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LaboratoiredeMicrobiologieetBiologie

Molculaire
UniversitMohamedV AgdalFacultdesSciencesB.P.1014
Rabat MAROC

Filire SVI - S6
Module de Gntique et Biologie Molculaire M21
Elment 2: Biologie Molculaire - Pr.
Pr Abdelkarim FILALI
FILALI-MALTOUF
MALTOUF

Expos ralis par:


Taraji loubna
Nakach Imane
Raoui sanae

Lesplasmidesvecteursdeclonage
PRSENTPAR:TARAJILOUBNA
NAKACHIMANE
RAOUISANAE

SOMMAIRE
9 Dfinitionduclonage

9 Clonagedungne

9 DfinitionduGnie

dansunplasmide
9 Usagedesplasmides
recombinants
9 Rfrences
bibli
bibliographiques
hi

gntique
9 Dfinitionduplasmide
Dfi iti d l
id
9 Caractristiquesdes

p
plasmidesduclonage
g
9 Enzymesderestriction
9 ADNligase

Leclonage
Termeissudugreckln:rejeton.Leterme
g
j
clonageestl'oprationquipartirde
g
p
q
p
cellulesisoles,permetd'obteniruneligne
,p
g
(p
(plusieurscellulessimilairesappeles
pp
clones)drivantd'unseulanctre.
)

Clonage(suite)
Lorsquelesscientifiquesparlentdeclonage
gntique,ilsnepensentpaslareproduction
d'unorganismemaispluttcelled'ungne
spcifique.Leclonagegntiqueestunlment
dugniegntique

Legniegntique
Legniegntique(ouingnieriegntique)
g
g
g
g
estunensembledetechniques,faisantpartie
q
p
delabiologiemolculaire
g
etayantpourobjet
y
p
j
lutilisationdesconnaissancesacquisesen
q
g
gntique.
q

Legniegntique(suite)
Ilpermet:

d'id tifi
d'identifier

d'isoler

detransfrer

d difi d
demodifierdemanirecontrle
i
t l

lematrielgntique.
g
q

Leplasmide
Unplasmidedsigneenmicrobiologieouen
bi l i
biologiemolculaireunemolculed'ADN
l l i
l l d
distinctedel'ADNchromosomique capablede
distinctedel'ADNchromosomique,capablede
rplicationautonome Letermeplasmide fut
rplicationautonome.Letermeplasmide
introduitparlebiologistemolculaire
p
g
amricainJoshua Lederbergen1952.

Leplasmide(suite)
Unecellulebactriennepeutencontenir:
pourlesgrandsplasmides=> unecopie
pourlesplasmidesartificiels(construits
pargniegntiquedesfinsdeclonage
degnes)
=>descentaines
>descentaines

Pourquoilesplasmidescomme
vecteursdeclonage?
Ontunepetitetaille
contrle de rplication relch
se

m ltiplient dansles cellules


multiplient
cell les jusqu'
j sq ' ce que
q e chaque
chaq e

cellule ait en moyenne


y
10 200 copiesdu
p
plasmide.
p
portentaumoinsungnecodantpourunmarqueurde
slection
contiennentplusieurssitesderestriction

Introductionauxenzymesde
restriction
La biotechnologie moderne, fonde sur la manipulation de lADN,
permet de modifier et/ou danalyser des gnes de manire spcifique.
Elle permet aussi de les transfrer entre des organismes aussi
distincts que des bactries, des plantes et des animaux. Elle se base
sur le gnie gntique, qui regroupe les techniques permettant de
manipuler lADN in vitro. On peut ainsi fabriquer de lADN
recombinant, une molcule de l'ADN contenant des squences
q
nuclotidiques provenant dau moins deux sources diffrentes

Le principe du clonage:
Le principe du clonage est simple. Il consiste
i
insrer
un segmentt d'ADN tranger
t
d
dans
une
petite molcule capable de se rpliquer de faon
autonome. Ce
C type de
d molcule
l l d'ADN est
appel un vecteur de clonage. Un vecteur de
clonage courant est le plasmide bactrien. L'ADN
du plasmide est coup par une enzyme de
restriction et li in vitro au fragment d'ADN
tranger
g
coup
p p
par la mme enzyme
y
de
restriction ou une enzyme qui donne des
extrmits compatibles. Lorsqu
Lorsqu'un
un transformant
stable a t obtenu, la squence est dite clone.

(Suite)
Parmi les caractristiques connus pour tre de
bons vecteurs de clonage c'est que:
ils doivent porter des marqueurs gntiques
particuliers,
ti li
comme des
d gnes

d rsistance
de
i t
aux antibiotiques ou le gne codant la

galactosidase.

ils doivent porter un ou plusieurs sites de


restriction uniques dans une rgion qui n'est pas
essentielle pour la rplication des plasmides.
et si possible,
possible ils doivent avoir des sites de
restriction uniques dans des gnes codant des
marqueurs

slectifs.

Ces

marqueurs

sont

inactivs lorsqu
lorsqu'on
on y insre un fragment d
d'ADN
ADN
tranger. Le choix de ce site est dict par les
connaissances

antrieures

concernant

g p du g
gnome bactrien .
cartographie

la

Lesenzymesderestriction:
Les enzymes de restriction sont des
enzymes qui reconnaissent des squences
de 4 8 paires de base appeles sites de
restriction ,
et y scindent les deux brins
d'ADN, comme ils incisent dans le corps de la
molcule,
l l on les
l appelle
ll endonuclases
d
l
d
de
restriction . Ils sont produites par les
b i pour se protger
bactries

d lADN tranger
de

provenant dautres organismes (ex phages).

Les sites de restriction sont de courtes squences


reptes , cc'est
est dire identiques sur chaque brin lu
de 5' en 3'. Etant donn que l'ADN de chaque
organisme possde une squence propre, les
enzymes de Restriction , le trononnent en un jeu
unique et reproductible de fragments de restriction.

(suite)
L'ADN propre de la bactrie est protge contre l'incision
par un autre enzyme l'enzyme modificateur , qui le
modifie en sites prsomptifs de clivage
cli age ou
o en son voisinage,
oisinage
par mthylation d'une ou de deux bases gnralement
infrieur aux sites de restriction . Ce site une fois mthyl,
l'endonuclase n'est plus capable d'y faire la coupure

Beaucoup d'enzymes de restriction produisent des fragments


d'ADN bouts collants le mcanisme est le suivant : Certains
enzymes coupent lADN au niveau de la mme base sur les deux
brins, on obtient alors de fragments bout franc c'est dire
dont les nuclotides terminaux sont apparis leur symtrie
comme par exemple ECoR V ou NrUI . Plus souvent, ces enzymes
coupent les deux brins de faon dcale, on obtient alors des
fragments avec une extrmit cohsive.
cohsive Si on ajoute un autre
fragment avec les mmes extrmits cohsives, les bases vont
sapparier. On peut refaire des liaisons covalentes en utilisant une
ADN ligase.

D'autres coupent
p
l'ADN au niveau des bases en
produisant des fragments bouts collants
comme par exemple Pst I . Les bouts forms
par un enzyme de restriction en un site donn
sont complmentaires de ceux de tous les
fragments obtenus avec le mme enzyme de
restriction . A temprature ambiante,
ambiante ces
rgions monocatnaires, qualifies de bouts
collants
ll t s'apparient
'
i t momentanment
t
t celles
ll
des autres fragments d'ADN produits par le
mme

enzyme de
d restriction quelle
ll que soit la
l
source d'ADN.

(suite)
A restriction,
Aprs
i i
l mlange
le
l
d fragments
des
f
dADN
estt soumis
i une lectrophorse
l t h
sur gel,
l quii
spare les diffrents fragments en fonction de
leur taille.
taille Aprs ajout d
dun
un colorant qui ssintercale
intercale
dans la double hlice de llADN
ADN, on peut visualiser
les diffrents fragments
g
sous UV.

On connat environ 40 enzymes de restriction qui


reconnaissent chacune une squence diffrente, appele
site de restriction.
restriction Voici parmi eux les plus utiliss:
utiliss
Alu
Alu I , Taq I , Hpb I ,Hga
Hga I ,EcoR
EcoR I ,Hind
Hind III , Not I , sfi I .
La technique suivante montre le dcoupage d
d'un
un plasmide
par un enzyme de restriction et le recollement .

L ADNligase:
L'ADNligase:
C'est un enzyme qui rtablit une liaison
covalente entre les fragments de restriction :
Quand l'ADN se rplique in vivo, l'ADN ligase
catalyse la formation phosphodiesters 33'55'
entre les courts segments du brin d'ADN
synthtis
thti de
d faon
f
di
discontinue
ti
au niveau
i
d
de
fourche de rplication. On tire profit de cette
li
ligase
purifie,
ifi
pour recombiner
bi
d
des
fragments de restriction in vitro

A momentt o
Au
les
l bouts
b t sontt apparis
i ,cett enzyme
catalyse
y la formation de liaisons p
phosphodiesters
p
33'5'
5
entre l'extrmit 3'OH du brin d'un fragment et le
phosphate 5'terminal du brin d'un autre fragment de
restriction .Il suffit d
d'ajouter
ajouter ADN ligase et de ll'ATP
ATP la
solution de fragments de restriction bouts collants
pour que ceuxci s'unissent de faon covalente par des
liaisons

phosphodiester

nucliques

33'55'

propre

aux

acides

Certains enzymes
y
de restriction incisent 2brins d'ADN
au milieu du site de reconnaissance ( Alu I ) en formant
des fragments bouts francs ,dans ce cas l'ADN ligase
purifie est utilise pour lier covalemment les
extrmits d'un fragments
g
de restriction celles d'un
ADN vectoriel et le fragment qui leurs sont
complmentaires. L'ADN vectoriel et le fragment de
restriction sont lis covalemment grce aux liaisons
phosphodiester
p
p
33'5'
5 standards d'ADN.

Clonage dun gne dans un


plasmide

Etapesrsumantleclonage
p
parlesplasmides:
p
IsolementdelADNpartirdesplasmidesdes

bactriesetdelADNdecelluleshumaines.
Actiondelenzymederestriction
Actiondelaligase
ct o de a gase
Rintroductiondesplasmidesdansles
bactries
Identificationdesplasmidesrecombins

Usageduclonagevia
plasmidebactrien

Productiondesvaccins
Dterminantantignique

introductiondugnecorrespondantdans
lescellulesprocaryotesoueucaryotes
protinesvaccinantes
Exemple: protinevaccinantecontrela
rageetlhpatiteB.
legnerecombinprovientdelagent
g
p
g
pathogneetcodelantigneresponsable
del immunisationprotectrice
delimmunisationprotectrice

Productiond hormones
Productiondhormones
lasynthsechimiquedelinsulinehumainetanttropchreet

classiquementextraitedepancrasdebovinsetporcins.
Apartirde1983,delinsulinehumaineproduiteparculture
Apartirde1983,del insulinehumaineproduiteparculture

dEscherichiacoliacommenctrevendueenpharmacie
Dautreshormonesonttgalementproduitpargnie
D
h
l
d i i

gntiquetelque :lhormonedecroissance,GRF(Growth
hormonReleasingFactor)desexpriencesouvrentdes
perspectivesintressantespourlaugmentationdeproduction
laitirebovineenutilisantcefacteur

Rfrencesbibliographiques
http://www.bangaloregenei.com/pdf

08/Genomic08/C136.pdf
3 p
http://www.univlille1.fr/pdv/labo/figdea.pdf
BONNESG.,DARREA.,FUGITG.,GADOUDR.,

JUSSIAUR.,MANGEOLB.,NADREAUN.,
PAPETA.,VALOGNESR.Amliorationgntique
desanimauxdlevage.Foucher.Paris
g
:
Enseignementagricoleformation
professionnelle,1991,287.(INRAP)

http://www.intellego.fr/soutienscolaire

TerminaleS/aidescolaireSVT/Leclonage
d
danslesplasmides/24149
l
l
d
http://209.85.129.132/search?q=cache:NCRun
FxeHPMJ:www.interpharma.ch/chapter02_f_
dl.doc+clonage+et+g%C3%A9nie+genetique
&cd=4&hl=fr&ct=clnk&gl=fr
f
f
http://www.freepatentsonline.com/EP063162

6.html
http://fr.wikipedia.org/wiki/Transg%C3%A9n
%C3%A8se