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So Paulo
2004
ii
So Paulo
2004
iii
Dissertao
apresentada
ao
Instituto de Biocincias da
Universidade de So Paulo, para a
obteno de Ttulo de Mestre em
Cincias,
na
rea
de
Biologia/Gentica.
Orientador: Prof. Dr Willy Beak.
So Paulo
2004
iv
Golono, Miguel
Variantes moleculares do vrus
influenza
129 pginas
Dissertao (Mestrado) - Instituto de
Biocincias da Universidade de So Paulo.
Departamento de Biologia/Gentica.
1. Influenza 2. Hemaglutinina 3.
Drift
I. Universidade de So Paulo. Instituto de
Biocincias. Departamento de
Biologia/Gentica.
Comisso Julgadora:
________________________
_______________________
Prof(a). Dr(a).
Prof(a). Dr(a).
________________________
_______________________
Prof(a). Dr(a).
Prof(a). Dr(a).
______________________
Prof. Dr. Willy beak
Orientador
vi
vii
Agradecimentos
Agradeo meu orientador Prof. Dr. Willy Beak pela confiana em mim
depositada e por seu esforo dedicado a esta dissertao.
Ao Prof. Dr. Edison Luiz Durigon do Laboratrio de Virologia do ICB USP, por abrir as portas de seu laboratrio assim como propiciado os meios
para a concluso desta dissertao.
Ao Mrio Gustavo Mayer por toda ajuda na metodologia e no
delineamento a este projeto.
A Dra. Maria Luiza Beak, pelo incentivo e ajuda para o trmino deste
trabalho de mestrado.
A Danielle Bruna Leal de Oliveira, por ter dedicado seu tempo para
meu treinamento em seqenciamento e para as anlises de seqncias.
Ao Dr. Marcelo Genofre Vallada, pela seleo dos pacintes e coleta
das amostras no Instituto da Criana da FMUSP.
Ao Alexandre Pereira pelo acompanhamento deste trabalho.
A Dra Viviane Botosso por todas as sugestes dadas para a concluso
deste trabalho.
A Dra Rita de Cassia Stocco dos Santos por todo apoio e ajuda
dispensada a mim.
A Leonardo Setsuo Kobashi pela ajuda na finalizao do trabalho.
Aos amigos do Laboratrio de Virologia, em especial para Jansen de
Arajo pelo apoio nos experimentos de concluso desta Dissertao.
A Nair Aparecida da Silva Pereira, pelo apoio prestado durante a
execuo deste trabalho e pelo incentivo dado em todos os momentos.
viii
ix
ndice
I - Introduo...................................................................................................01
II - Objetivos....................................................................................................18
III - Materiais e Mtodos
1.Amostras.............................................................................................19
2.Extrao de RNA................................................................................19
3. Obteno de cDNAs por transcrio reversa.....................................20
4. Reao em Cadeia pela Polimerase -Nested Multiplex PCR.........21
4.1. Oligonucleotdeos Iniciadores (primers)..............................21
4.2. Reaes.................................................................................23
4.3. Anlise dos Produtos Amplificados......................................25
5. Reaes de Semi-Nested PCR e Nested-PCR".............................25
5.1. Oligonucleotdeos iniciadores..............................................25
5.2. Reaes.................................................................................30
5.3. Anlise dos Produtos Amplificados......................................32
6. Determinao da seqncia de nucleotdeos......................................32
6.1. Purificao dos Produtos de PCR.........................................33
6.2. Reao de determinao de Seqncias de nucleotdeos......33
7. Edio e Anlise das Seqncias Obtidas..........................................35
8. Localizao das diferenas na estrutura da hemaglutinina................35
9. rvore genealgica............................................................................36
IV - Resultados.................................................................................................37
1. Deteco, tipagem e subtipagem das amostras clnicas.....................37
2. Obteno da regio codificadora completa de HA1..........................40
3. Nested e Semi-nested PCR................................................................40
4. Seqncias de aminocidos de HA1 das amostras estudadas:
anlise comparativa das amostras entre si e com as cepas vacinais...42
4.1. Tipo A Subtipo H1N1...........................................................42
4.2. Tipo A Subtipo H3N2...........................................................49
4.3. Tipo B...................................................................................59
4.4. Pesquisa das seqncias de nucleotdeos no "Genbank"......63
4.5. Pesquisa no "Genbank" das seqncias de A H1N1.............64
4.6. Pesquisa no "Genbank" das seqncias de A H3N2.............65
4.7. Pesquisa no "Genbank" das seqncias de vrus do tipo B..66
4.8. rvore Genealgica..............................................................66
V - Discusso...................................................................................................70
VI - Concluso.................................................................................................81
VII - Resumo....................................................................................................82
VIII - Abstract..................................................................................................83
IX - Apndice 1. Dados gerais dos pacientes..................................................84
X - Apndice 2. Distribuio das amostras.....................................................93
XI - Referncias Bibliogrficas........................................................................97
XII - Biografia................................................................................................119
I - Introduo
A gripe uma doena respiratria aguda em seres humanos e
causada pelo vrus da influenza. Anualmente mais de 10% da populao
mundial, cerca de 600 milhes de pessoas so acometidas pelo vrus da
gripe (Gerdil, 2003). Somente nos Estados Unidos, a doena causa cerca
de 110.000 hospitalizaes com 36.000 mortes todos os anos (Thompson
e col., 2003). Idosos com idade igual ou superior a 65 anos constituem o
grupo de maior risco de morte por influenza. Cerca de 90% das mortes
causadas pela gripe ocorre nessa faixa etria (Simonsen, 1999). A doena
afeta tambm a classe economicamente ativa, o que causa queda de
produtividade e, conseqentemente prejuzos financeiros (Akazawa e
col., 2003).
A sintomatologia clssica da doena engloba febre, dores
musculares, tosse, dor de cabea, irritao na garganta e secrees nasais.
Os vrus se multiplicam no epitlio ciliado das vias respiratrias
superiores e inferiores, causando necrose celular e irritao. Os sintomas
podem variar de pessoa para pessoa, dependendo da idade do doente, de
seu estado geral de sade e, do status imunolgico no que se refere a
infeces anteriores, podendo evoluir para complicaes como
pneumonia causada pela propagao viral no epitlio alveolar e/ou
pneumonia bacteriana (WHO Fact Sheet 211, 1999).
A famlia Ortomixoviridae composta de 4 gneros: Influenza
virus A, Influenza virus B, Influenza virus C e Thogotovirus (Pringle,
1996). Os vrus influenza tipo A e B causam um largo espectro de
doenas, incluindo doena respiratria do trato inferior, pneumonia e,
podendo no caso dos vrus influenza tipo A, causar encefalopatia e
encefalite. Por outro lado, infeces associadas ao vrus tipo C so
limitadas ao trato respiratrio superior (Murphy e Webster, 1990,
Segmento
*b
RNA viral
*b
RNAm
Polipeptdios Codificados
Tipo A
Tipo B
Tipo C
2341
2320
PB2
PB1
*c
P1
2341
2320
PB1
PB2
*c
P2
2233
2210
PA
PA
*c
P3
1778
1756
HA
HA
*d
HE
1565
1539
NP
NP
NP
1413
1391
NA
NA, NB
M1, CM2
1027
M1, BM2
NS1, NS2*e
890
NS1, NS2*e
*f
NS1, NS2*e
antiterminao no stio de
molculas de
10
11
12
13
14
15
16
da
vacina
para
ano
seguinte
(WHO
Weekly
17
18
II Objetivos
1) Determinar a ocorrncia dos vrus influenza tipo A, subtipos H1N1 e
H3N2, e tipo B em amostras clnicas coletadas durante os anos de
2000 e 2001, atravs da tcnica de Nested Multiplex RT-PCR,
utilizando a regio varivel da hemaglutinina viral (HA1) como base
de investigao.
2) Obteno da seqncia codificadora da regio varivel completa da
hemaglutinina dos isolados de influenza, atravs da tcnica de Nested
Multiplex RT-PCR ou Semi-nested Multiplex RT-PCR.
3) Analisar comparativamente as seqncias de aminocidos obtidas da
regio HA1 da hemaglutinina do vrus influenza tipo A, H1N1 e
H3N2, e tipo B nos anos de 2000 e 2001.
4) Localizao das diferenas detectadas na estrutura da molcula de
hemaglutinina e, verificao da incluso ou no desses pontos em
stios antignicos de alta variabilidade.
5) Analisar comparativamente as seqncias de aminocidos obtidas com
as das cepas vacinais utilizadas no hemisfrio sul por proposta da
OMS para os anos 2000 e 2001.
6) Analisar comparativamente as seqncias de nucleotdeos entre os
variantes isolados, assim como, compar-las a seqncias de
nucleotdeos presentes em bancos de dados. Elaborao de uma rvore
genealgica.
19
20g
glicognio
livre
de
RNases
(Invitrogen
Life
20
Tris-HCl,
21
22
extremidade Tamanho do
5' do
Produto (pb)
Seqncia (5
3)
iniciador**
Primeira Amplificao
AH1 A
76
AH1 FII
1090
AH3 A
174
AH3 DII
1056
BHA A
154
BHA DII
1053
cagatgcagacacaatatgt
1.015
aaaccggcaatggctccaaa
cagattgaagtgactaatgc
883
gtttctctggtacattccgc
gtgactggtgtgataccact
900
tgttttcacccatattgggc
Segunda Amplificao
AH1 B
96
AH1 EII
1039
AH3 B
348
AH3 CII
938
BHA B
196
BHA CII
962
ataggctaccatgcgaacaa
944
cttagtcctgtaaccatcct
agcaaagctttcagcaactg
591
gcttccatttggagtgatgc
cattttgcaaatctcaaagg
767
tggaggcaatctgcttcacc
23
4.2. Reaes.
A primeira "PCR" foi realizada num volume total de 50 L,
utilizando-se de 2 L de cDNA ou do controle negativo de transcrio
reversa e nas seguintes condies: 20 mM Tris-Cl pH 8,4, 50mM KCl,
1,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,1M de iniciador externo
(AH1 A, AH1 FII, AH3 A, AH3 DII, BHA A e BHA DII), 2,5 U de Taq
DNA polimerase (Invitrogen Life Technologies). As condies de
ciclagem utilizadas nessa primeira amplificao encontram-se na tabela 3.
A segunda "PCR" foi realizada partindo-se de 2 L do produto da
primeira amplificao e nas mesmas condies da primeira "PCR",
excetuando-se a concentrao dos iniciadores, a qual foi alterada para 0,5
M de cada um dos iniciadores internos (AH1 B, AH1EII, AH3 B, AH3
CII, BHA B e BHA CII). As condies de ciclagem utilizadas nessa
segunda amplificao encontram-se na tabela 4. Todas as amplificaes
foram realizadas em termociclador "Perkin Elmer Cetus DNA Thermal
Cycler", utilizando-se leo mineral (Sigma) para se impedir evaporao
dos contedos.
24
Tempo em
Nmero de
em oC
Minutos
Ciclos
95
Desnaturao
94
Associao
50
Extenso
72
Manuteno
Etapas
Desnaturao
inicial
35
1
Tempo em
Nmero de
em oC
Minutos
Ciclos
95
Desnaturao
94
Associao
60
Extenso
72
Manuteno
Etapas
Desnaturao
inicial
35
1
25
26
27
extremidade 5
do iniciador
Tamanho do Produto
(pb)
Seqncia (5
3)
12
H3R
1198
H1F
06
H1R
BF
1210
36
1205
gtaatcccgttaatggca
gaaggcaataattgtactac
BR
1140
1105
accagcaatagctccgaa
gggataattctattaacca
1187
atggctgcttgagtgctt
aagcaggggaaaataaaa
36
H3R2
1153
1118
catctatcattcctgtc
H1R2
1122
1117
catctatcattcctgtc
BR2
1075
1040
cattggcaagcttcaaag
actatcattgctttgagc
A letra R que compe o nome do iniciador indica que ele um iniciador reverso, enquanto letra F
indica que o iniciador senso.
28
Stio de Clivagem*
cDNA
HA1
HA2
Direo de Sntese
(6)
5
H1F
(76)
(96)
H1A
3 Regio no Peptdio
traduzida
Sinal
H1B
944 pb
HA1
HA2
H1EII
(1039)
H1FII H1R2
(1090) (1122)
Direo de Sntese
3
H1R 5
(1210)
29
Stio de Clivagem*
cDNA
HA1
Direo de Sntese
(12)
5
H3F2
(36)
(174)
H3F
591 pb
(348)
H3B
H3A
3 Regio no Peptdio
traduzida
Sinal
HA2
HA2
HA1
H3CII
(938)
H3DII
(1056)
H3R
(1153)
Direo de Sntese
Produto de PCR Nested 1
H3R 5
(1198)
30
Stio de Clivagem*
cDNA
HA1
Direo de Sntese
(36)
5
PCR Multiplex 2
(154)
BF
767 pb
(196)
BHA
BHA
3 Regio no Peptdio
traduzida
Sinal
HA2
HA1
HA2
BHACII
(962)
BHADI BR2
(1053 (1075
Direo de
5.2. Reaes.
A primeira "PCR" foi realizada num volume total de 50 L,
utilizando-se de 2 L de cDNA positivo ou de controle negativo nos
experimentos de Nested Multiplex PCR e nas seguintes condies: 20
mM Tris-Cl pH 8,4, 50mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP,
0,2M de iniciador externo (H1F, H1R, H3F2, H3R, BF e BR), 2,5 U de
Taq DNA polimerase (Invitrogen Life Technologies). As condies de
ciclagem utilizadas nessa primeira amplificao encontram-se na tabela 6
para os vrus da influenza tipo A e tabela 7 para os vrus tipo B. A
segunda "PCR" foi realizada partindo-se de 1 L do produto da primeira
amplificao e nas mesmas condies da primeira "PCR", excetuando-se
BR
(1140
3
5
31
Tempo em
Nmero de
em oC
Minutos
Ciclos
95
Desnaturao
94
Associao
53
Extenso
72
1.5
Manuteno
Etapas
Desnaturao
inicial
40
1
32
Tempo em
Nmero de
em oC
Minutos
Ciclos
95
Desnaturao
94
Associao
55
Extenso
72
1.5
Manuteno
Etapas
Desnaturao
inicial
40
1
33
34
Etapas
Desnaturao
Temperatura
em oC
Tempo
95
2 minutos
Desnaturao
94
45 segundos
Associao
50
10 segundos
Extenso
72
4 minutos
Manuteno
inicial
Nmero de
Ciclos
25
1
35
36
9. rvore genealgica.
Para a construo da rvore genealgica foi utilizado o programa de
computador Meg Align 4.05 Expert Analysis Software (DNASTAR,
Inc). As seqncias de nucleotdeos utilizadas na rvore foram todas
alinhadas com o programa "BioEdit Sequence Alignment Editor" (verso
5.0.9) e editadas para ficarem no tamanho de 555 resduos de
nucleotdeos, que corresponde menor seqncia de nucleotdeos obtida
nas amostras analisadas.
Alm das seqncias de nucleotdeos por ns determinadas,
tambm foram utilizadas seqncias obtidas em bancos de dados de genes
GenBank e Influenza Sequence Database (www.ncbi.nlm.nih.gov e,
www.flu.lanl.gov respectivamente). Essas ltimas foram escolhidas de
acordo com trs critrios. Primeiro, foram obtidas seqncias de
nucleotdeos que tiveram maior similaridade com as seqncias das
amostras que analisamos. Segundo, foram selecionadas seqncias de
nucleotdeos de vrus influenza isolados em diferentes anos e hospedeiros
distintos, assim como uma seqncia do tipo A subtipo H5N1 e duas
seqncias do tipo C para que o programa de computador DNASTAR
tivesse base de comparao tendo como material de anlise seqncias
relacionadas, no entanto, heterogneas. Terceiro, foram utilizadas na
obteno da rvore genealgica as seqncias de nucleotdeos das cepas
vacinais dos anos 2000 e 2001, propostas pela Organizao Mundial de
Sade. Todas as seqncias utilizadas na rvore genealgica foram da
regio HA1 da hemaglutinina viral, com exceo para seqncias de
nucleotdeos dos vrus tipo C onde foram utilizadas seqncias correlatas
da sua glicoprotena de superfcie, hemaglutinina esterase (HE).
37
IV Resultados
1. Deteco, tipagem e subtipagem das amostras clnicas.
A tcnica de Nested Multiplex PCR previamente estabelecida (Ellis e
col., 1997) foi utilizada na deteco, tipagem e subtipagem dos vrus influenza
nas amostras estudadas. Essa tcnica baseia-se na amplificao de fragmentos
de tamanho distintos atravs da utilizao de iniciadores especficos para os
tipos e subtipos virais A H1N1, A H3N2 e B. Aps a segunda amplificao,
eram esperados fragmentos de tamanhos 944 pares de base (pb), 591pb e 767
pb respectivamente para amostras portadoras dos tipos virais A H1N1, A
H3N2 e B (figura 4). Em todos experimentos de Nested Multiplex PCR um
controle negativo onde o volume de cDNA foi substitudo pelo mesmo
volume de gua, controle dos reagentes, sempre resultou na ausncia de
deteco de algum produto, indicando a ausncia de contaminao de
reagentes.
No ano de 2000 foram coletadas 91 amostras e, sendo 57 amostras
coletadas em 2001. Das 91 amostras coletadas no ano de 2000, 18 se
mostraram positivas para vrus da influenza. Duas dessas 18 amostras (006 e
015) mostraram a peculiaridade de serem positivas para dois subtipos virais, A
H1N1 e A H3N2. Assim, no ano de 2000 foi possvel a deteco de 20
produtos de Nested Multiplex PCR independentes (figura 4 B e tabela 9).
Portanto, do total de 20 registros positivos, o que corresponde a
aproximadamente 22% do nmero total de amostras, 12 (60% dos registros
positivos) pertencem ao tipo A subtipo H3N2, 2 (10% dos registros positivos)
pertencem ao subtipoH1N1 e, 6 (30% dos registros positivos) pertencem ao
tipo B (tabela 09).
38
600 pb
B
2
PM 1 2
1.200 pb
H1N1 (944 pb)
B (767 pb)
500 pb
H3N2 (591 pb)
100 pb
100 pb
39
Tipo A
Tipo B
Subtipo
Subtipo
H1N1
H3N2
2000
12
2001
14
Total
16
0
2
13
40
41
PM 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 PM
A
1.200 pb
500 pb
100 pb
PM 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 PM
01 02 03 04 05 06 07 08 PM
1.200 pb
1500 pb
500 pb
600 pb
100 pb
100 pb
Figura 5. Obteno das regies codifcadoras completas de HA1. por Semi-Nested PCR e
Nested PCR A: Produtos de Semi-Nested PCR para cDNAs A H1N1 analisados em gel de agarose
1,2% corado com brometo de etdio. Linhas de 01 a 15 correspondem s amostras 15, 99, 101, 103, 104,
109, 112, 113, 114, 121, 122, 123, 126, 133 e 140 respectivamente. Padro de peso molecular (PM)
100bp DNA ladder (New England Biolabs INC). B: Produtos de Nested PCR para cDNAs A H3N2
analisados em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etdio. Linhas de 01 a 11 correspondem s
amostras 03, 08, 09, 10, 12, 15, 18, 24, 49, controle negativo e 125 respectivamente. Marcador de peso
molecular (PM) 100bp DNA ladder (New England Biolabs INC). C: Produtos de Semi-Nested PCR
para cDNAs B analisados em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etdio. Linhas de 01 a 08
correspondem s amostras 17, 53, 55, 64, 74, 79, controle negativo e 110 respectivamente. Marcador de
peso molecular (PM) 100bp DNA ladder (Invitrogen Life Technologies).
42
43
Cepa
121H1
122H1
101H1
099H1
109H1
103H1
112H1
113H1
133H1
126H1
114H1
104H1
140H1
015H1
006H1
10
20
30
40
50
60
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGW
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
...........................................I................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
-------------.............................R.............I...
44
Cepa
121H1
122H1
101H1
099H1
109H1
103H1
112H1
113H1
133H1
126H1
114H1
104H1
140H1
015H1
006H1
70
80
90
100
110
120
ILGNPECELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKE
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
........S.F........A....S...................................
Cepa
121H1
122H1
101H1
099H1
109H1
103H1
112H1
113H1
133H1
126H1
114H1
104H1
140H1
015H1
006H1
130
140
150
160
170
180
SSWPNHTVT-GVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVH
N........-...................................A..............
N........-...................................A..............
.........-...................................A..............
.........-...................................A..............
.........-...................................A..............
.........-...................................A..............
.........-...................................A..............
.........-...................................A..............
.........-...................................A..............
.........-...................................A..............
.........-...................................A..............
.........-...................................A..............
.........-...................................A..............
.........-................................M.................
.........K..T...............................................
Cepa
121H1
122H1
101H1
099H1
109H1
103H1
112H1
113H1
133H1
126H1
114H1
104H1
140H1
015H1
006H1
190
200
210
220
230
240
HPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTI
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
..S.......I..............................G..................
45
Cepa
121H1
122H1
101H1
099H1
109H1
103H1
112H1
113H1
133H1
126H1
114H1
104H1
140H1
015H1
006H1
250
260
270
280
290
300
IFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTI
...........R................................................
...........R................................................
...........R................................................
...........R.............................................I..
...........R................................................
...........R................................................
...........R................................................
...........R................................................
...........R................................................
...........R................................................
...........R................................................
...........R................................................
...........R................................................
..........................................K.................
..............................S.............................
Cepa
121H1
122H1
101H1
099H1
109H1
103H1
112H1
113H1
133H1
126H1
114H1
104H1
140H1
015H1
006H1
310
320
GECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQS
.........T................
.........T................
.........T................
..........................
..........................
..........................
..........................
..........................
..........................
..........................
..........................
..........................
..........................
..........................
.........T----------------
46
Posio dos
Amostra
Resduos
006
Stio
Cepa Vacinal
Alterao
43
leucina
arginina
---
103
44
leucina
isoleucina
---
006
57
valina
isoleucina
Cb
006
69
leucina
serina
Cb
006
71
isoleucina
fenilalanina
Cb
006
80
valina
alanina
Cb
006
85
prolina
serina
---
121 e 122
121
serina
asparagina
Ca1
006
130*
Lacuna
lisina
Ca2
006
133
serina
treonina
Ca2
015
162
lisina
metionina
Sa
165
valina
alanina
Ca1
006
183
prolina
serina
---
006
191
leucina
isoleucina
Sb
006
222
cido asprtico
glicina
Antignico
---
47
Nmero da
Posio dos
Amostra
Resduos
Stio
Cepa Vacinal
Alterao
251
triptofano
arginina
---
006
271
prolina
serina
---
015
282
glutamina
lisina
---
99
297
valina
isoleucina
---
309**
alanina
treonina
---
Antignico
48
Legenda
A) Mutaes ocorridas nos stios
antignicos Ca2, Sa, Sb, Ca1 e Cb.
i) Ca2
Resduo 130
Resduo 133
ii) Sa
Resduo 162
iii) Sb
Resduo 191
iv) Ca1
Resduo 121
Resduo 165
iv) Cb
Resduo 57
Resduo 80
Resduo 69
Resduo 57
B) Mutaes ocorridas fora dos stios
antignicos descritos.
Resduo 43
Resduo 85
Resduo 222
Resduo 271
Resduo 297
Resduo 44
Resduo 183
Resduo 251
Resduo 282
Resduo 309
Figura 07. Estrutura do monmero de HA obtida por difrao de raios X (Influenza Sequence Data Base,
www.flu.lanl.gov). Modelo baseado na estrutura obtida por Sauter e cols., 1992 e depositada no Protein Data
Bank sob o nmero de acesso 1HGI. "Rasmol" (2.7.2.1.1), foi o programa utilizado na edio da figura (Sayle
e Milner-White 1995).
49
50
Cepa1
Cepa2
003H3
049H3
125H3
012H3
024H3
008H3
015H3
010H3
009H3
006H3
011H3
013H3
10
20
30
40
50
60
QKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILD
..L.................S...................................Q...
..L.V...............P...........H.......................Q...
..L.V...............P...........H.......................Q...
..L.V...............P...........H.......................Q...
..L.V...............P...........H.......................Q...
..L.V...............P........M..H.......................Q...
..L.................P.......................................
..L.................P.......................................
..L.................P.......................................
..L.................P.......................................
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Cepa1
Cepa2
003H3
049H3
125H3
012H3
024H3
008H3
015H3
010H3
009H3
006H3
011H3
013H3
70
80
90
100
110
120
GENCTLIDALLGDPHCDGFQNKEWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEF
............................................................
...............................T............................
...............................T............................
...............................T...................I........
...............................T............................
...............................T............................
.K..........................................................
.K..........................................................
.K..........................................................
.K..........................................................
------------------------------------........................
------------------------------------........................
------------------------------------........................
Cepa1
Cepa2
003H3
049H3
125H3
012H3
024H3
008H3
015H3
010H3
009H3
130
140
150
160
170
180
NNESFNWTGVAQNGTSYACKRSSIKSFFSRLNWLHQLKYKYPALNVTMPNNDKFDKLYIW
................S....R.N...........................E........
................S....R.I...........................E........
................S....R.I...........................E........
................S....R.I...........................E........
................S....R.I...........................E........
................S....R.I...........................E........
I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........
I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........
I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........
I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........
51
006H3
011H3
013H3
I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........
T..G........D.K......G.VN..........K.E......................
T..G........D.K......G.VN..........K.E......................
Cepa1
Cepa2
003H3
049H3
125H3
012H3
024H3
008H3
015H3
010H3
009H3
006H3
011H3
013H3
190
200
210
220
230
240
GVHHPSTDSDQTSIYAQASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSRPWVRGISSRISIYWTIVKPG
..L........I.L...............................V..............
..H........I.L...............................V..............
..H........I.L...............................V..............
..H.L......I.L...............................V..............
..H........I.L...............................V..............
..H........I.L...............................V..............
..H.....RE...L.VR............................L..............
..H.....RE...L.VR............................L..............
..H.....RE...L.VR............................L..............
..H.....RE...L.VR............................L..............
..H.....RE...L.VR............................L..............
..H..........L.V............................................
..H.....R....L.V............................................
Cepa1
Cepa2
003H3
049H3
125H3
012H3
024H3
008H3
015H3
010H3
009H3
006H3
011H3
013H3
250
260
270
280
290
300
DILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI
............................................................
..............................N.............................
..............................N.............................
..............................N.............................
..............................N.............................
..............................N.............................
.....................T.............T.S......................
.....................T.............T.S......................
.....................T.............T.S......................
.....................T.............T.S......................
.....................T.............T.S...------------------.....................N............DN.....------------------.....................N............DN.....-------------------
52
Cepa1
Cepa2
003H3
049H3
125H3
012H3
024H3
008H3
015H3
010H3
009H3
006H3
011H3
013H3
310
320
TYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQT
............................
............................
............................
................S...........
............................
............................
............................
............................
...........................N
............................
----------------------------------------------------------------------------------
Figura 08. Comparao entre as seqncias peptdicas de HA1 obtidas de amostras do tipo
A subtipos H1N1 coletadas nos anos de 2000 e 2001 e as cepas vacinais A/Sydney/5/97 e
A/Panama/2007/99. Os pontos (.) indicam similaridade entre as seqncias obtidas da
amostras e as seqncias de aminocidos das cepas vacinais. Somente as diferenas de
aminocidos da seqncia cepa vacinal esto representados. Traos (-) representam lacunas
geradas por ausncia de seqncia peptdica. A disposio grfica da figura foi obtida com
o auxlio do programa de computador "GeneDoc Multiple Sequence Alignment Editor &
Shading Utility" (verso 2.4.002). A ordem das seqncias na figura foi determinada pela
similaridade entre as seqncias e arranjadas pelo programa de computador "ClustalX"
(verso 1.83). A cepa vacinal do ano 2000 A/Sydney/5/97 representada na figura como
Cepa1. A cepa vacinal do ano 2001; A/Panama/2007/99 est representada na figura como
Cepa2. A seqncia peptdica do ano 2001 est em itlico e negrito (amostra 125), as
demais so referentes ao ano de 2000.
53
Posio dos
Cepa Vacinal
Amostra
Resduos
(2000)
Isoleucina
Leucina
---
Glicina
Valina
---
30
Treonina
Metionina
---
33
Glutamina
Histidina
---
57
Arginina
Glutamina
Lisina
Alterao
Stio
Antignico
62
cido
Glutmico
92
Lisina
Treonina
121
Asparagina
Isoleucina
011 e 013
121
Asparagina
Treonina
124
Serina
cido
e 049
006, 008, 009,
010 e 015
54
Nmero da
Posio dos
Cepa Vacinal
Amostra
Resduos
(2000)
010 e 015
011 e 013
006, 008, 009,
010 e 015
011 e 013
006, 008, 009,
010 e 015
011 e 013
003, 012, 024
e 049
Alterao
Stio
Antignico
Asprtico
124
Serina
Glicina
133
Asparagina
Serina
133
Asparagina
135
Treonina
135
Treonina
Lisina
137
Tirosina
Serina
142
Serina
Glicina
142
Serina
Arginina
144
Isoleucina
Valina
145
Lisina
Asparagina
156
Glutamina
Lisina
157
Leucina
Serina
cido
Asprtico
cido
Glutmico
A
A
55
Nmero da
Posio dos
Cepa Vacinal
Amostra
Resduos
(2000)
158
Lisina
158
Lisina
172
cido
Asprtico
Alterao
cido
Asprtico
cido
Glutmico
Glicina
Stio
Antignico
B
B
D
cido
cido
Asprtico
Glutmico
Serina
Arginina
cido
cido
Asprtico
Glutmico
192
Treonina
Isoleucina
194
Isoleucina
Leucina
196
Alanina
Valina
197
Glutamina
Arginina
226
Isoleucina
Leucina
226
Isoleucina
Valina
172
189
015
006, 008, 009,
010 e 015
003, 012, 024
e 049
190
56
Nmero da
Posio dos
Cepa Vacinal
Amostra
Resduos
(2000)
262
Serina
Treonina
262
Serina
Asparagina
Asparagina
---
271
cido
Asprtico
Alterao
Stio
Antignico
cido
275
Glicina
276
Lisina
Treonina
276
Lisina
Asparagina
278
Asparagina
Serina
328
Treonina
Asparagina
---
Asprtico
57
Cepa Vacinal
Resduos
(2001)
05
Glicina
Valina
---
21
Serina
Prolina
---
33
Glutamina
Histidina
---
92
Lisina
Treonina
112
Valina
Isoleucina
---
144
Asparagina
Isoleucina
183
Leucina
Histidina
---
185
Prolina
Leucina
---
Asparagina
---
Serina
---
271
317
cido
Asprtico
Alanina
Amostra 125
Stio
Antignico
58
Legenda
A) Mutaes no stio antignico A.
Resduo 133
Resduo 124
Resduo 135
Resduo 137
Resduo 142
Resduo 144
Resduo 145
B) Mutaes no stio antignico B.
Resduo 156
Resduo 158
Resduo 190
Resduo 194
Resduo 197
Resduo 157
Resduo 189
Resduo 192
Resduo 196
Resduo 275
Resduo 276
Resduo 278
D) Mutaes no stio antignico D.
Resduo 121
Resduo 172
Resduo 226
E) Mutaes no stio antignico E.
Resduo 57
Resduo 92
Resduo 62
Resduo 262
Resduo 5
Resduo 30
Resduo 328
Resduo 183
Resduo 271
Figura 09. Monmero de HA obtida por difrao de raios X (www.flu.lanl.gov). Modelo baseado na estrutura
obtida por Sauter e cols., 1992 e depositada no Protein Data Bank sob o nmero de acesso 1HGI. "Rasmol"
(2.7.2.1.1), foi o programa utilizado na edio da figura (Sayle e Milner-White 1995)
59
4.3. Tipo B
Foram obtidos 7 produtos de "Nested Multiplex PCR" para as
amostras do tipo B. Dessas, 6 tiveram 93% das seqncias de nucleotdeos, da
regio codificadora de HA1 completa, determinadas. Devido no ter sido
possvel a obteno de produto de "Nested PCR" para a amostra 017, foi
obtida seqncia do produto de "Nested Multiplex PCR" com tamanho de 717
pares de bases ou, quando traduzidas para aminocidos um tamanho de 239
resduos, cerca de 69% da regio HA1 da hemaglutinina. Todas as seqncias
obtidas foram traduzidas para sua forma peptdica e comparadas com a
seqncia de aminocidos da cepa vacinal.
Para o ano de 2000 a OMS props para a composio da vacina a cepa
B/Beijing/184/93, ou B/Shandong/97, no entanto a cepa mais utilizada neste
ano foi B/Yamanashi/166/98 que possui padro antignico equivalente cepa
B/Beijing/184/93. Das 6 seqncias obtidas das amostras coletadas em 2000
foram encontradas 7 diferenas de resduos de aminocidos quando
comparadas com a seqncia peptdica da cepa vacinal proposta pela OMS
para o ano de 2000 B/Yamanashi/166/98 (figura 10, tabela 13). Para o ano
2001 a OMS props a cepa vacinal B/Sichuan/379/99 para a composio da
vacina, e a comparao da seqncia de peptdeos de HA1 com a seqncia da
amostra coletada no ano 2001, 110, mostrou 4 diferenas de resduos de
aminocidos (figura 10 e tabela 14).
60
Cepa1
Cepa2
55B
64B
74B
53B
79B
110B
17B
10
20
30
40
50
60
DRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTKTRGKLCPTCLNC
............................A...............................
............................A...............................
............................A...............................
............................A...............................
............................A...............................
............................A...............................
....S.......................A...............................
------------------------------------------------............
Cepa1
Cepa2
55B
64B
74B
53B
79B
110B
17B
70
80
90
100
110
120
TDLDVALGRPMCVGVTPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEKIRLS
..............I...........IK................................
..............I...........VR................................
..............I...........VR................................
..............I...........VR................................
..............I...........VR................................
..............I...........VR................................
..............I...........VR................................
..............I...........VR................................
Cepa1
Cepa2
55B
64B
74B
53B
79B
110B
17B
130
140
150
160
170
180
TQNVINAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSRSGFFATMAWAVPKDNNKTATNPLTVEVPHIC
............................K............R..................
............................K............R..................
............................K............R..................
............................K............R..................
............................K............R..................
............................K............RA.................
............................K............R..................
............................K............R..................
Cepa1
Cepa2
55B
64B
74B
53B
79B
110B
17B
190
200
210
220
230
240
TKEEDQITVWGFHSDNKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPDQTEDGGLP
...............D......................I.....................
...............N......................I.....................
...............N......................I.....................
...............N......................I.........D...........
...............N......................I.....................
...............N......................I.....................
...............N......................I.....................
...............N......................I.....................
Cepa1
Cepa2
55B
64B
74B
53B
79B
110B
17B
250
260
270
280
290
300
QSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYG
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
............................................................
...............................................-------------
61
Cepa1
Cepa2
55B
64B
74B
53B
79B
110B
17B
310
320
GLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPI
......................
......................
......................
......................
......................
......................
......................
----------------------
62
Posio dos
Amostra
Resduos
Cepa Vacinal
Alterao
29
Valina
Alanina
75
Valina
Isoleucina
149
Arginina
Lisina
162
Lisina
Arginina
079
163
219
Valina
074
229
Glicina
cido
Asprtico
Alanina
Isoleucina
cido
Asprtico
63
Cepa Vacinal
Amostra
Resduos
(2001)
125
05
Treronina
Serina
87
Isoleucina
Valina
88
Lisina
Arginina
196
cido Asprtico
Asparagina
64
apresentou
maior
similaridade
com
seqncia
(nmero
de
acesso
AJ457930)
A/Saudi
65
66
foram:
B/Vienna/1/99
(nmero
de
acesso
AF387495),
H3/Foca/92
H3/Sydney/97
H3/Michigan/99 (1)
BR003H3 (1)
BR125H3
BR012H3 (1)
H3/Panama/99
H3/Charl/99
H3/Suno/99
BR011H3 (4)
BR013H3
BR009H3
BR006H3 (3)
H3/S.Dakota/91
H3/Suno/84
H3/Suno/93
H3/Petbird/99
H3/Pato/77
H3/Ganso/76
H3/Eqino/81
H3/Eqino/94
H5/Peru/91
BR103H1
BR112H1
BR099H1 (1)
H1/Fukui/01 (2)
BR104H1 (5)
BR101H1
BR121H1 (1)
H1/N.Caled/99
BR015H1
H1/Madag/00
H1/Canada/88 (1)
BR006H1
H1/Suita/89
H1/Suno/98
H1/Pato/01
H1/Peru/99
H1/Suno/85
H1/Pato/76
B/Yaman/98
B/Kansas/99
BR017B
B/Michigan/99
BR074B
B/Sichuan/99
BR079B
BR053B (3)
B/99
B/Neth/98
B/40
B/Vienna/99
He/C/99
He/C/66
67
Tipo A Subtipo H3
Tipo A Subtipo H1
Tipo B
Figura 11. rvore obtida atravs do programa de computador "DNAstar" pela comparao da seqncia de
nucleotdeos das amostras coletadas e seqncias obtidas no "GeneBank". Nossas amostras esto em negrito e
possuem o prefixo BR. As demais amostras foram obtidas no "GenBank" (tabela 15). Os nmeros entre parnteses
indicam a quantidade de amostras com seqncias idnticas. Estas amostras foram excludas da figura (tabela 16).
68
Cepa
Nmero de Acesso
He/C/66
He/C/99
B/Yaman/98
B/Kansas/99
B/Michigan/99
B/Sichuan/99
B/99
B/Neth/98
B/Vienna/99
B/40
H5/Peru/91
H1/Pato/76
H1/Suno/85
H1/Suno/98
H1/Peru/99
H1/Pato/01
H1/Madag/00
H1/Canada/88
H1/Suita/89
H1/N.Caled/99
H1/Fukui/01
H3/Eqino/94
H3/Eqino/81
H3/Foca/92
H3/Petbird/99
H3/Ganso/76
H3/Pato/77
H3/Suno/93
H3/Suno/84
H3/S.Dakota/91
H3/Suno/99
H3/Sydney/97
H3/Michigan/99
H3/Charl/99
H3/Panama/99
C/Johannesburg/1966
C/Miyagi/3/1999
B/Yamanashi/166/1998
B/Kansas/22992/1999
B/Michigan/22691/1999
B/Sichuan/379/1999
B/Hong Kong/157/1999
B/Netherlands/429/1998
B/Vienna/1/1999
B/Lee/1940
A/turkey/England/50-92/1991
A/duck/Alberta/35/1976
A/swine/Netherlands/12/1985
A/Swine/Wisconsin/464/1998
A/Turkey/MO/24093/1999
A/Duck/NC/91347/2001
A/Madagascar/57794/2000
A/Canada/7/1988
A/Suita/1/1989
A/New Caledonia/20/1999
A/Fukui/1/2001
A/Equine/Kentucky/1/1994
A/eq/Kentucky/1981
A/Seal/MA/3911/92
A/pet bird/Hong Kong/1559/1999
A/Gs/HK/10/1976
A/DK/HK/231/77
A/swine/Bakum/909/1993
A/Swine/Ukkel/1/1984
A/South_Dakota/1/1991
A/Swine/Minnesota/593/1999
A/Sydney/5/1997
A/Michigan/22568/1999
A/Charlottesville/69/1999
A/Panama/2007/1999
M17868
AB086669
AF100355
AY096190
AY096187
AF319590
AF387503
AF217216
AF387495
J02093
S68489
AF091309
AF091317
AF222036
AY038014
AY233393
AJ457893
L19021
D13573
AJ344014
AB117181
L39914
U58195
L31949
AJ427304
D00930
D00932
AJ 252130
M73775
AF008675
AF251427
AJ311466
AF501531
AF297097
ISDNCDA001
69
Tabela 16. Amostras com seqncias idnticas (complementao das informaes da rvore genealgica).
Idntica 1
A/Canada/7/88
A/Michigan/22568/99
BR003H3
BR012H3
BR099H1
BR121H1
A/Finland/74/88
A/Virginia/21833/99
BR049H3
BR024H3
BR109H1
BR122H1
A/Fukui/1/01
A/Ireland/649/01
BR011H3
BR006H3
BR053B
BR104H1
A/Finland/380/95
BR008H3
BR055B
BR113H1
Idntica 2
Idntica 3
Idntica 4
Idntica 5
A/Saudi
Arabia/7971/00
A/Osaka/c1/95
BR010H3
BR064B
BR114H1
A/Korea/45/96 A/Brazil/2/95
BR015H3
BR110B
BR126H1
BR126H1
BR140H1
70
V - Discusso
A metodologia empregada neste trabalho seguiu uma estratgia que
permitisse obter dados moleculares diretamente das amostras clnicas
coletadas, com o objetivo de caracterizar variaes moleculares da regio
externa da hemaglutinina do vrus da gripe (HA1). Com o objetivo de
caracterizar variaes moleculares de HA1, foram realizadas reaes
diretamente a partir das amostras clnicas, pois so conhecidos os fenmenos
de mutao no genoma viral durante o processo de cultivo, alm da seleo de
variantes com maior afinidade pelos receptores celulares das culturas,
principalmente quando os vrus so cultivados em ovos embrionados (Rocha e
col., 1993, Gambaryan e col., 1999). Aliado a estes fenmenos est a presso
seletiva exercida pelo hospedeiro que seleciona os vrus mais aptos a escapar
do sistema imune do hospedeiro e com isso gerar novos quadros infecciosos.
A variao continua na seqncia gentica atravs de mutaes de ponto
favorece o surgimento de alteraes nas propriedades antignicas de HA1. O
processo de variao antignica atravs de mutaes pontuais e contnuas
denominada de drift antignico (Plotkin e col., 2002). O monitoramento
continuado dos fenmenos de drift importante para a seleo de cepas
vacinais eficientes (Besselaar e col., 2004).
A tcnica de Nested Multiplex PCR permitiu a deteco de 35
amostras positivas, com 36 produtos de reao independentes, para o vrus
influenza dentre as 148 estudadas (24,3 % do total) A porcentagem na
obteno de amostras positivas utilizando-se esta tcnica pode sofrer grandes
variaes, onde muitos fatores contribuem para isso. Entre eles esto, o
perodo de coleta das amostras, que podem ou no coincidir com picos de
circulao viral, o mtodo de coleta das amostras, o tempo de demora no
71
72
73
74
75
76
as
seguintes
cepas:
A/Moscow/10/99
(H3N2),
A/New
77
78
79
80
81
VI Concluso
Com base nos resultados obtidos podemos concluir:
1) A tcnica de "Nested Multiplex PCR" eficiente para a deteco, tipagem e
subtipagem de amostras clnicas com rapidez e sensibilidade.
2) Variantes de influenza caractersticos de anos passados, at 12 anos, podem
circular em crianas e causar gripe em imunodeprimidos ou pessoas
suscetveis.
3) Casos de co-infeces como as aqui relatadas, do subsdio teoria de
surgimento do novo subtipo H1N2.
4) O nmero de alteraes de aminocidos verificadas entre as seqncias
obtidas das amostras estudadas e as seqncias das cepas vacinais indica a
necessidade de monitorao anual dos vrus influenza em circulao no Brasil.
5) Mais dados de seqncias do hemisfrio sul so necessrios para a melhor
escolha das cepas vacinais.
6) As alteraes encontradas nos vrus da influenza A subtipo H3N2 sugerem
que a vacina pode no ter sido eficiente no ano de 2000.
7) As amostras coletadas no ano de 2000 do tipo A subtipo H3N2 tendo em
vista a seqnciamento de uma s amostra em 2001, aparentemente seriam
melhores candidatas composio da vacina para o ano 2001.
8) As amostras coletadas em 2000 para o tipo B seriam melhores candidatas
para a composio da vacina para o ano de 2001; onde s obtivemos o
seqnciamento
de
uma
amostra.
82
83
For
2001,
comparison
of
flu
B and
vaccine
strain
84
Data da
Idade do
Doena de
amostra
coleta
Paciente
Base
001
30/05/00
53 anos
---
---
negativa
002
30/05/00
57 anos
---
---
negativa
003
15/06/00
40 anos
---
---
H3N2
004
15/06/00
24
---
---
negativa
005
16/06/00
Aids
---
negativa
006
16/06/00
Aids
---
007
06/07/00
---
---
negativa
008
06/07/00
3 anos
---
---
H3N2
009
06/07/00
9 anos
---
---
H3N2
010
6 meses
---
---
H3N2
011
06/07/00
07/07/00
4 anos
Neuropatia
---
H3N2
012
07/07/00
10 meses
---
---
H3N2
013
07/07/00
4 anos
---
---
H3N2
014
12/07/00
3 meses
---
---
negativa
015
12/07/00
5 anos
---
---
016
12/07/00
4 meses
---
---
negativa
---
---
Tipo B
---
---
H3N2
017
12/07/00
018
14/07/00
no
fornecida
no
fornecida
7 anos e 10
meses
no
fornecida
2 anos e 11
meses
Observaes
Multiplex
PCR
H1N1 e
H3N2
H1N1 e
H3N2
85
No da
Data da
Idade do
Doena de
amostra
coleta
Pacinte
Base
019
14/07/00
020
14/07/00
021
14/07/00
022
19/07/00
023
19/07/00
2 anos e 10
Observaes
Multiplex
PCR
---
---
negativa
7 meses
---
---
negativa
8 meses
---
---
negativa
Cardiopatia
---
negativa
---
---
negativa
---
---
H3N2
meses
no
fornecida
8 meses
10 anos e
024
19/07/00
025
10 anos
---
---
negativa
026
19/07/00
21/07/00
10 meses
---
---
negativa
027
21/07/00
1 ano
---
---
negativa
028
26/07/00
2 anos
---
---
negativa
029
26/07/00
2 anos
---
---
negativa
030
26/07/00
2 meses
---
---
negativa
031
2 anos
---
---
negativa
032
26/07/00
01/08/00
1 ms
---
---
negativa
033
01/08/00
---
---
negativa
034
01/08/00
2 anos
---
---
negativa
035
01/08/00
3 anos
---
---
negativa
036
01/08/00
10 anos
---
---
negativa
037
30 anos
---
---
negativa
038
01/08/00
28/07/00
45 anos
---
---
negativa
039
31/07/00
40 anos
---
---
10 meses
1 ano e 9
meses
negativa
86
No da
Data da
Idade do
Doena de
amostra
coleta
Pacinte
Base
040
01/08/00
42 anos
---
---
negativa
041
03/08/00
27 anos
---
---
negativa
042
04/08/00
Diarria
---
negativa
043
05/08/00
5 anos
---
---
negativa
044
09/08/00
33 anos
---
---
negativa
045
10/08/00
38 anos
---
---
negativa
046
11/08/00
3 anos
---
---
negativa
047
11/08/00
28 anos
---
---
negativa
048
11/08/00
14 anos
Aids
---
negativa
049
15/08/00
5 anos
---
---
H3N2
050
15/08/00
23 anos
---
---
negativa
051
16/08/00
40 anos
---
---
negativa
052
16/08/00
20 anos
---
---
negativa
053
17/08/00
6 anos
AIDS
---
Tipo B
054
17/08/00
10 anos
AIDS
---
negativa
Neuroglioma
---
Tipo B
---
negativa
1 ano e 9
meses
1 ano e 5
Observaes
Multiplex
PCR
055
17/08/00
056
17/08/00
2 anos
057
17/08/00
30 anos
---
---
negativa
058
17/08/00
24 anos
---
---
negativa
059
17/08/00
7 anos
---
---
negativa
060
18/08/00
38 anos
---
---
negativa
061
21/08/00
21 anos
---
---
meses
Insuficincia
renal
negativa
87
No da
Data da
Idade do
Doena de
amostra
coleta
Pacinte
Base
Observaes
Multiplex
PCR
Meningite
062
23/08/00
10 meses
---
negativa
---
negativa
Hidrocefalia
---
Tipo B
---
---
negativa
---
---
negativa
---
---
negativa
---
---
negativa
---
negativa
---
negativa
---
negativa
---
Grvida
negativa
---
---
negativa
---
---
Tipo B
em
tratamento
063
23/08/00
064
23/08/00
065
31/08/00
066
31/08/00
067
31/08/00
068
05/09/00
12 meses
1 ano e 2
meses
no
fornecida
no
fornecida
no
fornecida
7 meses
Fibrose
cstica
Insuficincia
069
05/09/00
18 anos
Renal
Crnica
070
05/09/00
1 ms e 4
dias
--Insuficincia
071
05/09/00
5 anos
Renal
Crnica
072
12/09/00
073
12/09/00
074
14/09/00
27 anos
2 anos e 3
meses
28 anos
88
No da
Data da
Idade do
Doena de
amostra
coleta
Pacinte
Base
075
14/09/00
076
14/09/00
077
no
Observaes
Multiplex
PCR
---
---
negativa
11 meses
---
---
negativa
14/09/00
3 anos
---
---
negativa
078
19/09/00
4 meses
---
---
negativa
079
19/09/00
---
---
Tipo B
fornecida
no
fornecida
Teste Rpido
080
22/09/00
27 anos
---
para
influenza
negativa
negativo
Teste Rpido
081
22/09/00
no
fornecida
---
para
influenza
negativa
negativo
082
28/09/00
5 meses
---
---
negativa
083
04/10/00
10 meses
Conjuntivite
---
negativa
Teste Rpido
084
04/10/00
no
fornecida
---
para
influenza
negativa
negativo
085
11/10/00
5 meses
---
Gemelar 1
negativa
negativa
086
11/10/00
5 meses
---
Gemelar 2
89
No da
Data da
Idade do
Doena de
amostra
coleta
Pacinte
Base
Observaes
Multiplex
PCR
Teste Rpido
087
11/10/00
1 ano e 3
meses
---
para
influenza
negativa
negativo
088
11/10/00
10 anos
089
24/10/00
35 anos
090
24/10/00
091
092
24/10/00
04/07/01
093
Crise de
---
negativa
---
---
negativa
12 anos
---
---
negativa
4 anos
---
---
negativa
26 anos
---
---
negativa
04/07/01
7 meses
---
---
negativa
094
04/07/01
11 anos
---
---
negativa
095
04/07/01
---
---
negativa
096
04/07/01
2 anos
---
---
negativa
097
04/07/01
4 anos
---
---
negativa
098
04/07/01
5 meses
---
---
negativa
099
05/07/01
13 anos
---
---
H1N1
100
05/07/01
---
---
negativa
101
05/07/01
6 meses
---
---
H1N1
102
05/07/01
11 anos
---
---
negativa
103
09/07/01
24 anos
---
---
H1N1
104
09/07/01
5 anos
---
---
H1N1
105
09/07/01
---
---
negativa
2meses e 15
dias
2 anos e 9
meses
no
fornecida
asma
90
No da
Data da
Idade do
Doena de
amostra
coleta
Pacinte
Base
106
12/07/01
5 anos
---
---
negativa
107
12/07/01
23 anos
---
---
negativa
108
12/07/01
4 anos
Pneumonia
---
negativa
109
16/07/01
3 anos
---
---
H1N1
110
16/07/01
---
---
Tipo B
111
16/07/01
---
---
negativa
112
16/07/01
24 anos
---
---
H1N1
113
18/07/01
40 anos
---
---
H1N1
114
18/07/01
3 anos
Leucemia
---
H1N1
115
18/07/01
1 ano
---
---
negativa
116
18/07/01
25 anos
---
---
negativa
117
25/07/01
27 anos
---
---
negativa
118
25/07/01
8 meses
Convulso
---
negativa
119
25/07/01
---
---
negativa
120
27/07/01
---
---
H3N2
121
27/07/01
1 ano
---
---
H1N1
122
27/07/01
3 anos
---
---
H1N1
123
27/07/01
5 anos
---
---
H1N1
124
30/07/01
4anos
---
---
negativa
125
30/07/01
---
---
H3N2
126
30/07/01
---
---
H1N1
1 ano e 3
meses
4 anos e 9
meses
1 ano e 6
meses
no
fornecida
1 ano e 11
meses
1 ano
Observaes
Multiplex
PCR
91
No da
Data da
Idade do
Doena de
amostra
coleta
Pacinte
Base
127
30/07/01
28 anos
---
---
negativa
128
30/07/01
6 meses
---
---
negativa
129
03/08/01
23 anos
---
---
negativa
130
03/08/01
5 meses
---
---
negativa
131
03/08/01
10 meses
---
---
negativa
132
06/08/01
1 ano
---
Filho
negativa
133
06/08/01
30 anos
---
Me
H1N1
134
06/08/01
---
---
negativa
135
06/08/01
2 anos
Otite
---
negativa
136
08/08/01
29 anos
---
---
negativa
137
08/08/01
---
Internada
negativa
138
08/08/01
Otite
---
negativa
139
08/08/01
---
---
negativa
140
10/08/01
9 anos
---
---
H1N1
141
10/08/01
2 anos
---
---
negativa
142
10/08/01
---
---
negativa
143
13/08/01
3 anos
---
---
negativa
144
13/08/01
5 meses
---
---
negativa
145
13/08/01
5 meses
---
---
negativa
146
15/08/01
1 ano e 6
meses
1 ano e 4
meses
6 meses
1 ano e 7
meses
1 ano e 10
meses
no
fornecida
Observaes
Multiplex
PCR
negativa
---
---
92
No da
Data da
Idade do
Doena de
amostra
coleta
Pacinte
Base
147
15/08/01
148
15/08/01
no
fornecida
no
fornecida
Observaes
Multiplex
PCR
---
---
negativa
---
---
negativa
93
94
Nmero de Amostras
42
25
15
14
9
4
0
01/10 a 24/10
95
16
14
16
14
14
13
12
10
8
6
4
2
0
07/08 a 15/08
96
Nmero de Pacientes
70
60
0 - 2 anos
60
3 - 5 anos
50
6 - 10 anos
40
30
20
10
11 - 18 anos
22
19
10
15
16
19 - 29 anos
30 - 57 anos
Sem Registro
0
Idade dos Pacientes
97
XI - Referncias Bibliogrficas
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XII - Biografia.
Miguel Augusto Golono, nascido em 13 de novembro de 1974, em
Londrina no Pr. Ingressou na Universidade Estadual de Londrina em 1993 no
curso de Cincias Bilogicas, titulando-se em licenciatura em 1997. Vrios
trabalhos apresentados em forma de painel em congressos, como o Brasileiro
de Gentica, Brasileiro de Virologia, e Reunies Cientficas do Instituto
Butantan. Prmio Jovem Cientista categoria Mestrado, meno honrosa
proferida ao Trabalho Co-infeces Causadas por Diferentes Tipos e
Subtipos do Vrus Influenza, Reunies Cientficas do Instituto Butantan, em
2002. E pai de gmeas tambm em 2002, as quais dediquei este trabalho.