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ORIGINALES
Actividad de la telomerasa en leucocitos
de sangre perifrica de pacientes con
hipertensin arterial esencial
48.509
Se han involucrado mecanismos inmunes en la patogenia de la enfermedad hipertensiva, implicando tanto a la inmunidad celular como a la humoral1. Los
leucocitos han sido objeto de gran inters
en estudios sobre la patogenia de la hipertensin arterial (HTA)2. Se ha encontrado una asociacin entre un nmero
alto de leucocitos y mayor incidencia de
hipertensin3-5. Igualmente, se ha demostrado un incremento de la adhesin
de los leucocitos a la pared endotelial6-11
y el papel de las citocinas, tales como la
interleucina 1 beta (IL-1), interleucina 6
(IL-6) y el factor de necrosis tumoral alfa
(TNF-) en el desarrollo de la aterosclerosis12-14. Tambin se han encontrado alteraciones de la inmunidad humoral y del
sistema del complemento en pacientes
con HTA, principalmente hipergammaglobulinemia15-28.
Por otro lado, existen evidencias experimentales que apuntan a que un reloj
biolgico, el telmero, podra desempear un papel crtico en el control del lapso de vida celular in vitro y probablemente in vivo. Los telmeros son estructuras
especializadas que se encuentran al final
de los cromosomas de clulas eucariotas
y actan en la proteccin de los genes localizados en regiones subtelomricas y
en el posicionamiento y replicacin de los
cromosomas. La hiptesis telomrica del
envejecimiento celular podra explicar la
enigmtica expresin de la HTA esencial,
incluyendo la dependencia que sta tiene con la edad y su expresin fenotpica
inestable.
Los individuos que heredan telmeros
acortados son ms propensos a desarrollar en edades ms jvenes disfunciones
relacionadas con el acortamiento del telmero, incluyendo la expresin de variaciones genticas que causan HTA28-30. Ya
sea de forma primaria o secundaria, el
acortamiento telomrico puede formar
parte del curso clnico de la HTA esencial, bien sea aumentando la presin arterial o acelerando el envejecimiento mediado por la hipertensin de los rganos
implicados en la patogenia de ese trastorno.
Med Clin (Barc) 2003;120(10):365-9
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TABLA 1
Distribucin de los pacientes segn grupos de edades
Edad (aos)
Normotensos (n)
Total (n)
6
5
11
4
5
9
6
5
11
16
15
31
45
> 45
Total
HTA: hipertensin arterial.
mos 2 l del extracto (correspondiente a 200 clulas). El control positivo es parte del kit de diagnstico
y est constituido por clulas inmortalizadas de rin
humano, a una concentracin de 1.000 clulas/l. El
valor de absorbancia obtenido para el control positivo
(A450nm-A690nm) fue de 2,364 por encima del valor de
1,5 dado como referencia, lo que validaba el procedimiento realizado. Igualmente se realizaron controles
positivos a diferentes diluciones partiendo de la
muestra original, obtenindose absorbancias menores a menores diluciones, indicativo de una menor
actividad de la telomerasa, ya que progresivamente
se disminuy la concentracin inicial de 1.000 clulas/l. Para el control negativo, se obtuvieron valores
de absorbancia de 0,055 que estn por debajo del
valor requerido para asegurar la eliminacin de la telomerasa.
Preparacin de las muestras. Se transfirieron 2
105 clulas por reaccin a un tubo de Eppendorf, se
centrifug a 3.000 g durante 10 min a 4 C, posteriormente se elimin el sobrenadante, las clulas se
resuspendieron en PBS y se repiti la centrifugacin. Se retir de nuevo cuidadosamente el sobrenadante y se resuspendieron las clulas en 200 l
de reactivo de lisis; se retropipete al menos tres
veces y se incub en hielo durante 30 min, posteriormente se centrifug el lisado a 16.000 g durante
20 min a 4 C. Se tomaron 180 ml del sobrenadante y se transfirieron a un tubo limpio que se congel
a 80 C hasta su utilizacin.
Reaccin TRAP. Para cada muestra que deba ser
analizada se transfirieron 25 l de la mezcla de reaccin (solucin 2 del kit) a un tubo para PCR, se
aadieron 2 l del extracto celular (corresponden a
2.000 clulas) y se complet hasta 50 l con agua
estril. Todos los pasos se realizaron en hielo. Posteriormente se transfirieron los tubos a un ciclador
trmico en el cual se efectu la reaccin combinada
de elongacin/amplificacin.
Hibridacin y enzimoinmunoanlisis. Se tomaron 20
l de reactivo de desnaturalizacin (solucin 3 del
kit) y se colocaron en una placa, se agregaron 5 l
del producto de amplificacin y se incub a temperatura ambiente durante 10 min. Posteriormente se
agregaron 225 l de buffer de hibridacin (solucin
4 del kit) y se mezcl (todo este proceso se realiz
para cada muestra). Se transfirieron 100 l de la
mezcla para una placa suministrada por el kit, se
cubri a fin de prevenir la evaporacin y se incub
durante 2 h a 37 C mientras se agitaba a 300 rpm.
Una vez realizada la incubacin, se retir la solucin
completamente y se lav con 250 l de solucin buffer
(solucin 5 del kit) durante 30 s cada una y se retir el buffer cuidadosamente. Con posterioridad se
aadieron 100 l de anti-DIG-POD (solucin 11 del
kit), se cubri la placa y se incub a temperatura
ambiente durante 30 min mientras se agitaba a 300
rpm. Se retir la solucin completamente, se lav
nuevamente con buffer 5 veces, se retir el buffer
y se agregaron 100 l de solucin TMB (solucin
8 del kit), se cubri la placa y se dej a temperatura
ambiente durante 20 min mientras se agitaba a 300
rpm. Sin retirar el sustrato, se agregaron 100 l de
reactivo con el fin de detener la reaccin (solucin
9 del kit). Posteriormente con un lector de enzimoinmunoanlisis se midi la absorbancia de las muestras a 450 nm con un valor de referencia de 690
nm dentro de los 30 min despus de haber detenido la reaccin (A450nm-A690nm). Estos anlisis se llevaron a cabo en el Laboratorio de Biologa Molecular
de Agentes Infecciosos del Instituto de Medicina Experimental (IME) y en el Instituto de Inmunologa de
la Universidad Central de Venezuela (UCV).
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0,09
Actividad de la telomerasa
Actividad de la telomerasa
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
HTA no controlada
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
45
> 45
Grupo de edad (aos)
HTA controlada
Actividad de la telomerasa
Sanos
0,08
45
> 45
Grupo de edad (aos)
0,10
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
45
> 45
Grupo de edad (aos)
Fig. 1. Actividad de la telomerasa en pacientes con hipertensin arterial (HTA) controlada, no controlada y normotensos, agrupados por edades.
Resultados
La mediana del recuento de leucocitos
de los pacientes sanos (n = 11) fue de
8.100 clulas/l (IC del 95%, 6.850-8.950)
mientras que los pacientes con HTA (n = 20)
presentaron una mediana de 23.250 clulas/l (IC del 95%, 12.100-32.050), diferencia que es estadsticamente significativa (p 0,05).
Se midi la absorbancia de todas las
muestras (tabla 2; figs. 1 y 2) y se calcul
la mediana de las mismas en cada grupo
obtenindose los siguientes resultados:
para el grupo con HTA controlada y edad
menor o igual a 45 aos fue de 0,056;
para el mismo grupo pero con edad mayor
de 45 aos fue de 0,081, diferencia estadsticamente significativa (p = 0,00049).
Para el grupo de HTA no controlada se
obtuvo una mediana de la absorbancia
de 0,08 para una edad de 45 aos o superior mientras que para los mayores de
45 aos fue de 0,0725, con un valor de p
0,05, diferencia estadsticamente significativa. Finalmente, para el grupo de pacientes sanos (sin HTA), obtuvimos una
mediana de la absorbancia de 0,071 para
los de edad menor o igual a 45 aos y de
0,0725 para los mayores de 45 aos, diferencia no significativa (p = 0,79) (fig. 1).
Cuando comparamos los grupos con una
edad menor o igual a 45 aos obtuvimos
los siguientes resultados (fig. 2): la absorbancia para el grupo de HTA controlada
fue de 0,056, mientras que en el grupo
de HTA no controlada fue de 0,08, siendo la diferencia estadsticamente significativa (p = 0,00032). La absorbancia en
el grupo de sujetos sanos fue de 0,071,
siendo la diferencia estadsticamente significativa tanto con el grupo con HTA
controlada (p = 0,00972) como con el
grupo de HTA no controlada (p 0,05,
prueba de Mann-Whitney). Sin embargo,
cuando comparamos los grupos de edad
mayor de 45 aos, encontramos que la
TABLA 2
Actividad de la telomerasa de los diferentes grupos estudiados
y distribuidos por edad
Edad (aos)
45
> 45
Sanos (n)
Mediana (intervalo)
Nmero
Mediana (intervalo)
Nmero
Mediana (intervalo)
Nmero
0,056 (0,05-0,064)
0,081 (0,0725-0,0875)
8
10
0,08 (0,073-0,095)
0,0725 (0,065-0,082)
12
10
0,071 (0,065-0,078)
0,073 (0,065-0,082)
12
10
Los datos se expresann como mediana con el intervalo de confianza del 95%. Anlsis de la variancia de Krustal y Wallis (p =
0,015, 5 grados de libertad).
Edad 45 aos
0,10
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
Se compararon los grupos utilizando anlisis estadsticos no paramtricos (anlisis de variancia de Kruskall y Wallis). Los valores de p inferiores a 0,05 se
consideraron significativos. Se calcul la mediana
con un intervalo de confianza (IC) del 95% por el
mtodo de Hodges y Lehman, y se utiliz tambin la
prueba de Mann-Whitney (Wilcoxon). Se emple el
programa EST.exe. del entorno MS WINDOWS 98
(Microsoft, Redmont, EE.UU.).
Actividad de la telomerasa
Anlisis estadstico
HTA
HTA no
PA
controlada controlada normal
Grupo de pacientes
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
HTA
HTA no
PA
controlada controlada normal
Grupo de pacientes
Fig. 2. Actividad de la telomerasa en pacientes con edades menores o iguales a 45 aos y mayores de 45
aos en los diferentes grupos estudiados. *Significacin con respecto a hipertensin arterial (HTA) no controlada; **significacin con respecto a normotensos.
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Actividad de la telomerasa
0,12
0,11
0,10
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
10
20
30
40
50
60
Edad (aos)
Mediana (intervalo)
HTA controlada
0,07 (0,0635-0,076)
HTA no controlada 0,0725 (0,0645-0,082)
Normotensos
0,069 (0,0625-0,0755)
Nmero
18
22
22
Los datos se expresan como mediana con el intervalo de confianza del 95%. Anlisis de la variancia de Kruskal y Wallis.
70
80
Fig. 3. Tendencia de la
actividad de la telomerasa
a disminuir con la edad.
La lnea indica la curva de
regresin determinada por
anlisis de regresin polinomial. Se incluye a todos
los pacientes estudiados.
enzimoinmunoanlisis, despus de amplificar por PCR las secuencias elongadas in vitro por la telomerasa presente en
los extractos. Se observ que los pacientes con HTA tienen mayor cantidad de
leucocitos (p 0,05) que los individuos
sanos. Este hallazgo concuerda con estudios realizados por Schmid-Schonbein et
al5, quienes encontraron un aumento
significativo del nmero de leucocitos en
ratas hipertensas. Igualmente Gillum y
Mussolino3 observaron una asociacin
entre la presencia de un alto nmero de
leucocitos y la mayor incidencia de HTA;
de ah que se involucre a los mecanismos inmunolgicos en la patogenia y
complicaciones de la HTA.
Otro hallazgo importante fue que la actividad de la telomerasa en los leucocitos de
la sangre perifrica tuvo tendencia a disminuir con la edad, independientemente
de la presencia o no de HTA (tabla 4,
fig. 3); sin embargo, esta disminucin no
fue lineal, en vista de que se detectaron
variaciones importantes despus de los
40 aos de edad, y en algunos casos con
una actividad de telomerasa muy baja o
ausente. Cuando slo se determin la relacin entre la edad y la actividad de la
telomerasa en los pacientes sanos, se observaron una mayor tendencia de disminucin de dicha actividad antes de los
40 aos y una mayor variacin, incluso
con aumento de la actividad, despus de
los 40 aos de edad, lo cual hizo evidente el efecto que tiene la HTA sobre la actividad de la telomerasa (datos no ex-
TABLA 4
Actividad de la telomerasa segn la edad de los pacientes
HTA controlada (n)
Edad (aos)
30
31-40
41-50
51-60
> 60
Media
Nmero
0,0535
0,048
0,0758
0,0825
0,0697
2
2
8
2
4
368
0,0725
0,09
0,0776
0,068
0,07
Sanos (n)
Nmero
Media
Nmero
2
6
8
2
4
0,074
0,0686
0,0617
0,0667
0,0745
4
6
4
4
4
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nar si tal activacin puede ser el resultado de la produccin de factores dependientes de la HTA.
Otra consideracin a tener en cuenta es
que si la HTA llevara a un aumento de la
actividad de la telomerasa en los leucocitos, y por ende a una proliferacin de stos, podra igualmente conducir a un aumento de la telomerasa en otras clulas
afectadas durante el proceso, como las
del endotelio vascular y msculo liso, y
por tanto a una hiperproliferacin de las
mismas y de esa manera participar en la
patogenia de la HTA esencial. Chang y
Harlery35 presentaron evidencias que
apuntan a que otras clulas del sistema
cardiovascular podran estar involucradas; as encontraron que clulas endoteliales de los vasos en humanos, como
otras clulas replicativas, presentan una
reduccin en la longitud del telmero dependiente de la edad35. Por su parte Cao
et al37 encontraron un aumento de la actividad de la telomerasa en aorta de ratas
hipertensas espontneas, tanto in vivo
como in vitro. La inhibicin de la telomerasa produjo en estas ratas una reduccin en la proliferacin incrementada de
las clulas del msculo liso vascular e indujo apoptosis de las mismas. La apoptosis se redujo al incrementar la expresin
de la protena supresora de tumor p53. A
su vez, Minamino y Kourembanas37 describieron que la telomerasa se expresa en
clulas del msculo liso vascular y que el
incremento de la actividad de la telomerasa se correlaciona con proliferacin de
estas clulas. En otro estudio, Minamino
et al38, por medio de la hipoxia crnica,
indujeron la proliferacin de clulas musculares lisas y el remodelado de la pared vascular pulmonar, esto como consecuencia del aumento, en estas clulas,
de la actividad de la telomerasa y de la
estabilizacin del telmero.
Existen algunas evidencias, basadas en
experimentos in vitro, que demuestran
que la senescencia de las clulas del endotelio vascular, mediada por el telmero, puede provocar disfuncin endotelial,
particularmente en regiones aterosclerticas. Este efecto puede estar mediado por
uno de los pocos factores que aceleran el
acortamiento del telmero en estas clulas y en los leucocitos, como son las molculas resultantes del estrs oxidativo. A
su vez, la inflamacin produce un incremento del estrs oxidativo y del recambio
de leucocitos. Estas evidencias estn en
lnea con el concepto de que la inflamacin es un factor importante que incrementa el riesgo de enfermedad cardiovascular asociado con la edad39.
Cuando comparamos la actividad de la telomerasa en los pacientes mayores de 45
aos, encontramos muy poca diferencia
entre los grupos; slo hubo diferencia es-
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