Biologa molecular, gentica de protenas

Toda la informacin contenida en el organismo humano est codificada en el

DNA, cuando este es ledo se sintetizan las protenas y stas a su vez como
enzimas permiten formar otras macromolculas. Y esta estructura tendr que
ver con una funcin biolgica en el organismo e incluso el mismo DNA tiene
funcin directa. Y esto significa que si falla la funcin (patologa), falla la
estructura o la informacin. Y si hay una anormalidad por ejemplo un fenotipo
errado, esta estructura generalmente nace porque la informacin est errada.
As, cualquier cuadro patolgico se explica con una informacin errada.
La informacin est contenida en el DNA que se auto preserva por una
replicacin de DNA, y este es ledo por la RNA polimerasa para sintetizar una
molcula de RNA (transcripcin) y sta es traducida a travs de la sntesis
proteica en protenas. Y es dentro de esta que yace la funcin.
Un gen que codifica una protena est compuesto por tres partes:
-

Promotor: Regula la expresin del gen

Gen estructural: Codifica para la protena
Terminador

La transcripcin (RNA polimerasa) reconoce un gen porque reconoce el

promotor, se une a l y empieza a sintetizar el mRNA hasta que llega al
terminador donde termina la sntesis. As, el gen estructural es el que da origen
al mRNA. Todo el mecanismo de regulacin est incluido en al secuencia del
promotor.
La hebra de arriba es la codificante, la cual es exactamente igual en secuencia
al mRNA (Excepto q timina est reemplazada por Uracilo en el mRNA). La hebra
complementaria es la hebra no codificante, pero es la que sirve de templado
para la sntesis de mRNA.
La primera base del mRNA recibe el nmero +1 y la inmediatamente anterior
-1. Y se habla de ro abajo del promotor (downstream) y ro arriba (upstream)
del promotor.

Siempre se anota slo la hebra codificante (5 a 3). Y las protenas siempre se

nombran desde el aminocido n 1 que es el extremo amino terminal y termina
en el carboxilo.
Abreviatura
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y

Ala
Cys
Asp
Glu
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu
Met
Asn
Pro
Gln
Arg
Ser
Thr
Val
Trp
Tyr

Nombre
completo
Alanina
Cistena
cido asprtico
cido glutmico
Fenilalanina
Glicina
Histidina
Isoleucina
Lisina
Leucina
Metionina
Asparagina
Prolina
Glutamina
Arginina
Serina
Treonina
Valina
Triptofano
Tirosina

Tipos de mutaciones
Todas las enfermedades tienen una base gentica y stas tienen que ver con el
origen, persistencia o la susceptibilidad de la enfermedad. Por lo tanto el
genoma no es una molcula esttica, cambia en todos los individuos y stos
pueden ser de 4 tipos:
1. Alteraciones cromosmicas: Como polisomia o intercambio de
cromtidas.
Quiere decir que se pierden o ganan cromosomas. Las cromtidas se
pueden romper o rearreglarse incluso (Desarrollo del cncer,
inmortalidad de las clulas).
2. Insercin o delecin de genes:
- Insercin de una base: Al insertarse una base, como se lee de a
tripletes, se corre el marco de lectura y la secuencia normal de
aminocidos se cambia.
- Delecin de bases: Ocurre lo mismo
3. Mutaciones: Cambio de una base por otra que produce alteracin del
promotor y el gen no se expresa. Alteracin en la estructura y

procesamiento del mRNA por lo tanto da una protena que exageramos.

Hay cambios de un aminocido por otro que produce una estructura
tridimensional de la protena cambiada, enzimas no funcionales, etc.
Todas estas mutaciones producen un fenotipo especfico.
Tanto la mutacin anterior como sta son ms sencillas.
- Sentido errado: Un par de bases es cambiada por otra. Entonces
muta el aminocido.
- Sin sentido: Una mutacin de un par de bases es cambiado y se
genera un codn de trmino y la protena es truncada, por lo tanto
es no funcional.
4. Polimorfismo: No produce un fenotipo evidente.

Nomenclatura de mutaciones
El nmero indica la posicin, donde +1 es la base n 1 del gen estructural. Si
es negativo ser ro arriba, es decir en el promotor del gen. Ejemplos:
A28C = Adenina de la posicin 28 es reemplazada por citosina
K112T = Lisina de la posicin 112 es reemplazada por treonina.

Alteraciones estructura-funcin
1. Prdida o ganancia de la funcin enzimtica: Como por ejemplo:
- Albinismo: Tirosinasa
- Apnea, inducida por droga: Pseudocolinesterasa
- Enfermedad de Lesch-Nyham: Hipoxantina fosforibosil transferasa
1.
A. Ciertas mutaciones pueden subir o bajar un cierto compuesto dentro
del organismo y segn el nivel en el que se encuentre ste producir
diferentes enfermedades. Un ejemplo es el cido rico:
- La gota es alteracin del metabolismo de las purinas por
acumulacin del cido rico por lo que aumenta su nivel
plasmtico, precipitando como cristales en las articulaciones.
Produce cuadros inflamatorios (dolor) y en estado crnico atrofia
de las articulaciones. Es mas frecuente en varones que damas y
se asocia habitualmente con enfermedades asociadas al corazn:
obesidad, dislipedimia (colesterol o TG altos) y diabetes. La causa
puede ser gentica (actividad de la xantina oxidasa), tener que
ver con el aumento del consumo de carnes rojas (rica en xantinas)
o por un problema renal (falla de la eliminacin del urato y por lo
tanto acumulacin. El tratamiento es con alopurinol, el cual es
inhibidor selectivo de la xantina oxidasa, bloquendose y
disminuyendo los niveles del cido rico plasmtico.
- La enfermedad de Lesch Nyham: Ligada al cromosoma x.
Tambin afecta una enzima de esta va, en este caso la

hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HPRT). Se hereda por

el lado materno, lo habitual es que la madre sea portadora y es
habitual slo en hombres. Se produce retardo mental moderado y
falla en el control muscular. La acumulacin de cido rico por la
falla en esta enzima es 10 veces mayor que en la gota por lo que
la probabilidad de que se deposite en las articulaciones es mucho
mayor, producindose grandes depsitos con exacerbadas
reacciones inflamatorias en stas desde beb. Lo que produce las
atrofias. Tambin se trata con alopurinol.
As, tenemos dos enfermedades, una con muy altos niveles de cido
rico y otra con niveles elevados moderados de ste produciendo
cuadros diferentes. Teniendo la enfermedad de Lesch Nyham un
retardo mental moderado porque la alanina es importante en el
desarrollo del sistema nervioso.
- Inmunodeficiencia combinada severa: El nivel de cido rico es
muy bajo. En este caso la enfermedad es por una deficiencia de la
enzima adenosina deaminasa. Como falla no habr hipoxantina,
xantina y no habr cido rico. Lo malo es que se empieza a
acumular AMP y deoxiAMP, lo que afecta la proliferacin de
linfocitos. Esto es porque al aumentar los niveles de AMP y
deoxiAMP se inhiben todos el metabolismo asociado a la sntesis
de nucletidos y DNA, se para la replicacin celular, transcripcin
y biosntesis de ATP. Se mueren los linfocitos y se manifiesta en
una inmunodeficiencia gentica (Nios burbujas).
B. Mutaciones en una nica ruta metablica, pero en diferentes enzimas
de sta, darn lugar a enfermedades completamente diferentes:
- Ruta de degradacin de la fenilalanina: Normalmente es degrada
a tirosina por la fenilalanina hidroxilasa, ocurre una reaccin de
transaminacin donde se pierde el amino y queda como ceto en
el cido hidroxifenilpirvico. Luego, hay una oxidacin a travs de
la cido hidroxifenilpirvico oxidasa
para formar el cido
homogentsico y luego por varios ciclos de oxidacin se
transforma en el cido maleilacetoactico que finalmente es
degradado a CO2 y H2O.
Fenilcetonuria: Una mutacin de la fenilalanina hidroxilasa
hace que se acumule la fenilalanina. Y el paciente presenta
mucha fenilalanina plasmtica y no tiene tirosina. El
aumento de fenilalanina hace que se acumule cido
fenilpirvico el que se elimina por la orina. Sufren cuadros
severos de alteraciones neuronales, son idiotas. Por una
muestra de sangre en recin nacidos se puede ver esta
mutacin, ya que deben ser tratados con una dieta especial
sin fenilalanina. Adems son nios medios rubios y con
cierto grado de cretinismo por la baja de tirosina

Albinismo: Mutacin en la va de tirosina a melanina

Cretinismo: Mutacin va de tirosina a tiroxina. Se acumula
tirosina en el cerebro.
Tirosinosis
Alcaptonuria

2. Alteracin de la estructura 3D de las protenas:

A. Agregacin proteica: Una protena normalmente puede formar
monmeros, dmeros, etc. Y formar una estructura 3D funcional. Pero,
hay ciertas mutaciones que hacen que cambie de conformacin y
exponga aminocidos hidrofbicos hacia el exterior. Esto hace que las
protenas se agreguen espontneamente. Se ha descrito para todo tipo
de enfermedades.
Un ejemplo es la enfermedad de Alzheimer: El pptido ameloide
con una funcin importante en neuronas, en algn momento
cambia conformacionalmente y se agrega formando la placa de
ameloides en neuronas dopaminrgicas. Estos agregados son
txicos y matan a las neuronas produciendo falla neuronal y
aparece demencia, Alzheimer.
- Parkinson: Si ocurre en neuronas dopaminrgicas del hipocampo.
- Creutzfeldt- Jakob: Vacas locas en animales. En este caso se
altera la protena prin y se agrega matando a las clulas.
La clula puede degradar estas protenas agregadas. Es un sistema de
defensa. Por lo tanto, estas enfermedades no slo tienen que ver con
una mutacin de las protenas que favorece la agregacin sino tambin
con un mecanismo por el que no se degraden. Es decir una falla en la
agregacin:
- Sistema de Ubiquitina - proteosoma: Tiene que ver con la
ubiquitina que est e todas las clulas. Se conserva su secuencia
aminoacdica.
Funciona con cuatro enzimas, E1 a E4:
E1 activa Ubiquitina utilizando ATP. Toma una ubiquitina y se
autoubiquitina.
E2 tambin es llamada conjugadora, la ubiquitina de E 1 es
transferida a E2
Y esta a travs de E3 la pasa a la protena y por lo tanto la
deja ubiquitinada. E3 reconoce que la protena falla y marca
la protena con (ayuda de E1 y E2) para su degradacin.
Si la ubiquitina se pone en un enlace de lisina y se forma una
poliubiquitina va a degradacin. Pero si es en un enlace que no
tiene que ver con lisina, tendr que ver con relocalizacin,
inactivacin de protenas, etc.

El proteosoma reconoce la protena poliubiquitinada y utilizando

ATP la degrada. La ubiquitina se libera y es reciclada. Por ende,
este proceso es costoso, ya que requiere energa metablica. Si
falla la degradacin, la protena polibuiquitinada denaturada se
empieza a agregar. Esto genera muchas enfermedades como
parkinson, alzheimer y Creutzfeldt- Jakob, las que se asocian a
mutaciones de este sistema.
-

Sistema lisosomal: Endosomas facogticos asociados a lisosomas.

Cuando la protena est al interior de la clula. La clula forma
una doble membrana (que viene del retculo endoplsmico) y
comienza a englobar las protenas agregadas. Estas protenas
englobadas en una vescula de doble membrana son fusionadas
con un lisosoma y son degradadas.
Es un fenmeno muy comn que ocurre en todos los organismos
en condiciones normales (por ejemplo autodigestin por falta de
energa).

Las enfermedades asociadas a agreosomas tienen 3 vertientes:

- Alteracin de la estructura de protenas que hace que se
favorezca la agregacin (Ej. Creutzfeldt- Jakob, la protena mala
plegada cataliza el mal plegamiento de otras protenas)
- Falla la degradacin de la protenas
- Falla la autofagia
3. Cambio en la estabilidad de la protena

Polimorfi smos
Son sustituciones con una frecuencia mayor al 1% de la poblacin. Tienen
consecuencias funcionales, pero el cambio es sutil, no es dramtico en la
estructura o funcin de las protenas.
A partir de los polimorfismos se define la farmacogenmica. No todas las
personas tienen la misma susceptibilidad a las enfermedades. Esto es algo que
estudia la farmacogenmica. Al igual que la diferencia en las dosis requeridas
de cierto medicamento para diferentes personas. Esta respuesta depende de:
-

Edad
Sexo
Enfermedades preexistentes
Interaccin con otros frmacos
Gentica: Determina dos aspectos, la eficacia con que funciona el
medicamento y la probabilidad de desarrollar una reaccin adversa al
medicamento. Tiene que ver con ADME y con aspectos
farmacodinmicos.

Farmacocinticos (ADME): Por ejemplo: En una mutacin

cualquiera habr un tipo silvestre, uno heterocigoto y uno
homocigoto de la variante. Las graficas indican concentracin v/s
tiempo. Al inicio vemos la ingesta del medicamento. Luego
absorcin y degradacin. El tipo silvestre tiene un rea bajo al
curva de 100 y el homocigoto tiene un rea bajo la curva mayor,
lo que puede deberse a un cambio en un aminocido que codifica
para una enzima de la va de degradacin haciendo mas lento el
proceso y por ende el rea bajo la curva mayor. El heterocigoto es
intermedio.

Todas las enzimas de metabolizacin, especialmente las del citocromo

P450 tienen polimorfismos que cambian su actividad enzimtica.
Entonces se divide a la poblacin en metabolizadores rpidos, lentos e
intermedios. Esto se determina genticamente. Un ejemplo: Con la
nortriptilina, el rea bajo la curva es totalmente diferente segn el
nmero de genes que posean para el CYP2D6. As, vemos
metabolizadores muy rpidos y otros muy lentos. Obviamente la dosis
farmacolgica ser totalmente diferente para cada uno.

Efecto farmacodinmico: tiene que ver con la eficiencia

farmacutica y toxicidad. Supongamos una persona normal (1) o
aquella con una variante gentica que hace que la eficiencia ante
el medicamento sea muy baja (3), por ejemplo un polimorfismo en
el receptor que hace que tenga menos afinidad por el frmaco,
una transduccin de seales alterada que tenga menos eficiencia.

Y (2) es el heterocigoto. As, a (1) se le da cierta dosis y alcanza

rpidamente la respuesta al 100% sin toxicidad, en cambio en (3)
nunca logra el efecto mximo y voy a ver efectos adversos. Y en
(2) tenemos un paciente intermedio.

Los polimorfismos recin vistos poseen una nica mutacin en el

metabolismo que cambia completamente el rea bajo la curva, de
pequea a grande.
Hay otro polimorfismo en el receptor que cambia completamente
la eficiencia de respuesta del receptor -adrenrgico. Cuando se
habla de una poblacin e individuos se habla de muchos
polimorfismos. Habitualmente este ocurre en varios sitios, no en
uno. Por ejemplo aqu (mirar diapo 35) hay dos polimorfismos en
el receptor, uno en la posicin 16 (Gln o GLu) y otro en 27 (Arg o
Gly).
A. Determinacin de polimorfismos
Se hace una amplificacin por PCR y con una digestin con enzima de
restriccin se reconoce una mutacin especfica.

Todas las enfermedades tienen un componente gentico, no slo las

hereditarias. Este puede ser muy importante (enfermedades genticas) o
minoritario (enfermedades bacterianas o virales). Este componente gentico
est en el cromosoma.

Cmo se sabe que es una enfermedad gentica y que mutacin

la provoca?
Esto se hace estudiando el pedigree, el cual estudia la ascendencia.
Casados

Una vez que se tiene el pedigree, se desea conocer cul es la mutacin que
produce la enfermedad y el mtodo ms sencillo es por clonamiento y

secuenciamiento. Entonces se toma el cromosoma se clona todo el DNA en

diferentes clones y luego secuenciar cada uno y ordenarlo de tal manera de
obtener la secuencia. Y se compara entre individuos sanos y enfermos. Lo que
se hace es tomar todo el DNA humano y digerir con enzimas de restriccin; se
liga con plasmidios recombinantes que se reconocen por su resistencia a
antibiticos, se meten en las bacterias y se seleccionan con el antibitico al
que son resistentes. Y cada bacteria dar origen a un clon con un trozo de DNA
distinto. Por lo tanto secuenciando el trozo de DNA pequeo en cada bacteria
se obtiene todo un genoma.
La secuenciacin se basa en una hebra de DNA sola. Se fabrica un pequeo
partidor para la sntesis del DNA. Este partidor lleva DNA polimerasa, los 4
nucletidos y un quinto nucletido dideoxi. El normal es deoxi y cuando es
dideoxi el OH en posicin 3es reemplazado por H. Al haber sntesis de DNA la
cadena se termina cuando se encuentra con el H (Si hay OH, se extiende).
Entonces por ejemplo en la mezcla habr una pequea cantidad de dideoxi ATP.
As, a veces algunas adeninas continuaran y otras terminaran. El producto final
al agregar dideoxi adenina genera trozos de DNA sintetizados de distintos
tamaos y cada vez que termina habr una dideoxi adenina. Entonces se hace
un tubo con dideoxi ATP, GTP, DTP, CTP y a los cuatros tubos se hacen
electroforesis y se corre por tamao y aparecer una banda cada vez que se
ingres un dideoxi A o C o G o T (segn tamao).

Deteccin de una mutacin de manera rutinaria

Se toma DNA, se amplifica por PCR con un juego de partidores y luego la
mutacin se puede determinar por uno de estos procedimientos:
-

Alteracin del tamao amplificado: Delecin o insercin.

Ejemplo, la madre es portadora, tiene dos hijas enfermas. La
enfermedad se manifiesta en el heterocigoto. Lo normal es que haya una
cistena (azul) y en el enfermo hay azul y rojo sobrepuesto porque son
dos alelos no separados (heterocigotos)

Generacin o desaparicin de un sitio de restriccin: (Seminario). Se

corta con enzimas y luego en una gel se ve una u otra banda.

Cambio en la temperatura de denaturacin: Esto es porque en las bases

de DNA, el par A-T tiene 2 puentes de hidrgeno y G-C. Entonces al
cambiar un nico nucletido y como forma una estructura 3D el DNA, se
va a cambiar un par para que al aplicar calor la temperatura de
denaturacin de la molcula cambie.
Se hace con un gel de electroforesis con gradiente de temperatura a
medida que avanza, aumenta al avanzar. As, a medida que avanza la
molcula se va denaturando en algn momento. Al usar esta tcnica no
se sabe la base modificada, pero basta con que el DNA tenga un cambio
y la movilidad cambia. As, sirve para buscar nuevas mutaciones sin
tener que secuenciar. Se identifica el cambio por la banda y as solo
secuencia ese pedazo.
Cambio en la secuencia
Arreglo de DNA (Microarray).

Terapia gnica
Consiste en curar enfermedades mediante manipulacin gentica. Hay
diferentes vectores usados para esto:
-

Retrovirus: Hay dos tipos, uno derivado de mieloma de ratn y el HIV.

Tienen como material gentico RNA de una hebra y por transcriptasa
reversa se fabrica cDNA. El problema es que la integracin de su DNA es
al azar en el cromosoma, existe una cierta posibilidad de que por azar
ocurra cerca de un oncogen y produzca cncer. La diferencia del de
ratn con el de HIV, es que el de ratn slo afecta clulas inactivas de
replicacin por ejemplo mdula sea. Mientras que los derivados de HIV
infecta todo tipo de clulas.
Adenovirus: Es un virus DNA de doble hebra lineal, es el que produce el
resfro. Todas las clulas del organismo se infectan con adenovirus, no
hay excepcin. La otra gracia es que su DNA no se integra al genoma
por lo que no se hereda. Lo malo es que si una clula est infectada y se
divide el DNA se diluye y se va perdiendo el efecto en el tiempo. Otra
gracia es que no produce enfermedades graves (tos, problemas GI, y en
vas areas). Otra grave dificultad es que es susceptible a la inmunidad,
todos tenemos anticuerpos para el adenovirus
Virus asociado a adenovirus: Siempre est asociado, nunca slo. No se
conoce ninguna enfermedad asociada a adenovirus, esa es la gracia. Es
inocuo. La otra gracia es que el DNA de hebra simple se integra en el
brazo corto del cromosoma 19, en una posicin muy especfica que se
sabe no produce enfermedad. La terapia se hace una sola vez porque
queda para siempre ah. Lo otro que se sabe es que este virus no
atraviesa la BHE ni la barrera spermatogonodal. El resto de las clulas si
se modifican. El problema que tiene es que es muy pequeo entonces el

trozo de DNA que se puede meter es chico, restringido. Esto se soluciona

con el adeno o retrovirus.
Liposomas: Por fusin de membranas ingresa el contenido a la clula.
Funciona muy bien con mayor eficiencia que DNA desnudo. Pero el
liposoma le da inestabilidad a la molcula y algunos liposomas son
txicos.
DNA desnudo: Es el ms sencillo. Uno toma cualquier clula y le pone
DNA en un medio de cultivo, una pequea porcin de estas clulas capta
espontneamente ese DNA. Se puede inyectar por la vena porta junto
con masaje heptico (para producir pequeas rupturas capilares que
hacen al DNA ms susceptible de entrar a las clulas) y tambin es
integrado en sus clulas (poco).
Se han hecho DNA que se aspersa y se inhala como una solucin de DNA
lquido, este se integra en las clulas epiteliales y empieza lentamente a
producir la protena que es reconocida por el sistema inmune y gatilla
una respuesta. Se est ensayando como vacuna. El problema es cuando
se quiere expresar una protena no sirve por su ineficiencia a la hora de
transferirlo a las clulas (menos del 1%)