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Introduccin
00
Rodicio MR y Mendoza MC. Identificacin bacteriana mediante secuenciacin del ARNr 16S: fundamento, metodologa y aplicaciones en microbiologa clnica
Ribosoma
bacteriano
Subunidades
Macromolculas
34 protenas
23S
2 ARNr
50S
5S
21 protenas
70S
1 ARNr
30S
16S
A
P1 P2
rrs
rrl
rrf
IG
IG
C
B
l1
l2
l3
1.500 bp
500 bp
239
Rodicio MR y Mendoza MC. Identificacin bacteriana mediante secuenciacin del ARNr 16S: fundamento, metodologa y aplicaciones en microbiologa clnica
39
40
41
38
42
V6
36
P41-3
P35-2
23
P35-1
24
35
44
V5
25
34
27
43
33
22
26
28
21
29
V8
32
20
31
2
19
45
30
P45-1
46
1
P21-1
P45-2
47
18
4
P17-1
V3
48
V9
17
16
15
14
7
13
V1
12
11
V2
10
Figura 3. Estructura secundaria del ARNr 16S (tomada de Neefs et al5, con
permiso de Oxford University Press; Reino Unido). Las hlices comunes a todos
los seres vivos, denominadas hlices universales, se numeran de la 1 a la 48, en
orden de aparicin a partir del extremo 5. Las hlices especficas de procariotas
se indican con Pa-b, donde a es el nmero de la hlice universal precedente y b el
nmero de serie. Las regiones relativamente conservadas se presentan en
negrilla. Las regiones variables, en lneas finas, se designan V1-V9, teniendo en
cuenta que V4 es exclusiva de eucariotas. Las regiones que se muestran en
lneas discontinuas slo estn presentes en un nmero limitado de estructuras.
Bacteria
Operones rrn
Acinetobacter sp.
Bacillus cereus
Bacteroides fragilis
Borrelia burgdorferi
Brucella spp.
Campylobacter jejuni
ATCC 700819
Chlamydia spp.
Clostridium perfringens
Corynebacterium
Coxiella burnetii
Escherichia coli
ATCC 10798
Haemophilus influenzae
ATCC 51907
Helicobacter pylori
26695
Leptospira interrogans
Listeria monocytogenes
Mycobacterium tuberculosis
Mycoplasma genitalium
Mycoplasma hominis
Neisseria meningitidis
MC 58
Pseudomonas aeruginosa
Rickettsia prowazekii
Salmonella spp.
Shigella spp.
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Treponema pallidum
ATCC 25870
Ureaplasma urealyticum
serovar 3
Vibrio cholerae
ATCC 39315
Yersinia pestis
7
12
5
2/1
3
P41-2
Diferencias
nt
Porcentaje
3
1
10
5
1
0-19
2
2
6
1
1
2
4
4
1
7
7
5/6
4
6
0,07
8
6
0-14
0,91
1,23
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Rodicio MR y Mendoza MC. Identificacin bacteriana mediante secuenciacin del ARNr 16S: fundamento, metodologa y aplicaciones en microbiologa clnica
Sustrato
Aislamiento/muestra clnica
Extraccin de ADN
Anlisis de la secuencia
Correccin de errores
Comparacin con otras secuencias
Trazado del rbol filogentico
a
b
c
d
e
f
g
h
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Rodicio MR y Mendoza MC. Identificacin bacteriana mediante secuenciacin del ARNr 16S: fundamento, metodologa y aplicaciones en microbiologa clnica
Oligonucletidos iniciadores
Para la amplificacin del ADNr 16S, las regiones
conservadas facilitan el diseo de oligonucletidos
iniciadores (20 nt, aproximadamente). Cuando se pretende
amplificar el ADNr 16S prcticamente completo, se utilizan
iniciadores diseados en base a secuencias conservadas
prximas a los extremos 5 y 3 del gen, que originan
amplicones de 1.500 pb, aproximadamente. Se ha
demostrado, sin embargo, que una identificacin precisa no
siempre requiere la amplificacin, y posterior secuenciacin,
del ADNr 16S completo. En estas circunstancias se
utilizarn oligonucletidos que permitan la amplificacin de
fragmentos de menor tamao, preferentemente las 500 pb
correspondientes al extremo 5 del gen (v. ms adelante).
En cualquier caso, antes de pasar a la siguiente etapa es
conveniente comprobar el producto mediante electroforesis
en gel de agarosa, para asegurar la presencia de un nico
fragmento, amplicn, del tamao adecuado (fig. 2).
Secuenciacin del amplicn
En esta etapa se llevan a cabo las reacciones de
secuenciacin y el anlisis de los productos por electroforesis.
Actualmente, se emplea la secuenciacin cclica, en una
reaccin similar a la de amplificacin, que utiliza un nico
iniciador por reaccin y terminadores marcados con
fluorocromos adecuados, que interrumpirn la sntesis
de manera aleatoria, y facilitarn la deteccin posterior de
los fragmentos interrumpidos.
La disponibilidad de secuenciadores automticos facilita
enormemente la etapa de deteccin. El nmero de bases
generadas por un secuenciador automtico es de 500 a 900,
dependiendo del capilar utilizado en la electroforesis. Por
ello, para la secuenciacin de las dos cadenas del ADNr 16S
completo, sern necesarios de 8 a 4 iniciadores, dos de los
cuales podrn ser los mismos utilizados en la amplificacin.
Sin embargo, la secuencia obtenida podr contener errores
y/o presentar posiciones ambiguas (indicadas por N). Por
ello, la obtencin de la secuencia definitiva requiere la
evaluacin de los electroferogramas y la alineacin de la
cadena directa con la reversa, para resolver las posibles
discrepancias. As, aunque la secuenciacin de una cadena
del amplicn puede conducir a una correcta identificacin,
la calidad de la secuencia ser ptima cuando la
comparacin de ambas cadenas se utiliza para la correccin
de errores.
Ya se ha indicado que la identificacin de una bacteria a
nivel de especie no requiere necesariamente la secuenciacin
del ADNr 16S completo. De hecho, aunque existen
posiciones filogenticamente informativas a lo largo de todo
el gen, la mayor variabilidad se concentra en las primeras
500 bases, correspondientes al extremo 5. Generalmente,
esta secuencia de 500 bases ser suficiente para la correcta
identificacin de un aislado clnico, necesitndose
nicamente 2 iniciadores11,13-15. En cualquier caso, la
secuenciacin de las dos cadenas del ADNr 16S completo
ser necesaria a la hora de identificar nuevos patgenos.
Anlisis de la secuencia
La ltima etapa ser la comparacin de la secuencia del
ADNr 16S con las depositadas en bases de datos.
Actualmente existen distintas bases de datos, algunas
pblicas, cuyo acceso es libre a travs de internet, como
GenBank NCBI (National Center for Biotechnology
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Rodicio MR y Mendoza MC. Identificacin bacteriana mediante secuenciacin del ARNr 16S: fundamento, metodologa y aplicaciones en microbiologa clnica
Conclusin
La secuenciacin del ADNr 16S constituye un mtodo
rpido y eficaz de identificacin bacteriana, del cual puede
beneficiarse la microbiologa clnica, al igual que otras ramas
de la microbiologa. A medida que los recursos tcnicos
aumentan, el precio se hace ms competitivo, por lo que
probablemente su utilizacin para la identificacin
sistemtica de bacterias patgenas ser slo cuestin de
tiempo.
Agradecimientos
Queremos agradecer a los Dres. Fernando Vzquez del Hospital
Monte Naranco de Oviedo, M. Cruz Martn, del Instituto de Productos
Lcteos (Asturias) y Jos Luis Martnez Fernndez, del Servicio de
Secuenciacin Automtica de la Universidad de Oviedo, por la lectura
crtica de este artculo, y por sus comentarios.
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NOTA
Los artculos publicados en la seccin Formacin Mdica Continuada forman parte de grupos
temticos especficos (antibiograma, antimicrobianos, etc.). Una vez finalizada la publicacin de
cada tema, se irn presentando al Sistema Espaol de Acreditacin de la Formacin Mdica
Continuada (SEAFORMEC) para la obtencin de crditos.
Una vez concedida la acreditacin, sta se anunciar oportunamente en la revista y se abrir un
perodo de inscripcin gratuito durante 3 meses para los socios de la SEIMC y suscriptores de la
Revista, al cabo del cual se iniciar la evaluacin, durante 1 mes, que se realizar a travs de la web
de Ediciones Doyma.
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Rodicio MR y Mendoza MC. Identificacin bacteriana mediante secuenciacin del ARNr 16S: fundamento, metodologa y aplicaciones en microbiologa clnica
ANEXO 1. Identificacin bacteriana mediante secuenciacin del ARNr 16S: fundamento y aplicaciones en microbiologa clnica
1. La utilizacin de cidos nucleicos y protenas como cronmetros moleculares, fue inicialmente propuesta por:
a) Woese.
b) Zuckerkandl y Pauling.
c) Pasteur.
d) Darwin y Haeckel.
e) Whittaker.
2. Las macromolculas ms ampliamente utilizadas en estudios filogenticos y taxonmicos son:
a) Los ARNr 5S y 16S.
b) Los ARNr 18S y 23S.
c) Los ARNr 16S y 23S.
d) Los ARNr 16S y 18S.
e) Las protenas ribosmicas.
3. Los organismos celulares se agrupan actualmente en los siguientes dominios:
a) Bacteria, Plantae, Animalia.
b) Virus, Prokarya, Eucarya.
c) Bacteria, Archaea, Eukarya.
d) Prokaryotae, Protista, Fungi, Plantae, Animalia.
e) Prokarya y Eukarya.
4. La utilizacin del ARNr 16S como cronmetro molecular tiene en cuenta que:
a) Se encuentra presente en todas las bacterias.
b) Su estructura y funcin han permanecido constantes a lo largo del tiempo.
c) Contiene regiones constantes y variables.
d) Existen bases de datos que incluyen un nmero muy elevado de secuencias.
e) Todas las anteriores.
5. El opern ribosmico (rrn) de las bacterias:
a) Puede encontrarse en ms de una copia por genoma.
b) Contiene genes para los ARNr 16S, 18S y 23S.
c) Contiene genes para ARNs y protenas ribosmicas.
d) Slo contiene genes para ARNs ribosmicos.
e) Cada gen del opern se transcribe independientemente.
6. En taxonoma bacteriana la especie se define como:
a) Conjunto de cepas que comparten una similitud del 70% o ms en experimentos de reasociacin ADN-ADN.
b) Conjunto de cepas cuyos ADNs 16S comparten una identidad del 93% o ms.
c) Conjunto de cepas pertenecientes al mismo serotipo.
d) Conjunto de cepas que pueden intercambiar informacin gentica mediante recombinacin homloga.
e) Todas las anteriores.
7. En la identificacin por secuenciacin de ADNr 16S, la utilizacin de ms de una base de datos puede ser decisiva
cuando:
a) El amplicn secuenciado procede directamente de una muestra clnica.
b) Se utilizan bases de datos, de libre acceso o comerciales, potencialmente incompletas.
c) Se desea una identificacin rpida.
d) Se pretenden construir rboles filogenticos.
e) Se comparan secuencias de especies conocidas.
8. La primera vez que la secuenciacin del ADNr 16S condujo al descubrimiento de un nuevo agente patgeno
el mtodo se aplic a muestras clnicas de pacientes con angiomatosis bacilar. La bacteria identificada fue:
a) Tropheryma whipellii.
b) Francisella turalensis.
c) Haemophilus ducreyi.
d) Bartonella quintana.
e) Pseudomonas aeruginosa.
9. La identificacin directa de bacterias en muestras clnicas mediante secuenciacin del ADNr 16S respecto
a la identificacin a partir de cultivo tiene como limitacin:
a) Es ms costosa.
b) Requiere especialistas en gentica molecular.
c) No se asla la bacteria, por lo que no es posible la caracterizacin posterior.
d) No sirve para bacterias emergentes como patgenos humanos.
e) No permite identificar bacterias responsables de bacteremias.
10. En la actualidad, una de las aplicaciones ms importantes de la secuenciacin del ADNr 16S es la identificacin de:
a) Especies con baja relevancia clnica.
b) Especies resistentes a antimicrobianos.
c) Pseudomonas aeruginosa.
d) Neisseria meningitidis.
e) Micobacterias no-tuberculosas.
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