao Anisotrpica

0
338

135

ngulos

ngulos

Diagrama de Rose
Orientao Isotrpica

157.5

90

112.5

45

0
315

337.5

270

292.5

225

247.5

180

202.5

135

157.5

90

112.5

45

67.5

22.5

67.5

22.5

Nmero de
Interseces

4.5

A gerao de seces IUR (isotropic uniform section)

Seces isotrpicas uniformes (isotropia: uma completa direo ao acaso) so
necessrias para um grande nmero de procedimentos estereolgicos. Mattfeldt et al.
(1990) descreveu a utilizao do Orientator como um simples e prtico mtodo para se
obter seces IUR de qualquer material.
Geralmente, o material includo em alguma substncia que permita a realizao
de cortes sem a distoro do mesmo. Arbitrariamente faa um corte em uma das
superfcies do bloco contendo o material. O bloco colocado no centro de um crculo
com eqidistantes divises ao longo de seu permetro (Fig. 8). Um nmero ao acaso entre
as divises do crculo ser selecionado e o bloco ser cortado perpendicularmente ao
plano do crculo. Em seguida, a superfcie cortada ser voltada para baixo e disposta
sobre um outro crculo com divises no-eqidistantes entre si. Um novo nmero ao
acaso ser selecionado e indicar a nova direo de corte do bloco. A ltima seo
cortada isotrpica uniforme, IU, isto , esta seo no tem relao com a primeira
seo, assim, ela foi obtida a partir de todas as possveis orientaes com probabilidade
constante (uniforme).
Por definio, uma seo isotrpica simplesmente um plano que perpendicular
a uma orientao isotrpica. Em estruturas que no apresentam um bvio eixo de
anisotropia (p/ ex. fgado), as seces IUR podem ser obtidas diretamente por corte do
bloco pr-includo seguido de randomizao da orientao do tecido na incluso final e
microtomia. Entretanto, se existir qualquer dvida em relao a anisotropia das estruturas
no interior do rgo, sugere-se o uso do orientador.

19

Figura 8. O orientator permite a obteno de seces IUR

ANLISE ESTEREOLGICA DE SECES VERTICAIS (VUR vertical

uniform sections)
Qualquer seco que seja perpendicular a um plano horizontal de referncia,
porm arbitrrio, e que tenha uma posio e uma rotao randmica ao redor de um eixo
vertical constitui-se em uma seo vertical, VUR (vertical uniform random).
Um mtodo prtico adequado para gerar linhas isotrpicas sobre um material
seccionado verticalmente foi primeiro desenvolvido por Baddeley et al. (1986). Abaixo
apresentamos um breve resumo desse mtodo:
1. Escolha um plano horizontal como referncia (pode ser a sua mesa de trabalho). Em
seguida, disponha seu material de interesse (um rgo ou parte dele) sobre a mesa. Se
o rgo for tubular, corte-o longitudinalmente. A orientao do rgo por sua
escolha mas, no esquea que a base de apio de seu material corresponde ao plano
horizontal. Em muitos casos a orientao do rgo facilmente identificvel e a base
plana do rgo pode ser assumida como o plano horizontal de referncia (pele,
epitlios planos). Os rgos tubulares (estmago, intestino, etc), quando abertos
longitudinalmente, tambm podem ser assumidos planos e seccionados verticalmente
com sua regio mucosa voltada para cima. Os msculos apresentam planos de seo
vertical naturais (faixas anisotrpicas).
2. Imagine um eixo vertical passando pelo centro de seu material permitindo livre
rotao isotrpica do mesmo sobre o plano horizontal.
3. Seccione o material em intervalos t conhecidos (uniform random position).

20

4. As seces obtidas so VUR em relao ao material. V refere-se a orientao, isto

, todas as seces devem ser perpendiculares ao plano horizontal. UR refere-se a
posio da seo (=corte), isto , os cortes devero ser uniformes (=a probabilidade
de uma seo ser obtida a mesma das demais) e randmicos (paralelos ao plano
vertical).
5. O plano vertical deve ser identificvel em cada seo.
6. Use um grade P2 ou P3 sobre os cortes obtidos (Fig. 9). Para cada cruz do grade que
cai sobre as fatias do rgo, completa ou incompletamente, uma amostra de tecido
dever ser amostrada, seccionada usando um orientator, processada, incluida e
microtomizada para anlise. Uma seo uniforme ao acaso retirada deste bloco
representar uma VUR.
+

+
+
+
Figura 9. Esquema do corte ( esquerda) e da grade utilizada ( direita). A seta indica
um detalhe da grade (como um ponto de referncia).
A idia de seces verticais foi primeiro proposta especificamente para estimar
rea de superfcie (Baddeley et al., 1986). Contudo, o mtodo tem se tornado de uso
geral e o mtodo de amostragem de muitas investigaes biomdicas. A partir de tais
seces uma ampla variedade de parmetros podem ser estimados (Sv, Vv, Nv, Lv,
etc.). A menos que haja uma forte razo para usar seces isotrpicas, as seces
verticais devem representar o mtodo de amostragem preferencial. O sistema de
anlise (grade) usado do tipo ciclide (Fig. 10).

Figura 10. A figura acima mostra uma seco vertical sobreposta com um sistema
de grade ciclide.

21

MEDIDAS DE COMPRIMENTO
Qual o melhor mtodo para medir o comprimento de superfcie?
Como definir o ngulo para determinar as medidas na foto?
Qual a melhor grade para realizar as medidas e como calibr-la em
relao ao objeto?
Utilizaremos as medidas de barreira gua-sangue nas brnquias dos peixes
para elucidar as questes acima.
BARREIRA GUA-SANGUE
Categorias:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

gua-sangue;
gua-gua;
Sangue-gua;
Sangue-sangue;
gua- *;
Sangue- *.

CONSUMO DE OXIGNIO (MO2)

MO2 = KO2 .S/T . PO2 onde:
KO2 = constante de difuso do O2;
S= rea de superfcie das brnquias;
T= espessura da barreira.
PO2 = presso de oxignio

CAPACIDADE DE DIFUSO (DO2)

DO2 = MO2 / PO2 relao fisiolgica
DO2 = KO2 . S/T relao morfolgica

FATOR ANATMICO DE DIFUSO (ADF)

ADF = S/T onde:
S = rea de superfcie das brnquias
T = espessura da barreira

22

REA DE SUPERFCIE RESPIRATRIA % (RSA)

- BRNQUIAS

RSA = ( IWB / IWB + IWW) . 100

-SANGUE RSA = ( IBW / IBW + IBB) . 100 onde:

I = nmero de interseces
Clculos:
1. Mdia harmnica () para todas as fotomicrografias de uma seco
2. Mdia aritmtica das mdias harmnicas para uma dada amostra ou populao
1/ = 1/ti / N

SUPERFCIE EM RELAO AO VOLUME (SV)

Sv = 2 I/LT
LT = L/PTo . PT onde:
LT = comprimento total
L/PTo = 2d = comprimento de um arco ciclide
PT = nmero total de pontos (que caem sobre o arco teste assumindo que o nmero de
pontos testes igual ao nmero de arcos testes)

Para determinar a superfcie em relao ao volume, conta-se o nmero de interseces

(nmero de arcos ciclides) que cortam a superfcie em estudo.
Calibrao da grade = Comprimento de um arco ciclide (Obs. Deve-se calibrar a grade
para cada foto).

23

d = 0, 6 cm

Figura 5. Esquema de corte (em massa de modelar) e grade utilizada.

Calibrao da Grade

2d
d

24

0,5.
.d
Figura 11. Comprimento de um arco ciclide
Clculo de magnificao: Comprimento da fotografia / aumento do objeto
Ex. uma foto com 12 cm de comprimento e 2100x de aumento
12/2100 = 57 m
57 m 12cm de fotografia
x
1cm
x = 4,75 m
1cm de fotografia = 4,75 m

Figura 12. Merz grid

BARREIRA GUA-SANGUE

Escolha um ngulo randomicamente entre 0 e 97 (com o auxlio de uma tabela de

nmeros aleatrios). Para cada objeto estudado um novo ngulo dever ser escolhido.

25

Com o auxlio de uma rgua e mantendo o ngulo escolhido, encontre as interseces

dos arcos ciclides com a barreira a ser medida e determine a distncia (cm ou mm).

Figura 13. Exemplo : Fotomicrografia de lamela secundria.

Clculos:
Comprimento de um arco ciclide 0,53 m
Superfcie em relao ao volume
Lt = 0,53.185 = 98 m
Sv = 2. 12/98 = 0,24 m-1
Tabela II. Clculo da barreira gua-sangue
Distncia da barreira (cm)
3,6
7,5
4,1
3,0
3,0
6,0

x = 4,25 cm = 2,85m
x3-D = x . 0,5 = 2,12 cm = 1,42m
= 3,7 cm = 2,48 m
3-D= 2/3.tn = 2,47 cm = 1,65 m

26

4,8
2,0
= 34

Obs: no esquea de transformar os valores

em m, ou seja, multiplicando por 0,53.

Chave para Anlise de Micrografias com Sistema de Teste Ciclide (VUR)

Micrografia

Use
Noo
aumento da
micrografia

Determine o
comprimento
da foto e
divida pelo
aumento dado.

No

Possui barra
de dimenso?

Calcule
comprimento
arco ciclide
(m)

Sim

Medir o
comprimento da
barra em mm **

Calcule d
(m) e comp.
barra
Calcule Lt:
comprimento total
Lt = L/Pt * PT
PT = n. total de pontos
sobre o tecido.
L/Pt= arco ciclide

Calcule Sv: rea

superfcie por
unidade de
volume.
27
Sv = 2I / Lt
Obter mdia dos

Mantenha sua rgua sempre no mesmo ngulo para fazer

as medidas de espessura da barreira gua-sangue. Faa a
medida sempre quando houver uma interseco do arco
ciclide com a superfcie em contato com a gua.

Use a tabela de no.

ao acaso e
descubra um
ngulo a ser usado
sobre o grade.

Esse procedimento comumente usado para a determinao da espessura da

barreira de difuso de gases em rgos respiratrios (p/ ex. brnquias, pulmo, bexiga
natatria e etc.).

Exerccio Proposto:
1. Determine a espessura da barreira de difuso ar-sangue na micrografia
eletrnica pulmo de cobra (Figura 14).

28

Figura 14. Fotomicrografia de pulmo de cobra (2100 x)

Soluo:
a)Calibrao da magnificao:
magnificao: 2.100x
comprimento da foto: 9 cm
9/2100 = 0,0042 cm ou 4,2 mm
b) comprimento do arco ciclid
0,8 x 4,42 = 3,36
c) Comprimento total:
No. pontos sobre o tecido na micrografia = 43
Lt = L / Pt x PT
Lt = 3,36 m x 43 = 144,48m
d)rea superficial por volume:
No. interseces da sup. em contato com a gua = 8
Sv = 2I / Lt
Sv = 2 x 8 / 144,48m = 0,111m-1
d)Medidas da distncia ar-sangue:

Distncia
(cm)
1,7
1,3

ti 1/ti
0,588
0,769

29

0,8
1,8
0,4
0,3
0,3
X = 0,842
X3-D = 0,421

0,125
0,555
2,5
3,333
3,333
1/ti/N=
1,761
3-D = 0,378

CONTAGEM DE OBJETOS POR UNIDADE DE VOLUME (NMERO POR

VOLUME)
Para estimar o nmero total de objetos (por exemplo, clulas) num determinado
volume , levamos em conta as seguintes caractersticas:
Tabela III. Anlise Estereolgica
PONTOS
linha
plano
dissector

NMERO
Comprimento
rea
Volume

DIMENSO
1
2
3

Tabela IV. Caractersticas geomtricas de objetos 3-D

NOME
volume
superfcie
curva
cardinalidade

MEDIDA
Volume
rea da superfcie
Comprimento
Nmero

DIMENSO
3
2
1
0

Sendo a medida o nmero de objetos e, portanto, com dimenso zero, as grades

utilizadas para determinar volume, superfcie, curva, etc. no podem ser
utilizadas para tal tipo de estimativa. Utiliza-se um disector, com dois planos
paralelos de seco e uma distncia h conhecida entre eles, no qual estaro as
partculas ou objetos a serem contados. Este disector pode ser colocado num
estereomicroscpio e atravs do macromtrico altera-se o foco, podendo ento
observar a amostra em profundidade, ou ainda realizando-se cortes verticais
nos dois planos paralelos para que possa ser analisado em microscpio ptico.

30

Figura 15. Esquema do dissector.

Para contar o nmero de objetos deve-se ter o cuidado de no contar
duas vezes o mesmo objeto e para tanto, analisamos a posio do
mesmo no disector, conforme a figura acima. Objetos que possuem um
dimetro maior do que a espessura do disector aparecem em ambas as
faces e no devem ser contados. preciso conhecer bem o objeto a ser
contado e saber reconhec-lo para efeito de contagem atravs de cortes.
A grade utilizada neste tipo de contagem a seguinte:

Linhas
proibida

Quando os objetos recaem sobre as linhas cheias, eles no so contados

e so excludos da amostragem. So as chamadas linhas proibidas.
Em seguida comparamos dois cortes consecutivos e verificamos quais
objetos se repetem e que sero portanto, excludos tambm. Os cortes
comparados ficam lado a lado, e usamos o da direita como amostragem
e o segundo como look up (Q- direito e Q- esquerdo,
respectivamente).

31

Figura 16. Esquema do dissector e das linhas de contagem.

Para calcular a estimativa do nmero total preciso saber o volume do
disector, atravs da seguinte frmula:
V(dis) = t . A (fra) onde:
V(dis) = Volume do disector
t = espessura do corte
A (fra) = rea da grade/ magnificao da microfotografia
E ento temos o nmero total:
N= NV . V(ref)

TIPOS DE ERRO
Quando estruturas laminares no so cortadas perpendicular ao seu plano, a
espessura superestimada. Os efeitos so como a seguir:

1. Efeito de inclinao: o comprimento aparente (lapp) aumentado do comprimento real

(l0) dependendo do ngulo desvio da perpendicular ():
lapp= l0 / cos

32

2. Efeito Holmes: Quando observamos um cortes histolgico no microscpio ptico, ou

quando observamos cortes ultrafinos na microscopia eletrnica, estamos vendo as
estruturas depois destas serem atravessadas pela luz ou feixe de eltrons,
respectivamente. A imagem ento formada pela projeo das estruturas dentro do corte
no plano focal do sistema ptico. O nmero de estruturas particuladas visto na imagem
no apenas proporcional ao nmero de estruturas, mas tambm espessura do corte. A
isto chamamos de efeito Holmes (Weibel e Elias, 1967).
Portanto a espessura de estruturas opacas superestimada, quando elas no so
cortadas perpendicularmente por causa da espessura limite da seco.
Esta superestimao (l) independente da espessura da estrutura, mas
proporcional a espessura da seco (t) e a tangente do ngulo desvio ():
l = t. tan
A espessura de estruturas transparentes (exemplos: espaos interlamelares)
reduzido no mesmo valor.

3. A combinao destes dois efeitos fornecem a seguinte frmula de correo para

estruturas opacas:
l0= lapp . cos - t . tan
Exemplo: assumindo que seces histolgicas incluem desvios to grandes quanto ao
10% do normal e o ngulo de desvio mdio foi 5, tem-se que para seces de 5 m o l0
corrigido :
l0= 0,996. Lapp- 0,44 onde:
l0 e lapp so em m.

REFERNCIAS

BADDELEY, A. J.; GUNDERSEN, H. J. G. AND CRUZ-ORIVE, L. M. (1986)

Estimation of surface area from vertical sections. J. Microsc. 142: 259-276.
HOWARD, C. V. AND REED, M. G. (1998) Unbiased Stereology. Three-Dimensional
Measurement in Microscopy. BIOS Scientific Publishers. UK.

33

MANDARIM-DE-LACERDA, C.A. (1995) Mtodos quantitativos em Morfologia.

EdUERJ, 131.
MAYHEW, T.M.(1991). The new estereological methods for interpreting functional
morphology from slices of cells and organs. Great Britain, p. 639-665.
MATTFELDT, T.; MALL, G.; GHAREHBAGHI, H. AND MLLER, P. (1990)
Estimation of surface area and length with the orientator. J. Microsc. 159: 301-317.

ANEXO 1 TABELA DE NMEROS RANDMICOS

34

33339999999999

35