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Universit d'Oran Es-Snia

Facult des Sciences


Dpartement de Biologie
Laboratoire de Physiologie de la
Nutrition et Scurit Alimentaire

Mmoire de Magister
Spcialit: Biologie Animale
Option : Physiologie de la Nutrition et Scurit Alimentaire

Prsent Par

DIB Wafa

Effet probiotique du lait ferment sur linduction


de la tolrance orale la -lactoglobuline chez la
souris BALB/c

Soutenu le

Devant le Jury compos de:


Prsident
Rapporteur

KHEROUA Omar
CHEKROUN Abdallah

Examinateurs

SAIDI Djamel
BENSOLTANE Ahmed

Professeur, Universit dOran


Matre de Confrences,
Universit dOran
Professeur, Universit dOran
Professeur, Universit dOran

Je ddie ce travail
mes chers parents ;
Symbole damour inconditionnel
Symbole de tous les sacrifices
mes chers frres et surs;
mes beaux frres et belle sur;
mes chers neveux et nices;
mes chers oncles et tantes;
mes cousins et cousines ;
mes chres amies.

Ce travail rentre dans le cadre dun projet de recherche intitul : "Fonction intestinal
Nutrition - Alimentation". Agr par le vice rectorat de la post-graduation de luniversit
dOran. Il a t ralis au laboratoire de Physiologie de la Nutrition et Scurit Alimentaire
sous la direction et le suivi du Dr Chekroun Abdallah, Matre de confrence de physiologie
lUniversit dOran qui a su me faire bnficier de son exprience et de sa comptence. Je le
remercie pour la confiance qu'il m'a prodigu.
Un remerciement particulier Mr Kheroua Omar, Professeur lUniversit dOran
pour avoir accept de prsider ce modeste travail et pour les conseil quil ma prodigus. Quil
trouve ici, mes sincres remerciements et toute mon estime.
Je remercie vivement Mr Saidi Djamel, Professeur lUniversit dOran. Cest avec
beaucoup de plaisir que je lai vu accepter dtre examinateur de ce modeste travail. Je lui
exprime mes sincres remerciements et toute mon estime.
Mes vifs et sincres remerciements vont Mr Bensoltane Ahmed, Professeur
luniversit dOran pour avoir accepts dexaminer ce modeste travail. Quil trouve ici,
lexpression de toute ma reconnaissance.
Je remercie galement Mr Bensahla Ahmed et Mr Abi Ayad Sidi Mohamed El Amine,
Matres de confrence luniversit dOran pour leur accueil au laboratoire de Biologie
Marine o a t ralis une partie de lhistologie.
Mille mercis Dr Bensalah Farid, Mme Ben Abdallah Louiza, Mr Taleb Zohir,
enseignants au dpartement de Biologie de luniversit dOran.
Mes remerciements vont galement Dr Brahimi Mohamed et Dr Aimeur Omar,
Matres assistants au centre hospitalo-universitaire dOran.

Toute ma reconnaissance va lquipe de recherche et aux techniciennes de


Laboratoire de la Nutrition et Scurit Alimentaire en particulier Boudine Nora, Benziane

Yamina, El Mecherfi Kamel eddine, Kaddouri Hanane, Mehidi Nabila, Boutiba Nawel,
Mezmaze Fatseh, Addou Samia, Benacriche Benmhel et la promotion de magister 2005.

Je tiens remercier chaleureusement toutes mes amies de ma promotion : Belarbi


Hanane, Youcef Narimene, Haddi Soraya et Sidi Mahmoud Ghalia. Je leur exprime ma
profonde sympathie et leur souhaite une bonne continuation.

Mes remerciements vont galement au personnel administratif de notre dpartement


ainsi que tout les techniciens des laboratoires de biologie.

Les personnes que japprcie tant nombreuses, je ne pourrais les citer toutes, mais
elles savent que je leur suis trs reconnaissante pour toutes les discussions professionnelles ou
personnelles et tous les moments quon a partag ensemble.

Sommaire

INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ......................................................................................... 3
1. Ecosystme gastro-intestinal................................................................................................. 3
1.1 Description gnrale ........................................................................................................ 3
1.2. La microflore intestinale.................................................................................................. 3
1.3 Les facteurs majeurs influenant la microflore gastro-intestinale.................................... 5
1.4. Les organes lymphodes .................................................................................................. 7
1.5. Le systme immunitaire de la muqueuse intestinale ....................................................... 7
2. La tolrance orale ................................................................................................................. 10
2.1. Dfinition de la tolrance orale ....................................................................................... 10
2.2. Mcanismes cellulaires de la tolrance orale .................................................................. 10
2.2.1 La dltion clonale ........................................................................................................ 11
2.2.2. Lanergie clonale .......................................................................................................... 11
2.2.3. Limmunosuppression active........................................................................................ 12
2.3. Interactions entre les diffrents mcanismes ................................................................... 13
3. Allergies et intolrances alimentaires ................................................................................. 14
3.1. Les allergies alimentaires ................................................................................................ 14
3.2. Lintolrance alimentaire................................................................................................. 15
3.2.1. Mcanismes impliqus ................................................................................................. 15
3.3. La -lactoglobuline bovine (-Lg) .................................................................................. 16
3.4. Stratgies de prvention des allergies aux protines du lait de vache ............................ 19
3.4.1. Allaitement maternel et rgime dviction des protines du lait de vache................... 19
3.4.2. Hydrolyse des allergnes par des enzymes digestives.................................................. 20
3.4.3. Hydrolyse des allergnes par des enzymes bactriennes.............................................. 22
4. Les laits ferments ................................................................................................................ 23
4.1. Les bactries lactiques ..................................................................................................... 24
4.2. Les ferments effet probiotiques .................................................................................... 25
4.2.1. Les bactries probiotiques ............................................................................................ 26
4.2.1.1. Les bifidobactries..................................................................................................... 27
4.3. Critres de slection des souches probiotiques................................................................ 28
5. Les probiotiques et le systme immunitaire ..................................................................... 30
5.1. Effet des probiotiques sur le systme immunitaire.......................................................... 30
5.2. Les probiotiques et leurs effets bnfiques sur la sant .................................................. 30
5.3. Probiotiques et tolrance orale ....................................................................................... 33
5.4. Probiotiques et allergies .................................................................................................. 34
5.5. Mcanismes dinteraction entre les probiotiques et les cellules immunitaires.............. 35
MATERIELS & METHODES.................................................................................................. 38
1. Provenance des bactries ...................................................................................................... 38
2. Lait .......................................................................................................................................... 38
2.1. Ecrmage ............................................................................................................................. 38
3. Caractrisation morphologique des bactries...................................................................... 38
3.1. Purification des bactries................................................................................................... 38
3.2. Etude microbiologique ...................................................................................................... 40
3.2.1. Caractrisation morphologique des bactries ................................................................. 40
3.2.1.1. Identification morphologique ...................................................................................... 40

Sommaire
3.2.1.1.1 Etude macroscopique............................................................................................. 40
3.2.1.1.2. Etude microscopique ............................................................................................ 40
3.2.1.1.2.1. Coloration de Gram ........................................................................................... 40
3.2.2. Identification physiologique des bactries ................................................................. 40
3.2.2.1. Recherche de lenzyme catalase .............................................................................. 40
3.2.2.2. Recherche du type respiratoire et fermentaire......................................................... 41
3.2.2.3. Mobilit ou non des bactries.................................................................................. 41
4. Prparation des ferments.................................................................................................... 41
4.1. Prparation de linoculum .............................................................................................. 41
4.2. Prparation des ferments ................................................................................................ 41
5. Protocoles de prparation des diffrents laits ferments ................................................. 42
6. Caractrisation des cultures mixtes au cours de la fermentation du lait ....................... 42
6.1. Profil fermentaire des bactries ...................................................................................... 42
6.1.1. Mesure de la production dacide ................................................................................. 42
6.1.1.1. Principe de mesure ................................................................................................... 42
6.1.1.2. Procdure .................................................................................................................. 42
6.1.2. Mesure de la cintique de variation du pH .................................................................. 44
7. Caractrisation biochimique des laits ferments.............................................................. 44
7.1. Prparation des chantillons ........................................................................................... 44
7.1.1. Constitution des chantillons de laits ferments.......................................................... 44
7.2. Mesure de lactivit protolytique des bactries ............................................................ 44
7.2.1. Dosage des protines totales........................................................................................ 44
7.2.1.1. Procdure .................................................................................................................. 44
8. Etude de lantignicit rsiduelle des laits ferments....................................................... 46
8.1. Model animale ................................................................................................................ 46
8.2. Adjuvants........................................................................................................................ 46
8.2.1. Hydroxyde daluminium ............................................................................................. 46
8.3. Immunisation des animaux la -Lg ............................................................................. 46
8.3.1. Rpartition des lots ...................................................................................................... 46
8.3.2. Protocole dimmunisation ........................................................................................... 47
8.3.3. Prlvements des chantillons sanguins ...................................................................... 49
9. Evaluation du degr de sensibilisation des animaux ....................................................... 49
9.1. Titrage des anticorps IgG sriques anti -Lg par dosage immunoenzymatique ............ 49
9.1.1. Principe........................................................................................................................ 49
9.1.2. Mode opratoire........................................................................................................... 50
10. Etude histologique de lintestin de souris sensibilis par voie parentrale la Lg ................................................................................................................................................. 50
10.1. La fixation .................................................................................................................... 52
10.2. Inclusion et coupe des tissus ........................................................................................ 52
10.2.1. Les procds dinclusion .......................................................................................... 52
10.2.2. Inclusion la paraffine ............................................................................................. 53
10.2.2.2. Imprgnation par la paraffine ................................................................................ 53
10.2.3. Microtomisation et talement des coupes................................................................. 54
10.3. Coloration .................................................................................................................... 54
10.3.1. Dparaffinage ........................................................................................................... 54
10.3.2. Rhydratation ........................................................................................................... 54
10.3.3. Technique de coloration ........................................................................................... 55
10.3.3.1. Coloration nuclaire .............................................................................................. 55
10.3.3.2. Coloration topographique gnrale ....................................................................... 55
10.3.4. Mesure des villosits .................................................................................................. 56

Sommaire
10.3.4.1. Principe de la mesure............................................................................................... 56
10.3.4.2. Calcul....................................................................................................................... 58
10.3.5. Dnombrement des lymphocytes intra-pithliaux .................................................... 58
10.4. Analyse statistique......................................................................................................... 58
RESULTATS .............................................................................................................................. 59
1. Etude microbiologique ........................................................................................................... 59
1.1. Caractrisation morphologique des ferments .................................................................. 59
1.1.1. Aspect macroscopique et microscopique des bactries................................................ 59
1.1.1.1. Les lactobacilles ........................................................................................................ 59
1.1.1.1.1. Lactobacillus acidophilus....................................................................................... 59
1.1.1.1.2. Lactobacillus plantarum......................................................................................... 59
1.1.1.2. Les bifidobactries..................................................................................................... 59
2. Etude biochimique des laits ferments ............................................................................. 63
2.1. Cintique de production de lacide par les associations de lactobacilles et
bifidobactries .............................................................................................................................. 63
2.2. Cintique de variations du pH au cours de la fermentation du lait par les
associations de lactobacilles et de bifdobactries......................................................................... 63
2.3. Evaluation de la quantit de protines totales dans les laits ferments compare
celle du lait strile......................................................................................................................... 66
2.3.1. Teneurs en protines totales des laits ferments par Lactobacillus
acidophilus (La) associ des bifidobactries ............................................................................. 66
3. Titrage des anticorps IgG sriques anti -Lg .................................................................. 68
3.1. Contrle de limmunisation chez les souris sacrifies au 28me jours ............................. 68
3.2. Contrle de limmunisation chez les souris sacrifies au 50me jour............................... 70
3.3. Etude comparative de linduction de la tolrance orale la -Lg................................... 70
4. Etude histologique de lintestin des souris immunises compar au tmoin .................. 73
4.1. Effet de la sensibilisation et du gavage sur la structure intestinale des souris
sacrifies au 28me jour ................................................................................................................. 73
4.1.1. Aspect des muqueuses intestinales des souris tmoins au faible
grossissement (Gx10) ................................................................................................................... 73
4.1.2. Aspect des muqueuses intestinales des souris tmoins au fort grossissement
(Gx40)........................................................................................................................................... 73
4.1.3. Aspect des muqueuses intestinales des souris ayant subi un gavage avec une
solution saline et immunises la -Lg ....................................................................................... 77
4.1.4. Aspect des muqueuses intestinales des souris immunises la -Lg et gaves au
lait LF1 ........................................................................................................................................ 77
4.1.5. Aspect des muqueuses intestinales des souris immunises la -Lg et gaves au
lait LF2 ......................................................................................................................................... 77
4.2. Aspect des muqueuses intestinales des souris gaves avec une solution saline puis
immunises la -Lg et sacrifies au 50me jour.......................................................................... 81
4.2.1. Aspect des muqueuses intestinales des souris immunises la -Lg et gaves au
lait LF1 ......................................................................................................................................... 81
4.2.2. Aspect des muqueuses et des villosits intestinales des souris immunises la Lg et gaves au lait LF2 ............................................................................................................... 81
4.2.3. Etude comparative de la hauteur des villosits des souris sacrifies au 28me jour
et des souris sacrifies au 50me jour............................................................................................. 88
5. Dnombrement des lymphocytes intra-pithliaux (LIE) ................................................ 90

Sommaire
5.1. Dnombrement des lymphocytes intra-pithliaux chez les souris sacrifies au
28me jour ...................................................................................................................................... 90
5.2. Dnombrement des lymphocytes intra-pithliaux chez les souris sacrifies au
50me jour ...................................................................................................................................... 90
DISCUSSION.............................................................................................................................. 92
1. Evaluation de lactivit protolytique des bactries au cours de la fermentation ......... 93
2. Evaluation de la sensibilisation des souris la -Lg par voie parentrale...................... 94
3. Aspect histologique des muqueuses intestinales en rponse limmunisation la
-Lg, la colonisation de lintestin et au gavage par un lait ferment par des
probiotiques................................................................................................................................. 96
CONCLUSION ........................................................................................................................... 99
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................................. 100

Abrviations
Abrviations
ADN
: Acide DsoxyriboNuclique.
APLV
: Allergie au protines du lait de vache.
-Lg
: bta lactoglobuline.
BB
: Bifidobacterium bifidum.
BL
: Bifidobacteruim longum.
C
: degr celsus.
CMH
: Complexe Majeur dHistocompatibilit.
CPA
: Cellule Prsentatrice dAnticorps.
D
: degr dornic.
Eh
: potentiel doxydo-rduction.
ELISA
: Enzyme Linked Immunosorbent Assay.
GALT
: Gut Associated lymphoid Tissue
Gx
: Grossissement.
: Peroxyde dhydrogne.
H2O2
Ig
: Immunoglobuline.
IgA
: Immunoglobuline de type A.
IgE
: Immunoglobuline de type E.
IgG
: Immunoglobuline de type G.
IgM
: Immunoglobuline de type M.
IL
: Interleukine.
INF-
: Interferon gamma.
IPLV
: Intolrance aux protines du lait de vache.
KDa
: kilodalton.
La
: Lactobacillus acidophilus.
Lb pl
: Lactobacillus plantarum.
LF1
: Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
LF2
: Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
LIE
: Lymphocytes intra-pithliaux.
LPS
: Lypopolysaccharide.
min
: minute.
MRS
: Man Regosa Scharpe.
NaOH
: hydroxyde de sodium.
NK
: Natural Killer (cellule tueuse).
O2
: Oxygne.
OPD
: Orthophnylne diamine.
PBS
: tampon phosphate salin.
pH
: potential doxygne.
PLV
: Protines du lait de vache.
PM
: poids molculaire.
SAB
: serum albumine bovine.
TGF-
: transforming growth factor.
Th
: cellule T helper.
Th 1
: Lymphocyte T helper 1.
Th 2
: Lymphocyte T helper 2.
TLR
: toll like receptor.
TNF- : tumor necrosis factor .
Trl
: cellule T rgulatrice.
Trs
: tours.

Abrviations

UFC
V

: Unit Formant Colonie.


: volume.

Liste des figures


Liste des figures

1. Schma simplifi dcrivant les compartiments de lappareil digestif de lhomme et leurs


microflores.................................................................................................................................... 4
2. Description schmatique gnrale du systme immunitaire associ la muqueuse
intestinale...................................................................................................................................... 9
3. Position des acides amins substitus dans les variants A et B de la -Lg .............................. 18
4. Proprits et critres de slection des probiotiques .................................................................. 29
5. Les principaux effets bnfiques attribus aux probiotiques.................................................... 32
6. Schma illustrant linteraction entre les composants bactriens (Lactobacillus grasseri)
et la cellule immunitaire. TLR, Toll-like receptor ....................................................................... 36
7. Diffrentes tapes de prparation des chantillons de lait de vache......................................... 43
8. Protocole de sensibilisation et de gavage des souris ................................................................ 48
9. Aspect macroscopique des colonies (A) et microsopique (B) de La, sur milieu MRS
acidifi, aprs coloration de Gram................................................................................................ 60
10. Aspect macroscopique des colonies (A) et microsopique (B) de La pl, sur milieu MRS,
aprs coloration de Gram.............................................................................................................. 60
11. Aspect macroscopique des colonies (A) et microscopique (B) de BB, sur milieu MRS
cystin, aprs coloration de Gram............................................................................................... 61
12. Aspect macroscopique des colonies (A) et microscopique (B) de BL, sur milieu MRS
cystin, aprs coloration de Gram............................................................................................... 61
13. Cnitique de production de lacide au cours de la fermentation du lait de vache 45C
(LF1, ; LF2, ; LS, ) ............................................................................................................. 64
14. Cintique de variations du pH au cours de la fermentation de lait de vache 45C
(LF1, ; LF2, ; LS, ) .............................................................................................................. 65
15. Teneur en protines totales (g/mg) dans les laits (LF1, ; LF2, ; LS, ) au cours de
la fermentation 45 C................................................................................................................. 67
16. Titres en anticorps IgG sriques anti--Lg mesurs chez les souris sensibilises la Lg (n=5) par voie sous cutane et chez les souris tmoins (n=5) sacrifies au 28me jour........... 69

Liste des figures


17. Titres en anticorps IgG sriques anti--Lg mesurs chez des souris sacrifies au 50me
jour et sensibilises la -Lg (n=5) par voie sous cutane compars celui des souris non
sensibilises (n=5) (tmoins ngatif)............................................................................................ 71
18. Comparaison des titres en anticorps IgG sriques anti--Lg mesurs chez des souris
gaves puis sensibilises la -Lg par voie sous cutane, sacrifies au 28me jour et au
50me jour ...................................................................................................................................... 72
19. Effet du gavage et de la sensibilisation la -Lg sur la hauteur des villosits des
fragments de jejunum des souris sacrifies au 28me jour compar aux souris non
sensibilise (n=5) (tmoin ngatif)............................................................................................... 75
20. Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris tmoin ........................................................................................................... 76
21. Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris gave avec une solution saline et immunise la -Lg et sacrifie au
28me jour ( tmoin positif) ........................................................................................................... 76
22. Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris gave au LF1 et immunise la -Lg puis sacrifie au 28me jour ............... 78
23. Observation microscopique(Gx10) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris gave au LF2 et immunise la -Lg puis sacrifie au 28me jour ............... 78
24. Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris tmoin ........................................................................................................... 79
25. Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris gave avec une solution saline et immunise la -Lg et sacrifie au
28me jour (tmoin positif) ............................................................................................................ 79
26. Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris gave au LF1 et immunise la -Lg puis sacrifie au 28me jour ............... 80
27. Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris gave au LF2 et immunise la -Lg puis sacrifie au 28me jour ............... 80
28. Effet du gavage et de la sensibilisation la -Lg sur la hauteur des villosits de
fragments de jejunum des souris sacrifies au 50me jour compar au souris non sensibiliss
(tmoin) ........................................................................................................................................ 83
29. Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris tmoin ........................................................................................................... 84
30. Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris tmoin positif, sacrifie au 50me jour.......................................................... 84
31. Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris gave au LF1 et immunise la -Lg puis sacrifie au 50me jour ............... 85

Liste des figures

32. Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris gave au LF2 et immunise la -Lg puis sacrifie au 50me jour ............... 85
33. Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris tmoin ........................................................................................................... 86
34. Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris tmoin positif, sacrifie au 50me jour........................................................... 86
35. Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris gave au LF1, immunise la -Lg puis sacrifie au 50me jour .................. 87
36. Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color lhmalunosine dune souris gave au LF2,immunise la -Lg puis sacrifie au 50me jour ................... 87
37. Evaluation de leffet de limmunisation la -Lg sur la hauteur des villosits de
fragments de jjunum entre les groupes sacrifis au 28me jour et les groupes sacrifis au
50me jour ..................................................................................................................................... 89

Liste des tableaux


Liste des tableaux
1. Les principaux facteurs influenant la composition et la fonction de la microflore
intestinale...................................................................................................................................... 6
2. Principaux effets des probiotiques sur la rponse immunitaire................................................ 31
3. Composition du milieu de culture MRS (Man Regosa Scharpe) ............................................. 39
4. Composition des solutions utilises pour le dosage des protines totales................................ 45
5. Composition du tampon phosphate salin PBS, 1 M, pH=7,4 .................................................. 51
6. Composition des solutions tampons dELISA ......................................................................... 51
7. Composition du colorant lhmatoxyline de Harris............................................................... 57
8. Rsultats des diffrents aspects macroscopiques et microscopiques des souches tudies ..... 62
9. Effet du gavage et de limmunisation sur la hauteur des villosits intestinales des souris
(J28) ............................................................................................................................................... 74
10. Effet du gavage et de limmunisation sur la hauteur des villosits intestinales des souris
(J50) ............................................................................................................................................... 82

Rsum
Les protines et leurs fragments allergniques (en particulier la -Lg du lait de vache)
peuvent provoquer par des ractions cellulaires complexes, la production danticorps
spcifiques de la classe des IgE et des IgG et la stimulation de lymphocytes cytotoxiques,
responsables de phnomnes dallergie et dhypersensibilit.
Lobjectif vis est dinduire une tolrance orale chez des animaux de laboratoire
(souris BALB/c) par une colonisation de lintestin par une bactrie probiotique suivie dun
gavage avec des laits ferments par lassociation de diffrentes bactries lactiques et
bifidobactries.
Deux laits ferments ont t prpars par des bactries, slectionnes pour leur forte
activit protolytique :
Un premier lait est ferment par lassociation de Lactobacillus acidophillus+
Bifidobacterium longum (LF1),
Un second lait est ferment par lassociation bactrienne Lactobacillus acidophillus+
Bifidobacterium bifidum (LF2). Les deux laits ferments sont mis incuber 45C
pendant 4 heures. Au temps t0, t30, t60, t90, t120,t150, t180, t210 et t240 de la fermentation,
des prises aliquotes sont effectues pour mesurer les paramtres suivants :
La quantit dacidit titrable produite, le pH et la quantit des protines totales.
La production danticorps (IgG) anti--Lg obtenus chez des souris sensibilises la Lg par voie sous cutane.
Evaluation de la hauteur des villosits et le nombre des lymphocytes intra- pithliaux.
Les rsultats obtenus ont t les suivants :
Le taux dacidit produite est significativement lev (p 0,001) dans les deux laits ferments,
(36 0,63D) pour LF1 et (34,8 0,37 D) pour LF2 compar au lait strile (18,4 0,24 D) ;
ceci se traduit par une baisse significative de pH, (5,32 0,09 ; 5,92 0,1) respectivement
pour le lait LF1 et LF2, par rapport au lait strile (6,62 0,06) (p 0,001). Le dosage des
protines totales montre que cest lassociation (La + BL) qui donne le meilleur profil
protolytique (215,89 5,68g/mg) (p0,001) par rapport au tmoin (301,86 3,19 g/mg)
et au lait LF2 (La + BB) (242,44 6,34g/mg) (p0,001).
Les titres en IgG sriques anti--Lg sont significativement diminus chez les souris gaves
au lait LF1 (1/280me), (1/640me) chez le groupe gav au lait LF2 par rapport au groupe tmoin
positif (1/64000me)(p 0,001).
Ltude histologique de la muqueuse intestinale montre que linduction de la tolrance orale
la -Lg est vidente chez les souris ayant subit une colonisation avec Lactobacillus
plantarum suivit dun gavage au lait LF1, ceci est prouv par des villosits intestinales
longues (54,01 1,1 m) avec un aspect fin et une infiltration des lymphocytes intrapithliaux peu marque.Le groupe tmoin positif prsente une atrophie partielle des villosits
avec un dcollement du chorion de lpithlium, des pseudostratifications et une infiltration
dense des lymphocytes intra-pithliaux ; tous ces paramtre sont significativement diffrents
par rapport aux autres groupes de ltude (p 0,001).
En conclusion, les rsultats prsents dans ce travail confirment que les probiotiques et plus
prcisment les bifidobactries jouent un rle crucial dans la prvention des allergies
alimentaires, via linduction de la tolrance orale.
Mots cls : Tolrance orale, lactoglobuline, Allergnicit, Probiotique, Bifidobactries,
Bactrie lactique, Lait de vache.

Abstract
Protein and their allergic fragments (specially the -Lg of cow milk are able to induct by
some complex cellular reaction, the production of IgE and IgG specific antibodies and
cytotoxic lymphocytes stimulation which are responsible of allergic phenomena and
hypersensitivity.
The aim of this work is to induce an oral tolerance in laboratory animals (BALB/c mice) by
colonizing the intestine by proteolytic bacteria followed by the mice gorging with milks
fermented by of the association of lactic bacteria and bifidobacteria.
Both two fermented milks by selected bacteria; for their strong proteolytic activity:
The first milk was fermented by Lactobacillus acidiphilus + Bifidobacterium longum
(LF1).
The second milk was fermented by Lactobacillus acidiphilus + Bifidobacterium
bifidum (LF2). Both fermented milks were incubated at 45C for 4 hours.
At the time t0, t30, t60, t90, t120, t150, t180, t210and t240 of fermentation, aliquot samples had been
taking of in order to measure the following parameters:
The quantity of acid production, the pH and the quantity of total proteins.
The production of anti-Lg antibodies obtained in sensitized mice by the -Lg by
cutanous way.
The estimation of the villosities and the high number of intra-epithelial lymphocytes.
The obtained results were as followed:
The acidity level is significantly increased (p 0,001) by both fermented milks, (36 0,63D)
for LF1 and (34,8 0,37 D) for LF2 compared to the germ-free milk(18,4 0,24 D); which
results in a significant decrease of the pH (5,32 0,09 ; 5,92 0,1) respectively for LF1 and
LF2 milks, compared to germ-free milk (6,62 0,06) (p 0,001). The dosage of total proteins
show that its the association of (La + BL) which gives the best proteolytic activity (215,89
5,68g/mg) (p 0,001) compared with the control(301,86 3,19 g/mg) and the LF2 milk
(La + BB) (242,44 6,34g/mg) (p0,001).
The concentration of anti--Lg sera IgG are significantly decreased in the gorged mice with
LF1 milk (1/280th), (1/640th) in the group gorged with LF2 milk compared with the positive
control group(1/64000th)(p 0,001).
The histological study of intestinal mucus showed that induction of oral tolerance with
-Lg is evident in the mice colonized by Lactobacillus plantarum followed by gorging with
LF1 milk which is proved the intestinal villosities length (54,01 1,1 m) with this aspect and
an infiltration of intraepithelial lymphocytes was less obvious. The positive control group
showed partial atrophy of the villosities and a detachment of the epithelium chorion,
pseudostratifications and dense infiltration by intra-epithelial lymphocytes; all these
parameters were significantly different comparing to the other studies groups (p 0,001).
In conclusion, the results presented in this work confirm that the probiotics and more
specially the bifidobacteria have a crucial role in the prevention of food allergies, by inducing
an oral tolerance.
Key words: Oral tolerance, -lactoglobuline, Allergenecity, Probiotic, Bifidobacteria, Lactic
bacteria, Cow milk.


) -Lg (
IgE IgG
.
) ( Balb/c
.
.
:
(LF1) Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum
:
(LF2) Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum
45 ) (4 : 0 30 60 90120
150 180 210 240 :
pH .
) ( IgG -Lg .
.LIE
:
) (p 0,001 ) (D 0,63 36
LF1 ) (D 0,37 34 LF2 )(D 0,24 18,4
0,095,32) pH (0,15,92 LF1 LF2
) (p 0,001) (0,066,62 ) (La+BL
) 5,68215,89 / ( ) (p 0,001 ) 3,19301,86 / ( LF2
) 6,34242,44) (La+BB/ ( ).( p 0,001
IgG -Lg LF1
) (1/640me) (1/280me LF2
) (p 0,001) (1/64000me -
Lg Lactobacillus plantarum LF1
) 1,145,01 ( .LIE
) (chorion
LIE
).(p 0,001

.
: .

Introduction
Lallergie alimentaire, dont la frquence est en constante augmentation (4,6%de la
population pdiatrique gnrale daprs Ranc et al.2005 ; Deschildre et al., 2006)
constitue un problme de sant publique. Lallergie au protine du lait de vache est classe
la premire allergie alimentaire chez le nourrisson et lallergne le plus incrimin est la lactoglobuline (protine de lactosrum bovin).
Les investigations rcentes ont mis en vidence le rle crucial que joue la
microflore intestinale dans le maintien et lamlioration de la sant. Certains de ces travaux
ont montr que les animaux conventionnels pourvus dune microflore intestinale complte
sont plus rsistants aux infections que les animaux axniques dpourvus de microflore
(Perdigon et al., 2001; Lima-Filho et al., 2004). En outre, certains travaux de recherche ont
suggr que la flore intestinale pourrait tre un facteur indispensable pour rtablir
l'quilibre entre les cellules immunitaires Th1 et Th2 qui jouent un rle pivot dans le
processus dimmunomodulation.
Rcemment, Asahara et al., 2004, ont dmontr que la consommation de produits
alimentaires enrichis en probiotiques produit plusieurs effets favorables sur lorganisme
tels que lamlioration des mcanismes de la rponse immunitaire, le rtablissement de
lquilibre microbien dans le colon, le traitement de certaines infections intestinales et urognitales, la rduction des risques dallergie, de cancer et dulcre.
Les microorganismes effets probiotique slectionns en alimentation humaine
sont reprsents essentiellement par les bactries lactiques, particulirement celles
appartenant au genre Lactobacillus et Bifidobacterium (Saito, 2004). Aujourdhui, ces
deux genres bactriens sont largement utiliss dans la fabrication de produits laitiers
ferments.
La tolrance orale est une rponse immunitaire menant un tat de faible rponse
immunologique vis--vis dun antigne ingr (Niggemann et al., 2006) . Trois
mcanismes principaux sont lorigine de la tolrance orale : la dltion clonale, lanergie
clonale et la suppression active. La suppression active se caractrise par linhibition de
lactivit des lymphocytes T, spcifiques ou non de lantigne, sous laction des cytokines
suppressives IL-10 et TGF-. Lanergie clonale se caractrise par larrt de la prolifration
des lymphocytes T spcifiques, alors que la dltion clonale correspond un tat de
destruction slective des lymphocytes T spcifiques. De nombreux facteurs influencent
linduction de la tolrance orale ; la dose et la frquence dadministration de lantigne,
lge de lhte et ltat de sa microflore intestinale sont des exemples.

Introduction
Le prsent travail a pour objectif principal dtudier linduction de la tolrance
orale chez des souris femelles conventionnelles de race BALB/c, in vivo, par une
colonisation de lintestin par Lactobacillus plantarum pendant 18 jours, suivie dun gavage
par deux laits ferments par des bifidobactries et des lactobacilles. Il vise lucider
certain mcanisme daction par lesquels les probiotiques stimulent le phnomne
immunitaire. Deux modes daction sont proposs :
Le premier mode daction est que les bactries probiotiques stimulent linduction
de la tolrance orale en dgradant la - lactoglobuline.
Le deuxime mode daction est que les bactries probiotiques stimulent linduction
de la tolrance orale en inhibant la prolifration lymphocytaire.

Rappels bibliographiques

1. Ecosystme gastro-intestinal :
1.1 Description gnrale :
Le tractus gastro-intestinal est un cosystme complexe et ouvert aux microorganismes
exognes. De par sa surface totale (muqueuse) estime 200-300 m2, il reprsente la plus
grande surface du corps en contact avec lenvironnement (Holzapfel et al., 1998).
Lcosystme gastro-intestinal est gnr par une alliance stable entre lpithlium gastrointestinal, le systme immunitaire et une importante flore microbienne. Si lun des trois
composants de lcosystme est dfaillant, lalliance est altre et par consquent diverses
pathologies sy installent (McCracken & Lorenz, 2001). De plus, le tractus gastro-intestinal
renferme entre 1013 et 1014 cellules microbiennes reprsentant 400 500 espces et sous
espces. Cette microflore reprsente environ 10 fois le nombre total de cellules du corps
humain (Bjrkstn, 2004).
Pour prserver lhomostasie, la muqueuse doit dvelopper des stratgies de dfense
afin dempcher les antignes intestinaux de pntrer dans le compartiment systmique. Cette
protection est assure par des mcanismes de dfenses non spcifiques, tels que des facteurs
physiques (pristaltisme), chimiques (mtabolites antimicrobiens, acidit stomacale) et par des
mcanismes de dfenses spcifiques avec, entre autres, la production danticorps scrtoires et
lactivation du systme immunitaire associ la muqueuse (Silbernagl & Despopoulos, 1992;
Salminen et al., 1998).
1.2. La microflore intestinale :
Du point de vue microbiologique, comme le montre la Figure 1, lenvironnement
gastro-intestinal comprend trois rgions principales qui offrent des conditions trs diffrentes
pour la survie des microorganismes. Dans le premier compartiment, lestomac, la prolifration
microbienne est fortement rduite par la prsence doxygne apport par la dglutition et une
forte acidit. De ce fait, lestomac hberge slectivement les microorganismes acidotolrants
et anarobies facultatifs comme les lactobacilles, les streptocoques et les levures. Dans le
deuxime compartiment qui est lintestin grle, la microflore est constitue essentiellement de
bactries anarobies facultatives tels que les lactobacilles, les streptocoques

Rappels bibliographiques

Figure1 : Schma simplifi dcrivant les compartiments de lappareil digestif de lhomme et


leurs microflores. Adapt et modifi par Ouwehand & Vesterlund (2003).

Rappels bibliographiques
les entrobactries et les bactries anarobies strictes notamment les bifidobactries, les
bactroides et les clostridies. Dans le dernier compartiment qui est le colon (dpourvu
doxygne), le transit digestif est plus lent et la flore microbienne est plus abondante,
reprsentant 35 50 % du volume du contenu du colon humain (Cummings et al., 1989;
Gounier-Chteau et al., 1994).
La charge microbienne dans les diffrents compartiments a t estime environ : 104,
103-4, 105-7, 107-8 et 1010-11 colonies formant unit (cfu/g) dans lestomac, le duodnum, le
jjunum, lilon et le colon respectivement (Ouwehand & Vesterlund, 2003; Isolauri et al.,
2004). Les bifidobactries et les lactobacilles, certains entrocoques, E. coli, streptocoques et
bactroides se distinguent par leurs effets bnfiques sur la sant de lhte, comme :
1. Lamlioration de la maturation et de lintgrit de lintestin.
2. Lantagonisme contre les pathognes.
3. La modulation de la fonction immunitaire (Gibson & Roberfroid, 1995; Schiffrin & Blum,
2002; Rastall, 2004).
1.3 Les facteurs majeurs influenant la microflore gastro-intestinale :
La composition et les fonctions de la microflore du tractus gastro-intestinal sont
influences par divers facteurs (Tableau 1) lis au changement des conditions physiologiques
de lhte (ge, tat de sant,...), de la composition du rgime alimentaire et des circonstances
environnementales (contamination par les pathognes, antibiothrapie, chimiothrapie, climat,
stress, hygine ...) (Mitsuoka, 1989; Hopkins et al., 2002). Selon Holzapfel et al. (1998), les
facteurs majeurs influenant la microflore gastro-intestinale sont cits dans le tableau 1, ils
peuvent perturber lquilibre de lcosystme intestinal en favorisant des espces particulires
par rapport dautres. Dans certains cas, ce dsquilibre peut tre trs favorable la
prolifration de microorganismes opportunistes pathognes pouvant compromettre la sant et
le bien-tre de lhte. Il serait donc impratif de rechercher des solutions alternatives
permettant la restauration de lquilibre de la microflore intestinale de lhte. Lutilisation de
probiotiques et/ou de prbiotiques (prparations microbiennes ou base de certaines
substances) sest avre une alternative prometteuse.
5

Rappels bibliographiques
Tableau 1. Les principaux facteurs influenant la composition et la fonction de la microflore
intestinale. Adapt par Holzapfel et al. (1998).

Facteurs mdis par lhte

Facteurs microbiens

- pH, secrtions (immunoglobulines, bile,

- Adhsion.

sels, enzyme).

- Mobilit.

- Mobilit (pristaltisme).

- Flexibilit nutritionnelle.

- Physiologie (variable selon les

- Spores, capsules, enzymes, composants

compartiments).

antimicrobiens.

- Cellules dtaches, mucines, exsudats de

- Temps de gnration.

tissus.
Interactions microbiennes
Synergie

Antagonisme/ stimulation

-Coopration mtabolique.

- Acides gras de courte chane, amines.

-Excrtion de vitamines et facteurs de

- Changement de Eh, pH et tension dO2.

croissance.

- Composants antimicrobiens.

-Changement de Eh (potenteil doxydo-

- Besoin nutritionnel.

rduction), pH et tention dO2.


Rgime alimentaire
Composition, fibres non digestibles, drogues, etc

Rappels bibliographiques
1.4. Les organes lymphodes :
Le systme lymphode est constitu de tissus et organes qui abritent les cellules
immunocomptentes. Il se prsente sous forme dorganes, ayant une architecture encapsule,
ou de tissu lymphode plus ou moins diffus. En effet, on distingue deux organes lymphodes ;
les organes lymphodes primaires (thymus, mlle osseuse) o les cellules T et B doivent
entreprendre une partie de leur maturation dans ces tissus avant de migrer vers les tissus
lymphodes secondaires pour accomplir leur maturation (rate, ganglions lymphatiques et
tissus lymphodes associs aux muqueuses). Les cellules qui mditent limmunit sont
reprsentes par les lymphocytes et les cellules accessoires tels que les macrophages, les
cellules prsentatrices dantignes et dans certains cas les cellules pithliales. Les
lymphocytes se trouvent dans le systme lymphode constitu dorganes primaires (thymus et
mlle osseuse) et secondaires (rate, ganglions lymphodes...). La rate produit une rponse
contre les antignes venant du sang, alors que les nodules lymphodes agissent contre les
antignes provenant de la lymphe. Les antignes sont principalement absorbs via la peau ou
les muqueuses. Le tissu lymphode associ la muqueuse (plaques de Peyer, tissu lymphode
urognital) rpond aux antignes franchissant la barrire mucosale (Erickson & Hubbard,
2000).
1.5. Le systme immunitaire de la muqueuse intestinale :
La muqueuse intestinale est le centre immunologique du corps ; elle hberge 80 % de
la population des leucocytes. Ces derniers sont indispensables pour lhomostasie du corps
avec limmense population bactrienne de lintestin. La drgulation de cette homostasie
entrane de nombreux dsordres, notamment les maladies de linflammation de lintestin
comme la colite ulcreuse et la maladie de Crohn (Schiffrin & Blum, 2002 ; Velazquez et al.,
2004).
En effet, le maintien de lintgrit de lintestin et de sa fonction digestive dpend en
partie de la capacit du systme immunitaire de sa muqueuse, faire la distinction entre les
antignes offensifs et inoffensifs et de produire une rponse approprie: une immunit active
ou une tolrance (Brandzaeg, 1996).
Le systme immunitaire de la muqueuse intestinale, linstar des autres muqueuses, est
dot de deux armes de dfense contre les antignes ou agents pathognes (Brandzaeg, 2002):

Rappels bibliographiques
a) lexclusion de lantigne laide danticorps scrtoires IgA et IgM en modulant ou en
inhibant la colonisation de lhte par les microorganismes et la pntration dantignes
solubles dangereux.
b) les mcanismes de suppression de la rponse immunitaire afin dviter une raction
locale ou priphrique excessive (hypersensibilit) contre des substances inoffensives
atteignant la surface de la muqueuse. La suppression de la rponse induite par des antignes
alimentaires via lintestin est dsigne sous le nom de tolrance orale.
Du point de vue anatomique, le systme lymphode de lintestin comprend les plaques de
Peyer ou les follicules isols, la Lamina propria enrichie en cellules plasmatiques (cellules
dendritiques...), les ganglions lymphatiques msentriques et les plaques cryptiques. Ces
compartiments constituent les sites dinduction et effecteurs de limmunit intestinale. La
figure 2, montre une description schmatique gnrale du systme immunitaire de lintestin.
Les voies dentre de lantigne au niveau intestinal sont: les cellules pithliales intestinales
(jonctions) via linteraction des cellules dendritiques de la Lamina propria, les cellules
pithliales et les cellules M (Spahn & Kucharzik, 2004).
Selon Monteleone et al. (2002), la distribution phnotypique des cellules T CD4 + et CD8 +
est similaire celle des lymphocytes du sang priphrique avec la prdominance des cellules
CD4

et TcR+. Les lymphocytes B sont trs abondants dans la muqueuse intestinale,

particulirement dans les follicules isols et les plaques de Peyer ; Ils mditent la premire
rponse immunitaire de type humorale protgeant lorganisme des microorganismes
pathognes entriques ou autres organismes infectieux. Une des proprits remarquables des
lymphocytes B est la maturation des cellules B productrices des IgM en cellules productrices
des IgA.
En outre, une hypothse rcente suggre que les lymphocytes B jouent un rle cl dans
la rgulation de lhomostasie immunitaire intestinale et la prvention des maladies de
linflammation de lintestin. Leur rle immunorgulateur consisterait activer les cellules
tueuses (NK) et favoriser la migration des cellules rgulatrices CD4+CD8+ au site effecteur.

Rappels bibliographiques

Figure 2 : Description schmatique gnrale du systme immunitaire associ la muqueuse


intestinale. Adapt par Spahn & Kucharzik (2004).

A, B et C : voies dentre de lantigne: (A), les cellules pithliales intestinales ; (B)


interaction des cellules dendritiques et cellules pithliales; (C) cellules M. Flches : sens de
drainage lymphatique des plaques de Peyer et de Lamina propria des villosits (vers les
nodules lymphatiques msentriques).

Rappels bibliographiques
Cependant, le rle des cellules NK et CD4+CD8+ dans la production de lIL-10 demeure moins
clair (Velazquez et al., 2004).
2. La tolrance orale :
2.1. Dfinition de la tolrance orale :
La rgulation de la rponse immunitaire intestinale joue un rle primordial dans la
pathogense puisque de nombreuses observations indiquent que celle-ci est perturbe dans le
diabte de type 1 (Akerblom et al., 2002). La tolrance orale est dpendante de lhomostasie
immunologique et dune maturation normale de lintestin. Ces deux lments sont influencs
par des facteurs de croissance et les cytokines du lait maternel, une colonisation par une flore
bactrienne physiologique, des infections et le rgime alimentaire (Wasmuth & Kolb, 2000).
Les infections rotavirus ou entrovirus ont une action nfaste sur la permabilit
intestinale et peuvent acclrer le dclanchement de lallergie en catalysant le dveloppement
dune auto-immunit lie aux cellules T (Serreze et al., 2000). Ainsi une augmentation de la
permabilit intestinale peut abolir la tolrance orale et induire une rponse immunitaire
exagre vis--vis dauto-antignes ou dantignes alimentaires pouvant prsenter des
ractions croises avec des constituants cellulaires (Vahasalo et al., 1996). Des concentrations
leves en anticorps IgG et IgA contre les protines du lait (albumine bovine, lactoglobuline) et lovalbumine sont observes chez des enfants adolescents souffrant de
diabte de type 1 par rapport des sujets sains (Kohno et al., 2002 ; Savilathi et al., 1993).
2.2. Mcanismes cellulaires de la tolrance orale :
Plusieurs mcanismes cellulaires semblent tre impliqus dans linduction et le
maintien de la tolrance orale. Initialement, il a t suggr quune dviation immunitaire des
cellules Th1 vers les cellules Th2 soit la base de la tolrance, mais des travaux rcents ont
dmontr que ces cellules ne sont pas les seules impliques (Shi et al., 1999). Les mcanismes
cellulaires impliqus sont lanergie clonale (Melamed & Friedman, 1993), la dltion clonale
(Chen et al., 1995) et limmunosuppression active (Lundin et al., 1999).

10

Rappels bibliographiques
2.2.1 La dltion clonale :
La dltion des lymphocytes spcifiques (apoptose aprs activation par lantigne,
avortement clonal) requerrait une forte exposition lantigne (Dessaint 2006). Ce mcanisme
est certainement lorigine du maintien de la tolrance au cours du temps (Bu et al., 2001).
Les mcanismes de la mort par apoptose sont encore mal connus, mais la dltion clonale
semble dpendre de la voie du Fas/FasL (Marth et al., 1999) en prsence de TGF- (Chen et
al., 2001a). Les cellules Th1 et Th2 sont susceptibles la mort par apoptose mdie par Fas,
mais les cellules Th1 sont plus sensibles (Zhang et al., 1997). Cette observation explique
pourquoi la rponse spcifique de type Th1 est plus facilement rprime suite
ladministration orale dovalbumine chez la souris (Sudo et al., 1997). Il semblerait galement
que la dltion en priphrie soit la mort des cellules ayant subi lanergie clonale.
2.2.2. Lanergie clonale :
Lanergie clonale est un tat de non rponse lymphocytaire caractris par une absence
de prolifration et une faible production dIL-2 (Schwartz, 1990). Deux mcanismes sont
proposs pour expliquer lanergie clonale : labsence de molcules de co-stimulation (B7.1 et
B7.2) la surface des cellules prsentatrices dantignes et la liaison de B7.2 au CTLA-4 qui
gnre un signal inhibiteur aux cellules T actives.
Au niveau mucosal, les cellules de lpithlium intestinal et les cellules dendritiques
sont les principales cellules prsentatrices dantignes. Les cellules de lpithlium prsentent
les antignes aux cellules TCD8+ et TCD4+ de la lamina propria, mais elles sont incapables de
les stimuler en raison de labsence de molcules de co-stimulation leur surface (Hershberg &
Mayer, 2000). Les cellules TCD8+ semblent avoir un rle important au niveau mucosal
puisque ladministration orale dun antigne induit une faible rponse IgA en priphrie mais
pas au niveau mucosal chez des souris TCD8+ (Grdic et al., 1998). Paralllement, les cellules
dendritiques jouent un rle central, car une augmentation de leur nombre dans lintestin et les
organes lymphodes amliore linduction de la tolrance (Viney et al., 1998). La majorit des
cellules dendritiques localises dans les muqueuses sont immatures cause de
lenvironnement riche en IL-10. Ceci signifie quelles ont la facult de capturer et prsenter
trs efficacement les antignes aux cellules TCD4+ naves, mais quelles sont incapables de les

11

Rappels bibliographiques
stimuler en raison de la faible expression des molcules B7.1 et B7.2 (Lipscomb & Masten,
2002).
En priphrie, les cellules dendritiques induisent lanergie clonale des cellules T
actives suite lengagement des molcules B7.2 au CTLA-4 (Perez et al., 1997). Les cellules
de lpithlium intestinal agissent en priphrie, par la formation de petites particules
(tolrosomes) prsentant des fragments antigniques via le CMHII, mais nexprimant pas les
molcules de co-stimulation (Karlsson et al., 1999).
Hormis leur phnotype immature et lengagement avec le CTLA-4, les cellules
dendritiques jouent un rle dans linduction de la tolrance orale grce leur facult de
scrter des cytokines immunosuppressives, impliques dans le troisime mcanisme de la
tolrance orale qui est limmunosuppression active (Bilsborough et al., 2003).
2.2.3. Limmunosuppression active :
Cette voie fait intervenir des cellules TCD4+ rgulatrices (Tr1 et Th3) spcifiques de
lantigne qui secrtent des cytokines suppressives comme le TGF- et lIL-10 (Weiner,
2001a & b; Zhang et al., 2001). Leffet de ces cytokines est non spcifique puisquelles
suppriment la prolifration lymphocytaire dans le microenvironnement proche des cellules
dendritiques ayant pris en charge lantigne (effet bystander), cest--dire au niveau des
plaques de Peyer et de la lamina propria (Strober et al., 1998). Les cellules rgulatrices
gnres au niveau mucosal peuvent migrer dans les organes lymphodes priphriques et
supprimer la rponse en inhibant la gnration de cellules T spcifiques effectrices
(MacDonald, 1982). Les mcanismes cellulaires gnrs par le TGF- et lIL-10 sont
diffrents.
Le TGF- (Transforming Growth Factor-), principalement secrt par les
lymphocytes Th3 (Weiner, 2001a & b), induit la commutation isotypique produisant des IgA
(Van Vlasselaer et al., 1992), supprime la prolifration des cellules Th1 et Th2 et stimule les
cellules Th3 (Takeuchi et al., 1998; Weiner 2001a & b). Les mcanismes impliqus sont
laltration de lexpression des molcules accessoires (CD40) sur les cellules prsentatrices
dantignes (Takeuchi et al., 1998), et une augmentation de lexpression du CTLA-4 sur les
lymphocytes T (Chen et Wahl, 2003). Les cellules productrices de TGF- sont
particulirement nombreuses au niveau du GALT, o lenvironnement cytokinique est de type

12

Rappels bibliographiques
Th2 (IL-4, IL-10), contrairement la rate o les cellules Th1 sont principalement stimules
(Everson et al., 1997). Ces cellules Th3 jouent un rle important dans linduction de la
tolrance orale, car un lien a rcemment t tabli entre le faible niveau de cellules Th3 dans la
lamina propria et le dveloppement des allergies chez les enfants (Prez-Machado et al.,
2003).
Dans le cas de lIL-10, principalement secrte par les lymphocytes Th2 et les cellules
T rgulatrices (Tr1) (Wakkach et al., 2000), elle est la principale cytokine immunosuppressive
qui inhibe lactivation et la prolifration des lymphocytes Th0, Th1 et Th2 (Wakkach et al.,
2000). Cette inhibition rsulte du blocage de la maturation des cellules dendritiques
(Steinbrink et al., 1997) et de linduction de lanergie locale, mais durable (Groux et al.,
1996).
Les lymphocytes T rgulateurs (Tr1) sont des cellules principalement localises au
niveau des muqueuses produisant de grandes quantits dIL-10, ayant une faible capacit de
prolifration (Roncarolo, 2001) et inhibant la rponse Th2 spcifique (Cottrez et al., 2000).
Rcemment, il a t dmontr que leur diffrenciation est induite par une sous
population de cellules dendritiques, hautement productrice dIL-10. Ces cellules dendritiques
sont capables dinduire la tolrance orale lovalbumine chez la souris en stimulant
spcifiquement les cellules Tr1 (Wakkach et al., 2003).
2.3. Interactions entre les diffrents mcanismes :
Bien que les mcanismes de la dltion, de lanergie et de limmunosuppression active
aient t prsents sparment, leur implication in vivo peut tre conjointe ou cooprative
(Pecquet et al., 1999; Jutel et al., 2003), en particulier grce au TGF-. En effet, hormis son
effet immunosuppresseur, le TGF- joue un rle important dans linduction de la mort par
apoptose (Chen et al., 2001a) et dans linduction de lanergie en stimulant lexpression du
CTLA-4 (Chen & Wahl, 2003). De plus, les cellules mourant par apoptose peuvent librer du
TGF- qui contribue au dveloppement de limmunosuppression active (Chen et al., 2001b).

13

Rappels bibliographiques
3. Allergies et intolrances alimentaires :
3.1. Les allergies alimentaires :
Lallergie alimentaire correspond des manifestations cliniques apparaissant aprs
lingestion dun allergne alimentaire (appel trophallergne) impliquant un mcanisme IgE
dpendant. La prvalence actuelle est de 4.7% (Ranc et al.,2005 ; Dutau & Ranc, 2006).
Dans 50% des cas, lallergie se manifeste avant lge de 1 an et dans 92% des cas avant lge
de 5 ans (Wood, 2003). Lallergie alimentaire comprend dautres types de mcanismes
immunologiques qui peuvent cependant tre impliqus. La classification tablie par Gell et
Coombs diffrencie 4 types de raction :
1. Lhypersensibilit de type I (immdiate, mdiation IgE).
2. Lhypersensibilit de type II (cytotoxique et cytolytique).
3. Lhypersensibilit de type III (semi-tardive, complexes immuns).
4. Lhypersensibilit de type IV (retarde, mdiation cellulaire).
Les ractions de type I sont largement les plus frquentes ; lhypersensibilit de type II
nintervient que de manire exceptionnelle dans les ractions immunitaires dclenches par les
aliments ; les ractions de type III peuvent thoriquement intervenir vis vis des aliments et
ont t principalement dcrites propos de lintolrance au lait de vache ; lhypersensibilit de
type IV, est probablement le mcanisme responsable des formes entropathiques dintolrance
aux protines de lait de vache.
L'allergie aux protines du lait de vache (APLV) correspond une hypersensibilit
immunologique aux protines du lait de vache. Il s'agit de la premire allergie alimentaire chez
le nourissons; elle a un dbut prcoce, souvent avant l'ge de 6 mois (Sigurs, 1992). Sa
frquence est en constante augmentation, soit 4.6% de la population pdiatrique gnrale selon
Ranc et al., 2005 ; Deschildre et al., 2006, elle constitue un problme de sant publique.
L'incidence de l'APLV dans la population gnrale varie de 0,3 7,5% selon les tudes
(Halker, 1993). Elle serait de 22,9 24% chez les enfants atopiques (McCann, 1995). La
prvalence dans la population gnrale est value chez lenfant ainsi que chez ladulte : elle
est stime 8,5% chez lenfant dge prscolaire (Ranc & Bidat., sans date). L'APLV Le
lait contient plus de trente protines, toutes potentiellement allergisantes (Hide, 1994). Les
casines et la -lactoglobuline sont le plus souvent en cause, mais toutes les protines peuvent
tre incrimines (Schrander, 1992).
14

Rappels bibliographiques
Toutefois, lallergie au lait est une maladie infantile transitoire, car les symptmes
dallergies disparaissent avant lge de trois ans dans 80% des cas (Ranc & Bidat, 2000).
Evalue jusqu maintenant de faon trs incertaine entre 1,9 % et 7,5 %, lincidence des
allergies et/ou intolrances aux protines du lait de vache (APLV/IPLV) lge de deux ans et
demi a t estime 1,1 % par Eggesbo et al. (2001).
3.2. Lintolrance alimentaire :
Une rponse inapproprie vis--vis des protines alimentaires, due une rupture de
l'quilibre des mcanismes immunomodulateurs et immunosuppresseurs, est l'origine
d'immunopathologies telles que lhypersensibilit alimentaire, les pathologies inflammatoires
intestinales inflammatory bowel disease et les maladies auto-immunes (Mowat & Viney,
1997; Strobel, 2002). Lintolrance alimentaire nimplique pas une raction immunoallergique
et ne met pas le pronostic vital du patient en jeu (Hermans, 2005). Elle touche 2.5% des
nourrissons avant 2 ans. Les intolrances non IgE-dpendantes (40% des cas) disparaissent
dans les trois premires annes de vie alors que les allergies IgE-dpendantes sont plus
frquentes (60% des cas) ; leur gurison est obtenue dans 80 85% des cas lge de 3-4 ans
(Host & Halken, 1990 ; Juchet et al., 2003).
L'intolrance peut tre induite par une concentration et une prsentation inapproprie
des antignes alimentaires lorsque la permabilit de l'intestin grle est augmente. La
permabilit intestinale varie constamment au cours de la vie d'un individu ; elle peut tre
accrue sous l'effet d'une rponse immunitaire exagre due l'activation massive de
populations de cellules immunocomptentes par des concentrations excessives en antignes et
une surproduction d'interleukines et de cytokines.
3.2.1. Mcanismes impliqus :
A ct de l'agression directe des entrocytes par une infection invasive de la muqueuse
intestinale ou la libration de toxines, les infections gastro-intestinales agissent comme
adjuvant et induisent une rponse immunitaire (priming) l'encontre d'un antigne protique
soluble auparavant tolr (Nagler-Anderson & Shi, 2001). D'autre part la rponse immunitaire
entrane une raction inflammatoire avec libration de cytokines qui ont un effet dltre sur la
muqueuse intestinale.
15

Rappels bibliographiques
En effet, l'interfron (IFN-) et le tumor necrosis factor- (TNF-) prsents en
concentrations leves en rponse un stimulus inflammatoire, perturbent la permabilit
intestinale en augmentant l'absorption paracellulaire des antignes par altration de la
permabilit des tight junctions et leur transcytose travers la barrire intestinale (Heyman
& Desjeux, 2000). Par exemple, au cours d'une infection Helicobacter pylori la
concentration d'antignes mise en contact avec le systme immunitaire intestinal est nettement
augmente par inhibition de la dgradation lysosomiale des protines par les entrocytes. La
tolrance alimentaire est de ce fait abolie par une prsentation inapproprie (p. ex.
macromolcules incompltement digres) et une concentration excessive d'antignes
alimentaires.
Un autre effet secondaire d'un taux lev de TNF est une mort cellulaire programme
(apoptose) et le dtachement des entrocytes avec comme consquence une atrophie des
villosits intestinales. Cet effet a pu tre dmontr chez la souris et serait d l'induction de
caspases (Piguet et al., 1999). Les caspases constituent un groupe de mdiateurs de l'apoptose
et sont des protases spcifiques de l'asparate. La caspase-3 constitue le mdiateur cl de
l'apoptose des cellules de mammifres.
Dans le cas de l'intolrance alimentaire, il s'agit d'une stimulation continue du systme
immunitaire et la raction inflammatoire est soutenue par l'ingestion rpte et continue des
aliments risque.
Cette chronicit conduit des lsions et des inflammations chroniques dans certains
tissus et l'apparition de maladies inflammatoires, auto-immunes ainsi qu des phnomnes
d'allergie et d'hypersensibilit.
Parmi les protines les plus allergisantes on site la -lactoglobuline bovine.
3.3. La -lactoglobuline bovine (-Lg) :
La -Lg bovine est la plus abondante des protines du lactosrum; elle reprsente
environ 50% des protines totales du lactosrum et fait partie des protines les plus
allergisantes du lait de vache. Il sagit dune protine globulaire de structure compacte,
compose de 162 rsidus dacides amins et dont la masse molculaire relative est de 18,36
kDa (Massol, 1998 ; Amiot, 2002).
Plusieurs variants gntiques ont t mis en vidence (9 au total). Cependant, les plus
couramment prsents dans le lait de vache sont les variants A et B, (Hambling et al., 1992).

16

Rappels bibliographiques
Ces variants diffrent par la substitution de deux rsidus dacides amins; Gly64 et Ala118
dans le variant B sont remplacs par Asp64 et Val118 dans le variant A (Wal, 2001 ; Amiot,
2002). La -Lg renferme deux ponts disulfures (S-S) aux positions 66-160 et 106-121 ou 106119 (Papiz et al., 1986; Monaco et al., 1987), et un groupement thiol libre en position 121 ou
119 (McKenzie et al., 1972; Kinsella, 1988). La position du groupement thiol varie en
fonction des ractions dchange SH/S-S, lesquelles sont influences par le pH et la
temprature du milieu.
La structure secondaire de la -Lg est compose denviron 15% dhlice , 51% de
feuillet , 17% de courbures et 17% de structure dsordonne (Creamer et al., 1983; Casal
et al., 1988). La quantit importante de feuillets serait responsable des interactions entre les
monomres, pouvant mener jusqu lagrgation et la glification de la protine (Sawyer &
Kontopidis, 2000).
La structure tertiaire de la -Lg semble stable, mme des tempratures allant jusqu
75-80C (Edwards et al., 2002). Sa structure se compose principalement de feuillets qui
dlimitent une cavit hydrophobe. Cette structure, dite en tonneau-, est commune la famille
de protines nomme lipocaline (Sawyer & Kontopidis, 2000). La plupart des membres de
cette famille sont des transporteurs de petits ligands hydrophobes. La molcule de -Lg
comprend 9 feuillets antiparallles situs aux positions 15-24 (brin A), 35-44 (brin B), 49-56
(brin C), 65-74 (brin D), 82-85 (brin E), 91-97 (brin F), 102-111 (brin G), 116-124 (brin H) et
145-150 (brin I). Lhlice- est localise en position 131-140, alors que les courbures se
situent aux positions 28-31, 45- 48, 61-64, 98-101, 112-113 et probablement 74-82 et 125-130.
En solution, les brins les plus hydrophobes (A, E, F, G et H) seraient cachs
lintrieur de la molcule. Le feuillet form par les brins G-H serait le plus stable en raison de
la prsence dun pont disulfure et de certaines interactions hydrophobes spcifiques. La rgion
hydrophobe de lhlice- principale est adjacente ce feuillet, alors que sa rgion hydrophile
est expose au solvant ce qui contribuerait la stabilit de la structure de la protine en
solution.

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Rappels bibliographiques

Figure 3 : Position des acides amins substitus dans les variants A et B de la -Lg
(Botelho et al., 2000).

18

Rappels bibliographiques
Le feuillet -I est impliqu dans des interactions intermolculaires, notamment lors de
la dimrisation de la protine (Sakai et al., 2000; Sakurai et al., 2001).
Les structures tertiaires des variants gntiques A et B de la -Lg sont semblables
(Figure 3). En fait, les substitutions des rsidus Gly64 et Ala118 dans le variant B par Asp64
et Val118 dans le variant A se trouvent respectivement sur une boucle extrieure mobile (CD)
et dans la cavit hydrophobe de la molcule (Qin et al., 1999; Sawyer & Kontopidis, 2000).
Cette structure tertiaire lui confre une bonne rsistance lhydrolyse acide et la pepsine
gastrique (Reddy et al., 1988 ; Asselin et al., 1989). La -Lg est alors adsorbe au niveau de
lintestin ltat natif ou lgrement hydrolyse, ce qui explique, en partie, sa forte
allergnicit (Schmidt et al., 1995).
3.4. Stratgies de prvention des allergies aux protines du lait de vache :
3.4.1. Allaitement maternel et rgime dviction des protines du lait de vache :
Lallaitement prolong au-del de six mois est la meilleure stratgie pour prvenir les
allergies au lait de vache chez le nouveau-n (Saarinen & Kajosaari, 1995). En effet, les
enfants ne dveloppent pas dallergies vis--vis du lait maternel. De plus, durant la priode
dallaitement, le systme immunitaire du nouveau-n se dveloppe et la permabilit
intestinale diminue, ce qui lui permet de tolrer les protines allergniques un ge plus
avanc (Morein et al., 2002).Rcemment, Kull et al., 2005 ont prouv que lallaitement
maternel prvient le dveloppement dune dermatite atopique. Toutefois, des traces de
protines bovines dans le lait maternel peuvent induire une sensibilisation (Restani et al.,
1999; Jrvinen et al., 1999). Si une allergie via le lait maternelle est prouve, il faut modifier
le rgime de la mre ou proposer au nourrisson un lait de rgime (Zeiger, 2003 ; Kramer,
2003). Pour une prvention efficace il faut commencer par un rgime dviction strict. Le
patient et sa famille devront viter, non seulement laliment visible , mais aussi lallergne
rencontr dans des aliments prpars industriellement (Eigenmann & Ranc, 2003).

19

Rappels bibliographiques
Quand le lait maternel nest pas possible, ce dernier peut tre remplac par des formules
infantiles base de lait de vache, mais certains enfants y sont allergiques (Exl, 2001). Dans ce
cas, la mthode la plus efficace pour prvenir les symptmes dallergies est lviction totale de
toutes sources de protines laitires, mais cette approche peut engendrer des retards de croissance
(Isolauri et al., 1998).Le rgime dviction doit saccompagner dautres mesures de prvention,
comme la mise en place dune trousse durgence, la discussion dun projet daccueil individualis
en milieu scolaire et prscolaire ainsi que des mesures dducation (Ranc & Bidat, 2006). Il est
important de limiter le rgime afin dviter la cration de nophobie alimentaire (Rigal et al.,
2005). Lutilisation de formules infantiles hypoallergniques est alors une alternative
intressante. Pour produire ces formules, les pitopes allergniques doivent tre dtruits ou
modifis. Les mthodes traditionnelles sont le traitement thermique et lhydrolyse enzymatique,
mais cette dernire est la plus utilise et la plus efficace (Besler et al., 2001).
3.4.2. Hydrolyse des allergnes par des enzymes digestives :
Lhydrolyse enzymatique consiste couper les protines en plusieurs fragments de
faibles poids molculaires. Ces coupures dtruisent la structure tertiaire des protines et
dissocient les pitopes conformationnels et linaires. Lhydrolyse de la -Lg par la
chymotrypsine, seule ou associe la trypsine, et lhydrolyse par la pepsine suivie de la
chymotrypsine, diminuent de faon significative lallergnicit de la -Lg mais sans la rduire
totalement (Asselin et al., 1988 et 1989). Un traitement thermique de la -Lg avant lhydrolyse
enzymatique amliore la rduction de lallergnicit (Bonomi et al., 2003). Toutefois, bien que
lhydrolyse dstabilise certains pitopes allergniques, il a t dmontr que les IgE de certains
patients allergiques se fixaient plus efficacement la -Lg hydrolyse qu la -Lg native
(Haddad et al., 1979). Ceci suggre que lhydrolyse enzymatique dissocie les pitopes
conformationnels et dmasque des pitopes initiallement enfouis dans la cavit hydrophobe.
Cependant, il a t observ que plus le degr dhydrolyse des protines est lev, plus
lallergnicit rsiduelle est faible (Oldaeus et al., 1999; Giampietro et al., 2001; Fritsch, 2003).
Base sur cette observation, de nombreuses formules hypoallergniques base de protines
laitires hydrolyses ont t dveloppes. Diffrents degrs dhydrolyse gnrent des formules
plus ou moins hypoallergniques (Lombardo et al., 1998; Moneret-Vautrin et al., 2001;
Giampietro et al., 2001).

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Rappels bibliographiques
Ds leur plus jeune ge, les enfants sont classs dans trois catgories suivant leur aptitude
dvelopper des allergies aux protines du lait de vache. Ces trois catgories sont : les enfants
sains, les enfants classs risque (enfants ayant des antcdents familiaux allergiques) et les
enfants sensibiliss. Diffrentes formules infantiles sont administres ces enfants. Pour prvenir
les allergies chez les enfants sensibiliss, des formules fortement hydrolyses ou base dacides
amins libres sont prescrites. Les formules fortement hydrolyses contiennent 85% de peptides
ayant un poids molculaire infrieur 1500 Da (Ranc & Bidat, 2000). De nombreuses tudes
cliniques dmontrent que ces formules sont tolres par plus de 90% des patients allergiques,
alors que les formules partiellement hydrolyses sont tolres par moins de 55% dentre eux
(Besler et al., 2001). Cependant, quelques ractions svres, type choc anaphylactique, ont aussi
t rapportes avec ces formules (Besler et al., 2001), alors que les formules base dacides
amins libres ninduisent aucune raction de ce type (Isolauri et al., 1995). Les formules
partiellement hydrolyses, sont recommandes aux enfants classs risque dallergie aux
protines du lait de vache (Exl, 2001). Dans ces formules, les peptides ont des poids molculaires
suprieurs 8 kDa (Lombardo et al., 1998). Bien que lutilisation de ces formules soit encore
controverse, la dernire tude clinique rapporte un effet protecteur de celles-ci dans la
prvention des allergies chez les enfants risque (Von Berg et al., 2003).
Les principales enzymes, utilises lchelle commerciale pour produire les formules
hypoallergniques, sont la trypsine et la chymotrypsine dorgine porcine (Fritsch, 2003). Ces
deux enzymes sont synthtises par les cellules acineuses du pancras et secrtes dans le
duodnum; la trypsine tant deux fois plus abondante que la chymotrypsine (Goldberg et al.,
1973). Elles ont un poids molculaire similaire, avoisinant 24 kDa. La trypsine hydrolyse les
liens peptidiques du cot C-terminal au niveau de la lysine (Lys) et de larginine (Arg) ; la
chymotrypsine hydrolyse principalement les liens peptidiques du cot C-terminal des acides
amins aromatiques phnylalanine (Phe), tyrosine (Tyr) et tryptophane (Trp) avec parfois des
coupures aprs la mthionine (Met) et la leucine (Leu). Lanalyse de la structure primaire de la Lg rvle 52 sites de coupures thoriques pour ces deux enzymes, mais seulement 30 peptides ont
t dtects exprimentalement (Groleau et al., 2003).
Des enzymes dorigine bactrienne et fongique sont de plus en plus utilises pour la
production de formules infantiles (Fritsch, 2003). Dans ce contexte, les enzymes bactriennes
sont utilises ltat purifi. Cependant, lactivit protolytique des bactries lactiques au cours

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Rappels bibliographiques
des procds de fermentation est une autre voie importante pour la dgradation des protines du
lait de vache.
3.4.3. Hydrolyse des allergnes par des enzymes bactriennes :
Au cours des procds de fermentation, les protines laitires sont hydrolyses par les
enzymes des bactries lactiques. Le systme protolytique des bactries lactiques se compose de
protases membranaires, qui hydrolysent les protines du milieu environnant et librent des
peptides et des peptidases intra-cytoplasmiques qui dgradent les peptides. Les peptidases
peuvent tre des endopeptidases (site de coupure intra-chane) ou des exopeptidases (site de
coupure en extrmit de chane). On distingue les carboxypeptidases, les aminopeptidases qui
coupent du cot C- et N-terminal, respectivement. Ces enzymes peuvent librer un, deux ou trois
acides amins do lappellation de di- ou tri-peptidyl carboxypeptidases ou aminopeptidases
(Kunji et al., 1996). La majorit des peptidases sont intracellulaires, mais une certaine activit
aminopeptidasique a t mesure lextrieur des cellules (Shihata & Sha, 2000).
Lactivit protolytique des lactobacilles est de plus en plus tudie pour son importance
dans la fabrication fromagre et le dveloppement darmes (Bintsis et al., 2003). Le contenu
intracellulaire en peptidases est spcifique de chaque souche bactrienne (Kunji et al., 1996).
Cependant, plusieurs souches de L. paracasei ssp. paracasei montrent le mme profil dactivit
protolytique

(Bintsis

aminopeptidasique

et

sont

al.,
faibles

2003);
et

leurs

activits

infrieures

aux

endopeptidasique
activits

et

dipeptidyl

carboxypeptidasique,

aminopeptidasique et dipeptidasique (Bintsis et al., 2003 ; Chekroun et al., 2006).


Lactivit protolytique des bifidobactries a t peu tudie. Toutefois, elle semble assez
faible et infrieure celle observe avec les lactobacilles (Shihata & Sha, 2000). Leur
caractristique gnrale est une activit aminopeptidasique, bien que des activits dipeptidasique,
tripeptidasique et carboxypeptidasique aient t observes (El-Soda et al., 1992).
De nombreuses tudes mentionnent un effet anti-allergique des produits laitiers ferments,
mais peu dauteurs prcisent si cet effet est reli lhydrolyse des pitopes allergniques des
protines du lait, ou une modulation de la rponse immune par les bactries lactiques lorigine
de la fermentation (Cross et al., 2001). De nombreux cas dallergies ont t rapports suite
lingestion de diffrents fromages faits partir de lait de vache, de chvre ou de brebis
(Umpierrez et al., 1999 ; Besler et al., 2001), mais aucune tude na t ralise sur la

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Rappels bibliographiques
modification de lallergnicit des protines laitires au cours de la fabrication fromagre. Par
contre, (Jedrychowski & Wrblewska, 1999 ; Chekroun, 2005) ont rapport que la fermentation
du lait de vache par des bactries lactiques msophiles et thermophiles induit une diminution
significative de lantignicit de l-lactalbumine et de la -lactoglobuline, alors quelle naffecte
pas lallergenicit mesure par des tests sous cutans. La diminution de lallergnicit par
lhydrolyse bactrienne a galement t ralise de faon indirecte, en mesurant la production
dIL-4, in vitro, en prsence dhydrolysat. Ainsi, Stas et al. (1996) ont rapport une suppression
de la synthse dIL-4 par les cellules mononucles du sang, en prsence de casine hydrolyse
par les enzymes intracytoplasmiques de Lactobacillus rhamnosus GG.
La diminution de lallergnicit des protines du lait par lhydrolyse enzymatique
constitue une stratgie intressante pour la prvention des allergies aux protines du lait de vache.
Cependant, lapparition des symptmes dallergie dpend de nombreux autres facteurs dont la
prdisposition gntique, des facteurs environnementaux (tabac, animaux domestiques etc.) et le
systme immunitaire des individus. Il est maintenant admis que les allergies alimentaires
apparassent quand la tolrance orale nest pas induite ou maintenue dans le temps. Ainsi, en
stimulant linduction de la tolrance orale, on peut prvenir le dveloppement des allergies.
4. Les laits ferments :
Les produits laitiers ferments sont les meilleurs vhicules alimentaires pour la
consommation de probiotiques (formules infantiles, yaourts). Le Japon est le leader mondial
pour la diversit des produits probiotiques, avec plus de 50 varits (Gomez & Malcata, 1999).
Les caractristiques idales des souches probiotiques pour lalimentation humaine sont : une
origine humaine, une bonne rsistance aux conditions acides et au milieu intestinal, une bonne
adhrence la muqueuse intestinale, une non toxicit, de bonnes proprits technologiques et des
effets bnfiques sur la sant (Ouwehand et al., 1999; Ishibashi & Yamazaki, 2001). Toutefois,
certains de ces critres sont maintenant remis en question, comme les proprits dadhrence
(Apostolou et al., 2001b; Melmed et al., 2003).
Les proprits des laits ferments sont dtermines par la composition chimique du
produit alimentaire (source de carbone, degr de lhydrolyse des protines et des matires grasses
du lait et accessibilit des acides amins essentiels et des acides gras), et les caractristiques des
espces microbiennes prsentes dans le produit (Jelen & Lutz, 1998 ; Thibault et al., 2004 ;

23

Rappels bibliographiques
Chekroun, 2005). Linteraction entre le produit et les espces probiotiques est plus importante si
les cultures probiotiques participent la fermentation (Heller, 2001).
4.1. Les bactries lactiques :
Les

bactries

lactiques

sont

des

cellules

procaryotes,

htrotrophes

et

chimioorganotrophes. Elles ont une coloration de gram, gnralement immobiles, asporules et


ont des exigences nutritionnelles complexes pour les acides amins, les peptides, les vitamines,
les sels minraux, les acides gras et les glucides fermentescibles (Dellaglio et al., 1994). Il est
possible de les classer suivant la nature des produits du mtabolisme bactrien obtenus partir
des glucides. En effet les bactries homolactiques strictes produisent uniquement de lacide
lactique, alors que les bactries htrolactiques peuvent produire de lacide actique, de lthanol
et du CO2 en plus de lacide lactique. Onze genres bactriens figurent dans la catgorie des
bactries lactiques : Aerococcus, Alloicoccus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus et Vagococcus. Les
bactries du genre Bifidobacterium ne sont pas considres comme des bactries lactiques
typiques, mais leur usage se rpand en industrie laitire.
Les bactries lactiques sont utilises pour la fermentation dun grand nombre de produits
dorigine animale ou vgtale. Seuls les cinq genres Bifidobacterium, Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc et Streptococcus sont les ferments les plus utiliss des industries
laitires et surtout dans la fermentation lactique des produits laitiers en Amrique du Nord
(Champagne, 1998). Le rle principal des bactries lactiques est la production dacide lactique
qui influence la texture, le got et la qualit microbiologique du fromage. Labaissement du pH
limite aussi la croissance des bactries indsirables (Gilliland, 1985a). Enfin, la production
dacide lactique intervient galement sur le got des produits ferments, soit directement dans les
produits frais, soit indirectement en agissant sur les activits enzymatiques pendant laffinage.
Les bactries lactiques tolrent de petites quantits doxygne, mais de trop grandes
teneurs peuvent leur tre nfastes. Ceci peut probablement tre reli au peroxyde dhydrogne
(H2O2) qui est produit dans les cellules en prsence dair. Le H2O2 doit tre limin sinon son
accumulation devient toxique. Le systme le plus efficace dlimination du H2O2 est une enzyme
nomme catalase dont les bactries lactiques sont dficientes. Les bactries lactiques possdent
plutt une peroxydase, moins efficace que la catalase. Ainsi, comme les bactries lactiques

24

Rappels bibliographiques
nliminent pas facilement le peroxyde, elles sont considres comme micro-arophiles. Les
bactries lactiques aromatisantes comme Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis
produisent des composs aromatisants qui contribuent au got des produits frais et la
production de CO2 responsable douvertures dans le fromage. Enfin, certaines bactries lactiques
produisent des exopolysaccharides qui influencent laspect et la texture des produits ferments,
ainsi que du peroxyde dhydrogne et des bactriocines inhibant la croissance de bactries
indsirables.
4.2. Les ferments effet probiotiques :
Bien que le premier lait ferment par des bifidobactries ait t mis sur le march il y a
prs de 50 ans, le domaine des aliments probiotiques ne sest dvelopp que dans les annes 1970
(Tamime et al., 1995). En 1997, plus de 70 produits laitiers industriels tels que des laits
ferments, du fromage blanc, du babeurre et des desserts surgels contenaient des bactries
probiotiques, dont plus de la moiti au Japon (Shah, 1997). Aujourdhui, les marques LC1
(Nestl), Vifit (Campina Melkunie), Actimel (Danone) et Yakult ont merg comme des chefs de
fil dans les yaourts et laits ferments probiotiques (Stanton et al., 2001). Par ailleurs, les laits
ferments AB milk et Cultura contenant L. acidophilus et B. bifidum sont trs populaires au
Danemark (Tamime et al., 1995). Dautres produits comme les yaourts acidophilus-bifidus
contenant L. acidophilus et B. bifidum, ou B. longum et les ferments du yaourt ( L. bulgaricus et
S. thermophillus), les laits Bifidus (B. bifidum ou B. longum), Biogarde (L. acidophilus, B.
bifidum et S. thermophilus), Biomild (L. acidophilus et Bifidobacterium spp.) en Allemagne et
les laits Diphilus (L. acidophilus et B. bifidum) et Ophilus (L. acidophilus, B. bifidum, et S.
thermophilus, ou L. acidophilus, B. bifidum, et L. cremoris) en France ne sont que quelques
exemples de lutilisation varie des bifidobactries comme bactries probiotiques dans des
ferments mixtes en combinaison avec L. acidophilus ou les ferments du yaourt (L. bulgaricus et
S. thermophilus) (Tamime et al., 1995). Les bifidobactries peuvent tre utilises seules mais sont
souvent associes des bactries lactiques pour des raisons organoleptiques et technologiques
(Saloff-Coste, 1997). De plus, la prsence de bactries protolytiques, en particulier L.
bulgaricus, favorise la croissance des bifidobactries.
Cependant, pour la production du ferment mixte probiotique, les bifidobactries ne
peuvent pas tre propages conjointement aux bactries lactiques en raison de leur faible

25

Rappels bibliographiques
comptitivit en culture mixte. Ainsi, pour assurer une quantit de bactries probiotiques
suffisante dans les produits ferments, les ferments effet probiotiques commerciaux consistent
en des cultures pures de bifidobactries mlanges aux cultures lactiques au moment de la
fabrication du produit ou encore directement ajoutes au produit ferment la concentration
finale recherche. Cette limite conomique et matrielle justifie le dveloppement dune nouvelle
technologie de production de culture mixte contenant des souches plus ou moins comptitives.
4.2.1. Les bactries probiotiques :
En fermentant dans le gros intestin, les fibres alimentaires favorisent la croissance des
bactries et produisent ainsi de la biomasse. Certaines de ces bactries ont des effets
physiologiques et cliniques bnfiques la sant du consommateur : ce sont les probiotiques, du
grec pro : en faveur de et bios : vie . Les probiotiques sont donc des microorganismes
vivants qui exercent un effet bnfique sur lhte en amliorant son cosystme intestinal. Ces
bactries agissent en empchant le dveloppement de bactries pathognes, en rquilibrant la
flore aprs une antibiothrapie, en produisant des vitamines et en augmentant les dfenses
immunitaires de lhte.
Les souches ou espces probiotiques sont des composants normaux de la flore intestinale
(Dunne et al., 2001). En alimentation humaine, les genres microbiens les plus utiliss comme
probiotiques sont Lactobacillus, Bifidobacterium et Streptococcus (Berg, 1998). Par contre, en
alimentation animale de nombreux genres bactriens et fongiques sont utiliss, comme
Lactobacillus,

Bifidobacterium,

Bacillus,

Streptococcus,

Pediococcus,

Enterococcus,

Propionibacterium, Saccharomyces, Aspergillus et Torulopsis (Tannock, 1997).


Actuellement, les mcanismes par lesquels ces bactries peuvent avoir ces effets sont mal
compris mais des recherches sont en cours sur les relations existants entre ces organismes et la
physiologie intestinale. Il existe deux manires daugmenter le taux de ces bactries probiotiques
dans le tube digestif :
soit en les introduisant directement dans lalimentation, mais il semble que ce moyen est
peu efficace car la plupart des bactries ne survivent pas au cours de leur passage dans
lestomac et lintestin grle,

26

Rappels bibliographiques
soit en favorisant leur dveloppement dans le clon en apportant les substrats ncessaires
leur mtabolisme. Certaines fibres alimentaires, telles que les fructo-oligosaccharides,
quon trouve dans les artichauts et les oignons, augmentent la prolifration de ces
bactries probiotiques ; on appelle ces glucides : des aliments prbiotiques. Une tude
rcente de Bartosch et al. (2005) ralise sur un groupe de volontaires gs (> 62 ans)
dont le contenu intestinal en bifidobactries est fortement rduit par lge, a dmontr que
lingestion dun symbiotique base de Bifidobacterium bifidum BB-02 et
Bifidobacterium lactis BL-01 (probiotiques) et de linuline (prbiotique) a augment
significativement la taille et la diversit des populations de bifidobactries dans les
matires fcales par rapport au groupe contrle et groupe placebo.
4.2.1.1. Les bifidobactries :
Les bifidobactries ont t dcouvertes dans les fces d'enfants par Henri Tissier en
1900. Leur premier nom fut Bacillus bifidus communis (Tissier, 1900). Les bifidobactries sont
des btonnets Gram positif aux formes varies, non mobiles, non sporulants et en gnral
anarobes strictes qui composent la presque totalit (85 99%) de la flore intestinale dun enfant.
Ces bactries jouent un rle majeur dans lquilibre et la stabilit de la flore intestinale, do
lappellation de culture probiotique (Hekmat & McMahon, 1992). Une diminution des
bifidobactries au profit des clostridies, des lactobacilles, des streptocoques et des
entrobactries est cependant observe tout au long de la vie. De plus, les espces et les
biovarits typiques de ladulte remplacent celles de lenfant. Ces modifications seraient en
partie imputables lvolution du rgime alimentaire (Gournier-Chteau et al., 1994).
Parmi les 32 espces de bifidobactries rpertories, 10 sont considres comme tant
dorigine humaine, alors que les autres sont isoles dans les matires fcales danimaux divers
(Curk et al., 1994). B. longum, B. bifidum, B. infantis et B. breve ont t les plus tudies cause
de leur aptitude fermenter le lait ou tre incorpores dans les aliments (Modler et al., 1990;
Hekmat & McMahon, 1992; Blanchette et al., 1996; Shah, 1997; Gobetti et al., 1998; Rosenthal
& Bernstein, 1998; Stanton et al., 1998 ;Chekroun, 2006). Les conditions optimales de croissance
des bifidobactries se situent des tempratures comprises entre 37C et 41C, et des valeurs
de pH comprises entre 6.5 et 7. Aucune croissance nest observe des tempratures infrieures

27

Rappels bibliographiques
25C et suprieures 45C et des valeurs de pH infrieures 4.5 ou suprieures 8.5. Les
bifidobactries produisent de lacide actique et de lacide lactique dans un ratio molaire
thorique de 3 : 2 en mtabolisant une grande varit dhexoses par le cycle du fructose-6phosphate (Scardovi, 1986).
4.3. Critres de slection des souches probiotiques :
Alors que les bactries lactiques sont principalement slectionnes pour leurs activits
acidifiantes et protolytiques dans les ferments classiques, dautres proprits doivent tre
tudies dans le cas des probiotiques (fig 4). Pour exercer leur effet bnfique sur la sant, les
probiotiques doivent, comme pour les ferments classiques, survivre en grand nombre au procd
de fabrication, la lyophilisation ventuelle et lentreposage qui sen suit. Il est en effet
gnralement admis quun nombre minimal de 107 cellules viables par gramme de produit est
ncessaire pour exercer un effet probiotique (Ishibashi & Shimamura, 1993).
Cependant, la stabilit physique et gntique des cellules ainsi que toutes les proprits
ncessaires pour exercer leurs bienfaits sur la sant doivent galement tre assures. De plus, ces
souches devraient tre viables sans se multiplier pour ne pas provoquer deffet indsirable sur le
got ou larme du produit ni augmenter lacidit (Mattila-Sandholm et al., 2002). Par ailleurs,
plusieurs tudes ont dmontr que des cellules en phase stationnaire de croissance, plus tolrantes
aux stress environnementaux que des cellules en phase exponentielle, devraient tre privilgies
pour la confection de produits contenant des probiotiques en grand nombre (Kolter, 1993; Hartke
et al., 1994; Rallu et al., 1996; Heller, 2001). Les interactions possibles entre bactries lactiques
et probiotiques devraient galement tre prises en compte pour slectionner la meilleure
combinaison de souches afin doptimiser le procd et la survie cellulaire dans le produit
entrepos (Vinderola et al., 2002 ; Chekroun et al., 2006).
Enfin, ces bactries probiotiques devraient tre capable de survivre en grand nombre aux
conditions acides de lestomac et aux sels biliaires de lintestin lors de la consommation du
produit, puis dadhrer aux cellules pithliales de lintestin afin de produire les effets bnfiques
dsirs le plus longtemps possible (Tamime et al., 1995).

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Rappels bibliographiques

Figure 4 : Proprits et critres de slection des probiotiques. Adapt par Salminen et al. (1998).

29

Rappels bibliographiques
5. Les probiotiques et le systme immunitaire :
5.1. Effet des probiotiques sur le systme immunitaire :
Leffet, in vivo, des probiotiques sur la rponse immunitaire est peu document.
Toutefois, quelques bonnes tudes, in vitro et in vivo, rapportent certains effets (Tableau 2).
Cependant, les effets observs dpendent des souches utilises et les tudes ralises, in vitro,
demandent tre confirmes in vivo.
Grce au dveloppement de modles exprimentaux animaux reproduisant des tats
pathologiques, des donnes rcentes mettent en vidence lintervention de la flore intestinale
rsidente et des probiotiques dans certaines pathologies : maladies inflammatoires du tube
digestif (McCarthy et al., 2003), maladies auto-immunes et rponses immunitaires de type
allergique.
De nombreuses tudes cliniques confirment les rsultats observs dans ces modles
animaux, en particulier pour le dveloppement des allergies aux protine du lait de vache.
5.2. Les probiotiques et leurs effets bnfiques sur la sant :
Plusieurs effets bnfiques sur la sant ont t associs la consommation des
probiotiques. La Figure 5, illustre la diversit des effets bnfiques sur la sant. Les mcanismes
daction potentiellement impliqus dans leffet bnfique des probiotiques sont nombreux faisant
intervenir la baisse du pH intestinal par la digestion du lactose rsiduel, la production de
polyamines qui ont un rle trophique sur la muqueuse, linhibition de ladhsion bactrienne, la
synthse de composs qui inhibent voire dtruisent les microorganisme pathognes, la
stimulation de la rponse immunitaire et la consommation comptitive de certains nutriments
empchant, par ce biais, la prolifration des microorganismes pathognes (Vanderhoof & Young,
1998).
Un certain nombre dtudes randomises, versus placbo, a montr une efficacit sur la
dure de la diarrhe avec Saccharomyces boulardii (Celina-Sauri & Sierra Basto, 1994) surtout
Lactobacillus GG (Shornikova, 1997a; Guandalini et al., 2000) et Lactobacillus reuteri
(Shornikova et al., 1997b), associs une diminution du nombre des selles partir du 3me jour
pour Lactobacillus GG, notamment dans les diarrhes Rotavirus (Guandalini, 2000). Cet effet
semblait par ailleurs dose dpendante (Shornikova, 1997b).

30

Rappels bibliographiques

Tableau 2 : Principaux effets des probiotiques sur la rponse immunitaire.

Principaux effets rapports sur le systme immunitaire Rfrences


Stimulation de la production d'IgA

Fukushima et al., 1998

Stimulation de la prolifration lymphocytaire

Kirjavainen et al., 1999

Stimulation des cellules tueuses NK

Nagao et al., 2000

Stimulation de la prolifration des cellules pithliales

Banasaz et al., 2002

Modulation de la maturation des cellules dendritiques

Christensen et al., 2002

31

Rappels bibliographiques

Figure 5 : Les principaux effets bnfiques attribus aux probiotiques. Adapt par
Mercenier et al. (2002).

32

Rappels bibliographiques
Rcemment, une tude rcente mene par Pulmmer et al. (2004) a dmontr que la
consommation, des probiotiques Lactobacillus acidophilus et Bifidobacterium bifidum
simultanment un traitement antibiotique, prvient lapparition des diarrhes lies Clostridium
difficile chez des personnes ges.
Wang et al. (2004); Myllyluoma et al. (2007) ont dmontr leffet des probiotiques sur les
infections gastro-intestinale en prouvant que la consommation rgulire de yaourt, additionn de
Lactobacillus acidophilus La5 ou de Bifidobacterium lactis Bb12, induit une suppression
effective de linfection due H. pylori.
Des tudes cliniques et pidmiologiques suggrent que les probiotiques jouent un rle
dans la prvention primaire des manifestations atopiques (Pessi et al., 2000; Rosenfeldt et
al.,2003).
Medici et al. (2004) a dmontr que les probiotiques B. bifidum, L. acidophilus et L.
paracase peuvent influencer la rponse immunitaire de la souris au niveau intestinal ; Cette
modulation du systme immunitaire va dans un sens favorable la sant.
Des tudes prliminaires ont rvl que la consommation de yaourt ou de lait ferment
contenant des probiotiques entranent une diminution du taux de cholestrol dans le sang et par
consquent, la rduction des risques dhypercholestrolmie responsable des maladies
coronariennes. Par exemple, Bukowska et al. (1998) ont mis en vidence une diminution du taux
de cholestrol sanguin chez des sujets soumis un rgime supplment avec Lactobacillus
plantarum 299 v.
5.3. Probiotiques et tolrance orale :
Les travaux rcents de Prioult et al. (2003) ont mis en vidence leffet des probiotiques
sur linduction et le maintien de la tolrance orale la -lactoglobuline bovine chez la souris
conventionnelle. Leffet observ au niveau humoral et cellulaire dpendait de la souche
probiotique utilise. Lactobacillus paracasei sest avr plus efficace que Bifidobacterium lactis
et L. johnsonii. Kankaanpa et al. (2003) ont mentionn que Lactobacillus GG, Bifidobacterium
Bb-12 et L. acidophilus inhibent la prolifration des cellules mononucles du sang priphrique
humain ainsi que lexpression des marqueurs cellulaires CD25, CD69 et de HLA-DR (systme
CMH-Antigne humain) sur les lymphocytes T stimuls avec les phytohmagglutinines et la
production de IL2 et IL4.
33

Rappels bibliographiques
Par ailleurs, Ulisse et al. (2001) et Morita et al. (2002) ont dmontr que des souches
probiotiques appartenant au genre Lactobacillus induisent, in vitro et in vivo, une production
significative de cytokines anti-inflammatoires notamment IL-10.
De mme, Jijon et al. (2004) ont dmontr que lADN des bactries probiotiques rduit, in
vitro et in vivo, les rponses inflammatoires au niveau de lpithlium intestinal. Ils ont tudi
leffet de lADN issu dun mlange de 8 souches probiotiques (L. acidophilus MB 443, L.
delbrueckii subsp. bulgaricus MB 453, L. casei MB 451, L. plantarum MB 452, B. longum Y10,
B. infantis Y1, B. breve Y8 et S. salivarius subsp . thermophilus MB 455) sur des mono couches
de cellules pithliales HT-29, des segments de colon, des splnocytes murins et des souris
dficientes en IL-10, en prsence de stimulus pro-inflammatoires. Ils ont observ une rduction
de la scrtion de IL-8 par les cellules pithliales HT-29, une inhibition des mcanismes proinflammatoires (protine kinase, facteur kappa B) et la scrtion de IFN- dans le colon et par les
splnocytes. Une diminution de la production de TNF- et IFN- au niveau de la muqueuse et
une amlioration de ltat histologique des souris ont t galement constates.
5.4. Probiotiques et allergies :
De nombreux travaux de recherches sont actuellement focaliss sur les maladies
allergiques cause de laugmentation de la prvalence de ces dernires observes
particulirement dans les pays occidentaux. Lmergence de ces maladies sexplique, en partie,
par lhypothse dhygine qui diminue lexposition du corps aux agents infectieux en rduisant
lactivit du systme immunitaire et augmentant les risques dapparition des dsordres
allergiques atopiques (Sheikh & Strachan, 2004). Les tudes rapportes ont dmontr leffet antiprolifration des souches probiotiques sur les cellules immunitaires impliques dans les ractions
allergiques (dermatite et allergies alimentaires), lexpression des rcepteurs et la production de
cytokines.
En effet, une tude clinique de Mastrandrea et al. (2004), effectue sur des sujets humains
ge de 6 48 ans, prsentant des symptmes cliniques dasthme et/ou conjonctivite, rhinite,
urticaire, dermatite atopique, allergie alimentaire et le syndrome de lintestin irrit, a montr les
effets positifs des probiotiques dans le traitement des maladies allergiques. Selon cette tude, une
administration quotidienne dun mlange (1x109 bactries vivantes) de Lactobacillus acidophilus
, L. delbrueckii et Streptococcus thermophilus permet de rduire significativement le taux de

34

Rappels bibliographiques
prcurseurs circulants de lymphocytes CD34+ impliqus dans linflammation allergique
systmique.
Wang et al. (2004) ont rapport que lingestion de lait ferment contenant Lactobacillus
paracasei -33 ( 2 x 109 ufc/pot) pendant 30 jours, permet damliorer la qualit de vie chez des
patients souffrant dune rhinite allergique.
Kukkonen et al. (2007) ont montr que lassociation des probiotiques et plus prcisment
les lactobacilles et les bifidobactries avec les galacto-oligosaccharides (prbiotiques) joue un
rle dans la prvention des maladies atopiques (exemple de leczma).
5.5. Mcanismes dinteraction entre les probiotiques et les cellules immunitaires :
Le processus de modulation immunitaire est amorc grce linteraction entre le compos
bactrien actif et des rcepteurs cellulaires de signal bactrien se trouvant sur les cellules
immunitaires. Ces rcepteurs sont appels Toll like receptors (TLR)s. Comme le montre la Figure
6, cette interaction gnre un signal qui est transmis au noyau de la cellule immunitaire en
induisant la transcription du gne codant pour la synthse des cytokines. Selon Mastrandrea et al.
(2004), les bactries et leurs produits sont capables de stimuler le processus de scrtion des
cytokines par activation des rcepteurs cellulaires spcifiques et par consquent la translocation
nuclaire des facteurs de transcription. Les TLRs influencent le dveloppement de la rponse
immunitaire adaptative par activation des cellules CPA et jouent un rle crucial dans linduction
des rponses de type Th1 et Th2 (Dabbagh & Lewis, 2003).
Environ dix rcepteurs de signaux bactriens, de nature protique, ont t rpertoris chez
les cellules immunitaires (monocytes, neutrophiles, macrophages) (Medzhitov et al., 1997;
Chaudhary et al., 1998; Wang et al., 2003). Par exemple, les TLR2, TLR4 et TLR9 reconnaissent
les signaux provenant des composants de la paroi et du cytoplasme de bactries Gram-positive
(Saito, 2004). Cependant, le TLR4 reconnat galement le signal induit par le composant de la
paroi de bactries Gram-ngative (LPS), alors que TLR2 et TLR6 agissent ensemble contre les
particules de paroi de bactries Gram-positives et celles des levures (Takeuchi et al., 2000;
Echchannaoui et al., 2002). Selon une tude mene chez des souris, une stimulation au
lypopolysaccharide entrane la production dIFN- qui est stimule par dautres cytokines telle
que lIL-12, libre par les macrophages et les cellules dendritiques (Gerosa et al., 2002 ;

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Rappels bibliographiques

Figure 6 : Schma illustrant linteraction entre les composants bactriens (Lactobacillus


grasseri) et la cellule immunitaire. TLR, Toll-like receptor. Adapt par Saito (2004).

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Rappels bibliographiques
Kambayashi et al., 2003). Ishii et al. (2004) ont rapport que lADN des bactries contient des
motifs CpG interagissant avec le TLR9 des cellules immunitaires en induisant la production de
cytokines, de chmokines et dimmunoglobulines. Chez lhumain, lexpression de la protine
TLR2 est prdominante sur les monocytes et les neutrophiles et non sur les cellules T, les cellules
B ou les cellules NK (Flo et al., 2001).
En effet, Hosono et al. (1997) ont dmontr quun composant polysaccharidique, isol de
la membrane cellulaire de Bifidobacterium adolescentis, induit une forte prolifration des
lymphocytes. De mme, Kitazawa et al. (2000) ont soulign quun phosphopolysaccharide
extracellulaire neutre, produit par Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL 1073R-1,
stimule la fonction phagocytaire des macrophages in vivo et in vitro .
Le deuxime mcanisme, bas sur lactivit mtabolique de la microflore a t beaucoup
moins tudi. Cependant, il a t dmontr que lhydrolyse des protines laitires par des
bactries probiotiques modifie leurs proprits immunomodulantes. En effet, Ng & Griffiths
(2002) ont montr que du lait ferment avec diffrentes bactries probiotiques (dont B. lactis
Bb12 et L. paracasei ssp. paracasei) et dpourvu de tout extrait bactrien aprs fermentation,
induisait une stimulation, in vitro, de la production dIL-6 par des macrophages, bien que la
stimulation tait moindre avec le lactobacille. Limmunoactivation a t attribue des composs
de nature protique isols par chromatographie. De plus, du lait ferment avec Lactobacillus
rhamnosus GG ainsi que certaines fractions peptidiques issues du lait ferment, ont montr un
pouvoir immunosuppresseur in vitro (Stas et al., 1996) ; Ceci dmontre que lactivit
mtabolique des bactries probiotiques dgrade les protines alimentaires et libre des composs
immunomodulants (Rokka et al., 1997).

37

Matriels et mthodes
1. Provenance des bactries :
Les bactries utilises dans ce protocole proviennent disolements raliss au Laboratoire
de Microbiologie Alimentaire et Industrielle de lUniversit dOran. Ce sont:
-

Lactobacillus acidophilus (La)

- Lactobacillus plantarum (Lb pl),


- Bifidobacterium longum (BL),
- Bifidobacterium bifidum (BB).
Ces quatre espces bactriennes ont t isoles partir de selles de nourrissons et partir du
lait commercial pour nourrisson "Bifilac".
2. Lait :
2.1. Ecrmage :
Le lait de vache cru est frachement collect dans une ferme de la rgion dOran. Il est
pralablement crm 4C par une centrifugeuse ( SIGMA 4 K 10) 3500 trs/min pendant
20 min ; cette opration est destine liminer la matire grasse, source potentielle de
radicaux libres; le lait est ensuite strilis 105C pendant 10 minutes.
3. Caractrisation morphologique des bactries :
3.1. Purification des bactries :
La purification des bactries se fait sur 2 milieux de cultures spcifiques permettant
disoler les lactobacilles et les bifidobactries. Il sagit du MRS acidifi pour la culture des
lactobacilles (Tableau 3; De Man et al., 1960) et du MRS cystin pour la culture des
bifidobactries (Tamine et al.,1995).
Lisolement des espces est ralis par la mthode des quadrants sur milieux solides
appropris. Cette mthode permet lobtention des colonies isoles, pures aprs 24 48 heures
dincubation 37C pour toutes nos espces bactriennes (Ayad et al., 2004; Bensoltane et
al., 2004, Chekroun et al., 2006).

38

Matriels et mthodes

Tableau 3 : Composition du milieu de culture MRS (Man Regosa Scharpe) (De Man et al.,
1960).
Composition
Polypeptone
Extrait de levure
Extrait de viande
Actate de sodium
Citrate de sodium
Glucose
KH2PO4
MgSO4
MnSO4
Tween 80
Agar-agar
Eau distille

Quantit
10
g
5
g
10
g
5
g
2
g
20
g
2
g
0,25 g
0,05 g
1
ml
15
g
qsp 1000 ml

Aprs avoir ajust le pH 6,2, le milieu est strilis 120C pendant 20 minutes en autoclave.

39

Matriels et mthodes
3.2. Etude microbiologique :
3.2.1. Caractrisation morphologique des bactries :
Lauthenticit des espces tudies est vrifie par les tests suivants :
3.2.1.1. Identification morphologique :
3.2.1.1.1 Etude macroscopique :
Cette tude nous a permis didentifier les caractres culturaux, intgrant la fois la
morphologie (ronde, plate, bord rgulier...), laspect de la culture ( lisse, rugueux) et la
pigmentation des colonies (couleur blanchtre, jauntre).
3.2.1.1.2. Etude microscopique :
3.2.1.1.2.1. Coloration de Gram (Larpent & Laprent, 1990; Ventura & Zink, 2002) :
Aprs schage et fixation des frottis, nous recouvrons la lame avec le violet de
gentiane pendant une minute, puis nous jetons le colorant et la prparation est recouverte de
lugol pendant 30 secondes, nous jetons le ractif ; la prparation est recouverte dthanol
95 pendant 10 secondes afin de dcolorer les bactries Gram ngatif. Aprs lavage leau
distille, nous dposons sur la lame quelques gouttes dun deuxime colorant appel fuchsine
de ziehl et nous laissons agir pendant une minute. Enfin, nous lavons la lame avec de leau
distille, puis nous observons, aprs schage, limmersion laide dun microscope
biloculaire LEITZ quip dun dispositif de microphotographique ORTHOMAT automatis.
Les bactries Gram ngatif apparaissent roses et les bactries Gram positif violettes.
3.2.2. Identification physiologique des bactries :
Nous avons procd lidentification physiologique des bactries laide des tests
suivants:
3.2.2.1. Recherche de lenzyme catalase :
Cette mthode consiste mulsionner une partie de la colonie de bactries avec une
goutte deau oxygne; une rduction positive est rvle par le dgagement de bulles
gazeuses (Marchal et al., 1991).

40

Matriels et mthodes
3.2.2.2. Recherche du type respiratoire et fermentaire :
Cette recherche est ralise en faisant crotre chaque bactrie sur un milieu liquide
contenant une cloche de Durham (Marchal et al., 1991). La prsence de gaz dans la cloche de
Durham indique un mtabolisme lactofermentaire. Le test permet de dfinir les espces
bactriennes en fonction de la production dacide lactique seul (homofermentaires), ou de la
production

concomittante

dacide

lactique

et

dthanol,

dactate

et

de

CO2

(htrofermentaires). Lacide actique est produit par les bifidobactries (Ventura & Zink,
2002).
3.2.2.3. Mobilit ou non des bactries :
Elle est dtermine par simple observation au microscope photonique (Ayad et al.,
2004).
4. Prparation des ferments :
Pour ltude des caractristiques dintrt technologique des bactries utilises, nous
avons procd, dans une premire tape, la prparation de linoculum et des ferments pour
chaque espce utilise. Ce travail ncessite du lait de vache strile supplment en cystineHCl la concentration de 0,08% qui agit comme antioxydant pour la culture des
bifidobactries qui sont anarobies strictes (Dubey & Mistry, 1996).
4.1. Prparation de linoculum :
Les prcultures, en milieu lait, sont ralises partir de cultures cellulaires ges de 24
heures. Les espces de bifidobactries (une ou 2 colonies) sont repiques dans le lait de vache
crm, supplment par 0,5% dextrait de levure et par 0,08% de cystine-HCl (Frank et al.,
1993; Dubey & Mistry, 1996) et incubes 37C sous conditions danarobiose. Pour les
lactobacilles le repiquage se fait seulement dans du lait crm strile. La temprature
dincubation est de 37C pour les lactobacilles et les bifidobactries. Les prcultures ou
inoculums obtenues sont utilises pour la prparation des cultures pures ou ferments.
4.2. Prparation des ferments :
Pour chaque espce bactrienne, la culture pure est obtenue en ensemenant le lait
avec 1% de linoculum correspondant. Pour les bifidobactries, le lait crm strile est
supplment en cystine-HCl raison de 0,08 % (Ventura & Zink, 2002).

41

Matriels et mthodes
5. Protocoles de prparation des diffrents laits ferments :
Le lait crm strile est ensemenc par une culture mixte, ge de 18 heures, la
concentration de 10%. Lensemble est homognis et incub 45C jusqu coagulation du
lait.
Les cultures mixtes nous ont permis de prparer les laits ferments suivants:
- Lactobacillus acidophilus (La) + Bifidobacterium bifidum (B bif)
- Lactobacillus acidophilus (La) +Bifidobactrium longum (B long)
Pour lanalyse statistique, chaque opration a t rpte 5 fois, permettant ainsi
dobtenir pour chaque association 5 chantillons de laits ferments.
6. Caractrisation des cultures mixtes au cours de la fermentation du lait :
6.1. Profil fermentaire des bactries :
6.1.1. Mesure de la production dacide :
Le taux de production dacide est considr comme le reflet de lactivit du ferment
(Stadhouders, 1986).
6.1.1.1. Principe de mesure :
Lexpression "acidit titrable" dsigne lacidit mesure par la mthode classique de la
raction acide-base selon la mthode dcrite par Accolas et al., (1977). Cette mthode permet
de neutraliser lacide produit par la fermentation par une solution de NaOH (N/9) en prsence
de phnolphtaline ( 1% dans de lalcool). La solution dhydroxyde de sodium (NaOH)
utilise est dite soude dornic.
La mesure de lacidit titrable est faite au dbut de la fermentation du lait (t=0) puis
toutes les heures jusqu coagulation du lait. Les mesures sont effectues dans le lait
ferment, par les cultures prises en association.
6.1.1.2. Procdure :
A 10 ml de lait, contenant la culture mixte, sont ajoutes 5 gouttes de phnophtaline.
Puis, laide dune burette gradue et sous agitation, nous ajoutons de la soude dornic jusqu
ce que la couleur blanche vire au rose. Le volume (V) de la soude utilis est not.
Les rsultats sont exprims en utilisant la relation :
Acidit = Vx10,
1 D = 0,1g dacide lactique produit dans un litre de lait.

42

Matriels et mthodes

Lait frachement collect


Centrifugation 3500 tours / min
pendant 20 min.

Ecrmage

Lait crm

Strilisation

105 C pendant 10 min

Lait strile

Fermentation

45C pendant 4h

Sans bactrie

Lait strile sans bactrie


(Tmoin)

Avec (La + BL)

Lait ferment (La+ BL)


(LF1)

Avec (La+BB)

Lait ferment (La+ BB)


(LF2)
-72C pendant

Conglation
Lyophilisation

Lait strile sans bactrie


(LS) lyophilis

Lait ferment (La+ BL)


(LF1) lyophilis

Lait ferment (La+ BB)


(LF2) lyophilis

Figure 7 : Diffrentes tapes de prparation des chantillons de lait de vache au


Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et Scurit Alimentaire (Universit dOran).
6.1.2. Mesure de la cintique de variation du pH :
43

Matriels et mthodes
Le pH, indice de lacidit dveloppe dans le lait au cours du processus de
fermentation, est mesur en fonction du temps laide dun pH mtre (Kika Laboretechnik).
7. Caractrisation biochimique des laits ferments :
7.1. Prparation des chantillons :
Aprs obtention des diffrents laits ferments, nous avons procd leur
caractrisation biochimique selon la procdure suivante.
7.1.1. Constitution des chantillons de laits ferments :
Chaque lait ferment, constitu de 5 chantillons, est homognis, congel -72C,
dshydrat par lyophilisation laide dun lyophilisateur (Speed Vac Concentator 100H) et
conserv pour les dosages ultrieurs.
7.2. Mesure de lactivit protolytique des bactries :
7.2.1. Dosage des protines totales (Lowry et al. 1951) :
La dtermination des teneurs en protines totales dans les laits ferments est effectue
par la technique de Lowry et al. (1951).
Le principe consiste en laddition successive, une solution protique dilue, dun sel
de cuivre en milieu alcalin, puis dun ractif de phnol de folin-cieucalteus (Merck) qui
donne une coloration bleue qui rsulte de la rduction de lacide phospho-tungsto-molybdique
(ractif de Folin) par la tyrosine, le tryptophane et la cystine contenues dans les protines. Il
se dveloppe une coloration bleue dont lintensit est proportionnelle la quantit de
protines de lchantillon. La composition des solutions utilises pour le dosage des protines
totales figure dans le tableau 4.
7.2.1.1. Procdure :
Le dosage des protines seffectue sur les chantillons de laits ferments aprs dilution
dans de leau distille. Nous prenons 1ml de chaque chantillon, puis nous ajoutons 0,5ml de
ractif C, bien agiter et laisser agir la temprature ambiante pendant 30minutes.

44

Matriels et mthodes

Tableau 4: Composition des solutions utilises pour le dosage des protines totales selon la
technique de Lowry et al., 1951.
Solution A

NaCO3 anhydre

2% dans la solution de la soude 0,1 N

Solution B1

CuSO4

5%

Solution B2

Tartrate de K et de Na anhydre

10%

Solution prparer extemporanment :


Solution B : 1 ml de la solution B1 + 1 ml de la solution B2 + 8 ml deau distille.
Solution C : 1 ml de la solution B + 50 ml de la solution A.
Solution E : Ractif de Folin dilu au demi (V/V) dans de leau distille.

La lecture se fait au spectrophotomtre (JASCO V-530), dans une cuve en quartz une
longueur donde de 750 nm.

45

Matriels et mthodes
La concentration en protines totales est calcule en rfrence une courbe talon
obtenue avec la srum albumine bovine.
8. Etude de lantignicit rsiduelle des laits ferments :
8.1. Model animale :
Nous avons utilis 40 souris femelles de souche BALB/cByJlco (BALB/c) dun poids
moyen de 16 g, ges de 3 et 5 semaines. Cette souche est caractrise par une bonne rponse
immunitaire aux diffrents antignes. Les animaux sont acquis auprs de lInstitut Pasteur
dAlger. Ils sont maintenus, pendant toute la dure de lexprimentation, dans des conditions
danimalerie du Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et Scurit Alimentaire ; ils sont
maintenus dans des cages appropries munies chacune dun biberon et dune mangeoire et
sont nourris ad libbitum avec des granuls (aliment conventionnel) et de leau supplmente
de polyvitamine (Groupe SAIDAL). Les manipulations sur les animaux sont effectues en
respectant le bien-tre de lanimal, excluant tout tat de stress susceptible dinterfrer avec les
rsultats.
8.2. Adjuvants :
8.2.1. Hydroxyde daluminium :
Lhydroxyde daluminium ou alun (Merck) est prpar partir dune solution
contenant 40 mg dhydroxyde daluminium et 2mL de PBS. Lalun est un adjuvant utilis
pour la vaccination chez lhomme et chez les animaux.
8.3. Immunisation des animaux la -Lg :
8.3.1. Rpartition des lots:
Les 40 souris BALB/c femelles sont rparties en 4 lots de 10 dont 3 exprimentaux et
un lot tmoin.
Le premier lot :
La colonisation du tube digestif des 10 souris se fait avec une bactrie pure de
Lactobacillus plantarum. Une colonie de cette bactrie est prleve sur le milieu de culture
appropri puis dilue dans 9 ml dune solution saline; 0,3 ml de cette solution sont introduits
dans le tube digestif de lanimal pendant 18 jours.

Aprs le 18mejours (J1), les animaux subissent un gavage avec du lait de vache
ferment par lassociation de Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longumt lyophilis
46

Matriels et mthodes
puis dilu dans une solution saline raison de 120 mg/ml; 0,3 ml de cette solution sont
introduits par intubation intragastrique.
2me lot exprimentale :
Il est compos de 10 souris qui subissent une colonisation du tube digestif avec une
bactrie pure: Lactobacillus plantarum pendant 18 jours comme dcrit prcdemment.
Aprs le 18me jour (J1), le gavage est fait avec du lait de vache ferment par
lassociation de Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum lyophilis puis dilu
dans une solution saline raison 120 mg/ml; 0,3 ml de cette solution sont introduits par
intubation intagastrique.
3me lot exprimentale :
Il est compos de 10 souris qui ne reoivent ni bactries pour la colonisation de
lintestin ni du lait ferment pour le gavage. Ce dernier se fait avec une solution de NaCl 9%
raison de 0,3 ml pendant 18jours.
4me lot tmoin :
Il est compos de 10 souris ne recevant aucun agent sensibilisant particulier.
8.3.2. Protocole dimmunisation :
Les immunisations sont faites en prsence dalun. La solution injectable est prpare
partir dune solution contenant 5mg de -Lg dissous dans 0,5 ml de PBS. A 20l de cette
solution, sont ajouts 2 ml de PBS + 40 mg doxyde daluminium (Al (OH)3) ( Merck ).
Chaque souris reoit par voie sous cutane 100l de cette solution. Les immunisations ont
lieu au 5me jour aprs le dernier gavage, pour tous les groupes exprimentaux (groupes de
souris sacrifi au 28me jours et groupes de souris sacrifi au 50me jour), selon la rpartition
indique dans la figure 8:
Chaque lot est rparti en deux groupes de 5 souris chacun.
- Groupe sacrifi au 28me jour.
-Groupe sacrifi au 50me jour ; durant cette priode il reoit deux rappels supplmentaires la
-Lg au 21me et au 35me jour.

47

Matriels et mthodes

18 jours
Colonisation
bactrienne
(G)

1er jour
Induction de
la tolrance
(G)

5me jour
Injection
(SC)

28me jour

50me jour

5 souris
Sacrifice
10 La
plantarum

LF1

-Lg

SC au 21me jour
5 souris

SC au 35me jour

Sacrifice

5 souris
Sacrifice

30
souris

10 La
plantarum

LF2

-Lg
SC au 21me jour
5 souris

Sacrifice

SC au 35me jour

5 souris
Sacrifice
10. Solution
saline

Solution saline

-Lg

SC au 21me jour
SC au 35me jour

Sacrifice

5 souris

Figure 8 : Protocole de sensibilisation et de gavage des souris.

G : gavage ; Sc : immunisation sous cutane ; -Lg : -lactoglobuline ;


LF1 :Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum ;
LF2 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.

8.3.3. Prlvements des chantillons sanguins :


48

Matriels et mthodes
A J0 (avant la colonisation bactrienne) et au jour de sacrifice des animaux, le sang est
prlev laide dune pipette pasteur, par le sinus orbitale de lil. Le sang prlev est
centrifug 3500 trs /min pendant 15 min 4C. Le surnageant correspondant au srum est
spar du culot, mis en parties aliquotes puis conserv -20C pour le dosage des
immunoglobulines spcifiques IgG.
9. Evaluation du degr de sensibilisation des animaux :
9.1. Titrage des anticorps IgG sriques anti -Lg par dosage immunoenzymatique :
Afin dvaluer le degr de sensibilisation des animaux la -Lg native (Merck), la
technique immunoenzymatique ELISA a t utilis, selon un procd non comptitif en
mesurant les anticorps de type IgG anti- -Lg .
9.1.1. Principe :
Le principe de cette technique est bas sur un procd dans lequel les anticorps doser
ragissent dans un premier temps avec lantigne immobilis par adsorption sur une phase
solide. Dans un deuxime temps, la quantit danticorps fix par lantigne est mesure
laide dun deuxime anticorps (anti-immunoglobuline).
Dans le cadre de notre travail nous avons utilis des plaques de microtitration en
polystyrne (NUNC Maxisorb, 96 puits fond plat), qui permettent dadsorber la plupart des
antignes dilus en phase alcaline. Aprs dpt de limmunosrum contenant les anticorps
spcifiques, la phase solide est lave et nous rvlons la prsence de ces anticorps par
laddition dun conjug qui correspond des anti-IgG de souris (Sigma) suivi dun ligand
spectravidin peroxydase (Sigma). La dernire tape correspond au dosage de lenzyme
marqueur et cette phase est essentielle, car du plus petit nombre de molcules denzymes que
nous pourrons dtecter dpendra le seuil de sensibilit.
Le substrat de la peroxydase que nous utilisons est le peroxyde dhydrogne
(H2O2).Au cours de la raction enzymatique, un radical O se forme. Pour le dtecter, nous
ajoutons la solution un chromogne, lOrthophnylne Diamine (OPD).

9.1.2. Mode opratoire :


49

Matriels et mthodes

Les microplaques sont sensibilises par 10 g/ml de -Lg dilue dans du PBS 0,01M
(tampon phosphate salin) pH 7,4 et sont incubes pendant au moins une nuit +
4C.

Aprs un lavage avec du PBS- Tween 20, 0,05% (PBS/Tw 20), 200L de PBS-BSA
3% (pour la -Lg) sont dposs dans les puits et la plaque est incube 37C pendant
1 heure pour saturer les sites non spcifiques.

La plaque est ensuite rince avec du PBS/Tw 2O et les chantillons de srum de


souris immunises la -Lg, sont dilues dans du PBS BSA 1% Tween 0,05%
(tampon de dilution) raison de 10-2 10-7 sont dposs dans les puits (100l par
puits). La plaque est incube 37C pendant 2 heures.
Un autre lavage est effectu avec du

PBS/Tw20 avant le dpt

de lanticorps

(anticorps polyclonal B 9904 Sigma pour les IgG totales spcifiques).


Les microplaques sont incubes pendant 1 heure + 37C.

Aprs lavage avec du PBS/Tw20, la Streptavidine peroxydase E-2886 (Sigma) est


dilue au 1/5000 et dpose raison de 100l par puits ; la plaque est incube 37C
pendant 30 min.

Aprs lavage avec le PBS/Tw20, leau oxygne (H2O2) associ un chromogne :


lorthophnylne diamine (OPD), dans du tampon citrate de sodium (0,05M pH 5,1)
est dpos raison de 200L/puits.La raction colore se dveloppe en 30 minutes
temprature ambiante et labri de la lumire. Lajout de H2SO4 2N a permis de
stopper la raction (Tableau 5 et 6).

Lintensit de la raction colorimtrique est mesure 492 nm laide dun lecteur


(ELx 800).

Des tmoins positifs et ngatifs sont inclus dans chaque plaque afin de contrler la
spcificit et la sensibilit de chaque mesure.

10. Etude histologique de lintestin de souris sensibilis par voie parentrale la -Lg

Cette tude a pour but de vrifier lexistence dune infiltration lymphocytaire au


niveau de la muqueuse intestinale ainsi que la prsence dune atrophie villositaire en rponse
limmunisation des souris par la -Lg native. Les souris ont subit une colonisation
bactrienne et un gavage avec un lait ferment probiotique.

Tableau 5 : Composition du tampon phosphate salin PBS, 1 M, pH =7,4 x10.


50

Matriels et mthodes
Solutions

Quantits

Na2HPO4,12 H2O

29 g

KH2PO4

2g

NaCl

80 g

Kcl

2g

Thymrosal

1g

Eau ultra pure

1000 ml

Nous effectuons une dilution de 1/10 me de cette solution pour obtenir la fin une solution de
phosphate salin PBS (0,01M) pH = 7,4.
Tableau 6 : Composition des solutions tampons dELISA.

Tampons

Produits

Tampon de capture

NaHCO3 (0,1 M)

Tampon de lavage

PBS
Tween 20

Tampon de saturation

PBS
BSA

Tampon de dilution

PBS

pH=9,6

(0,01M) pH = 7,4
0,05 %
(0,01M) pH = 7,4
3%
(0,01 M) pH = 7,4

BSA

3%

Tween 20

0,1 %

Ltude histologique est faite sur des fragments isols dintestin des souris composant
les lots suivants:
51

Matriels et mthodes
-Sensibilises la -Lg et ayant subit une colonisation bactrienne suivit dun gavage avec le
1er lait ferment.
- Sensibilises la -Lg et ayant subit une colonisation bactrienne suivit dun gavage avec le
2me lait ferment.
-Sensibilises la -Lg et gaves avec une solution saline.
-Non sensibilises pris comme tmoins.
Le jjunum est rcupr le jour de sacrifice de chaque groupe (28me et 50me jour)
10.1. La fixation :
La fixation a pour but essentiel dassurer une immobilisation des constituants
cellulaires ou tissulaires dans un tat aussi voisin que possible de ltat vivant (Nzelof, 1972).
Cest une phase importante ; son but est de ne pas endommager les composants du tissu que
nous voulons fixer telles que les cellules immunitaires.
Les fragments intestinaux sont tudis selon le protocole suivant :
Ds leur prlvement, les fragments de jjunum sont mis directement dans du ringer
glac. Ils sont rincs puis dcoups en petits morceaux et mis pendant 24h dans du phormol
10% tamponn avec du CaCl2 raison de 1%.Les solutions de formaldhyde sont les fixateurs
les plus rpandus. On les utilise frquemment des concentrations variants de 10% 20%. Le
formaldhyde a de nombreuses qualits : il pntre rapidement, conserve bien les structures et
nentrane pas de durcissement excessif ni de rtrcissement notable des tissus. Par contre, le
stockage prolong des chantillons provoque une rigidit excessive des chantillons, une
faible coloration du noyau ainsi que la formation dun pigment brun d la dgradation de
lhmoglobine.
10.2. Inclusion et coupe des tissus :
10.2.1. Les procds dinclusion :
En technique dhistologie courante, les tissus fixs ne sont pas coups tels quels, mais
aprs inclusion dans un milieu solide qui maintient les structures, leur donne une consistance
qui empche la fragmentation des tissus lors de la coupe et assure lobtention de sections trs
fines, rgulires et homognes. Le plus couramment utilis de ces milieux est la paraffine,
mais il en existe dautres.

52

Matriels et mthodes
Chimiquement, les paraffines sont des mlanges dhydrocarbures solides poids
molculaire lev; ces substances sont en effet caractrises par leur indiffrence aux agents
chimiques.
Elles se prsentent sous forme de substances blanches, lgrement translucides,
inodores, onctueuses au toucher.
10.2.2. Inclusion la paraffine :
Les paraffines ntant pas solubles dans leau, il nest pas possible dy plonger un tissu
fix. Toujours trs charg deau, il est donc ncessaire deffectuer au pralable une
dshydratation lalcool absolu. La dshydratation permet llimination de leau du fragment
dintestin en plongeant celui-ci dans de lalcool choisi (alcool thylique) pendant un temps
suffisant dordre croissant : alcool 70, 90 et alcool absolu 99,9%. La dure de la
dshydratation est fonction du volume des fragments tissulaires, les paraffines ntant pas
solubles dans les alcools.
La dshydratation complte du fragment dintestin a suivi les tapes suivantes :

Bain dalcool 70 pendant 25 minutes.

Bain dalcool 90 pendant 25 minutes.

Bain dalcool 100 pendant 25 minutes.

Bain de tolune pendant 10 minutes.

Bain de tolune pendant 15 minutes.

Il faut ensuite passer le fragment dshydrat dans un milieu intermdiaire, soluble la


fois dans lalcool et la paraffine (par exemple : tolune, xylne, chloroforme.).
10.2.2.1. Imprgnation par la paraffine :
Elle seffectue dans un bain de paraffine ltat liquide durant une heure dans une
tuve dont la temprature est rgle lgrement au dessus de son point de fusion soit 56.
Etant donn que la qualit des coupes est en grande partie fonction de labsence de
toute trace de solvant dans la paraffine de la coupe, nous imprgnons les fragments dintestins
dans 2 bains successifs de paraffine : le premier bain dure une heure et le deuxime bain dure
2 heures. Ces bains doivent tre frquemment changs car ils se chargent progressivement de
solvant. La persistance de tolune abaisse le point de fusion de la paraffine rendant donc
celle-ci plus molle et moins propre la coupe.

53

Matriels et mthodes

A la sortie du dernier bain de paraffine, lchantillon est dpos dans la paraffine


fondue vierge que nous coulons dans un moule constitu par des barres mtalliques (barres de
Leuckart) disposes sur une lame de verre ; on peut utiliser galement des moules tous
prpars en plastique.
Le refroidissement la temprature ambiante de cette paraffine amne sa solidification
en un bloc prt tre coup.
Remarque :
Les blocs obtenus peuvent se conserver durant de trs longues priodes.
10.2.3. Microtomisation et talement des coupes :
Les chantillons dintestin sont coups laide dun microtome. Les coupes obtenues
ont une paisseur de 4 m. Le microtome comporte :

Un support de rasoir,

Un porte-objet o sera insr le bloc,

Un systme davance mcanique permettant le dplacement de lobjet en direction du


rasoir fix et dont langle de coupe est vertical.

Un bouton gradu de 0 20 m pour rgler lpaisseur de la coupe.

Ltalement des coupes se fait sur une lame de verre qui est recouverte dune solution
dalbumine (2g dalbumine + 50 ml de glycrine dans 1000 ml deau distille). Cette lame est
place sur une plaque chauffante rgle une temprature convenable, infrieure celle du
point de fusion de la paraffine. Lensemble coupe lame de verre est retir de la platine,
goutt et mis scher pendant au moins une heure avant dtre color ou conserv ltuve
temprature ambiante jusquau moment de la coloration.
10.3. Coloration :
Avant de procder la coloration des coupes, il faut dparaffiner et rhydrater
lchantillon.
10.3.1. Dparaffinage :
Pour dparaffiner les coupes, il suffit de les placer sur une plaque chauffante 56C et
les mettre ensuite dans 2 bains successifs de tolune durant 2 minutes pour chaque bain.
10.3.2. Rhydratation :
Lhydratation de lchantillon se fait dans 3 bains successifs dalcool thylique dordre
dcroissant (100, 95, 70) durant 2 minutes par bain ; le rinage de la coupe se fait leau
courante.

54

Matriels et mthodes
10.3.3. Technique de coloration :
10.3.3.1. Coloration nuclaire :
Les colorations nuclaires que nous avons utilises sont simples. La plupart sont
progressives mais certaines colorations par lhmatoxyline ncessitent une diffrenciation.
Les colorants nuclaires les plus utiliss en histologie courante sont les hmatoxylines
qui colorent les noyaux en bleu-noir, brun-noir ou noir.
Lhmatoxyline est une matire colorante naturelle extraite lther de certains bois
dAmrique du Sud qui ne se trouvent que dans la zone tropicale.
Les proprits colorantes de lhmatoxyline napparaissent quaprs une oxydation par
loxygne atmosphrique ou par adjonction dun agent oxydant (eau oxygne, Permanganate
de potassium,).
Lhmatine, substance colorante de lhmatoxyline, ne peut colorer correctement les
noyaux des fragments dintestins de nos souris que si elle est additionne dalun de potassium
ou dalun de fer ; lhmatine possde une forte charge positive et se comporte comme un
puissants colorants basiques.
10.3.3.2. Coloration topographique gnrale :
Coloration lhmalun-osine :
Nos lames ont t colores lhmalunosine : cest la plus simple des colorations
combines . Nous avons fait agir successivement un colorant nuclaire basique
lhmatine et un colorant cytoplasmique acide , losine. La coloration du noyau est bleunoir et le cytoplasme rose rouge.
Lhmatoxyline de Harris (Hould, 1984) est utilise pour colorer les noyaux. La
prparation de ce produit se fait comme suit :

Dissoudre 5g dhmatoxyline dans 50 ml dthanol

Dissoudre 100g dalun de potassium dans 1000 ml deau distille en chauffant


lgrement et retirer la solution du feu.

Mlanger les 2 solutions

Faire bouillir le mlange, le retirer du feu.

Ajouter avec prcaution, par petites quantits 2,5 g doxyde mercurique

Chauffer de nouveau jusqu ce que la solution acquiert une couleur pourpre fonce

Retirer immdiatement du feu et refroidir aussitt dans un grand rcipient rempli


deau.

55

Matriels et mthodes

Filtrer avant usage.

Ajouter, si ncessaire avant usage, 2 4% dacide actique glacial pour augmenter la


prcision de la coloration de nos lames comme suit :

Mettre les lames dans lhmatoxyline de Harris durant 2 3 minutes.

Laver les lames leau ordinaire.

En cas de surcoloration, les lames sont trempes lgrement dans lalcool


chlorhydrique (100 ml dalcool 95 + 5 gouttes dHCl 1%) pendant quelques
secondes.

Bleuir dans une solution aqueuse sature de carbonate de lithium (rinage).

Laver les lames leau ordinaire.

Mettre les lames dans un bain dalcool thylique 1 2 minutes.

Colorer les lames losine alcoolise (2 g dosine dans 100 ml dalcool thylique)
pendant 5minutes.

Rinage des lames dans 2 bains successifs dalcool thylique 70 puis 95.

Mettre les lames dans du tolune pendant 1 minute.

Mettre entre lame et lamelle une goutte de baume de Canada ou deukitt.

Laisser scher puis observer au microscope.

10.3.4. Mesure des villosits :


Le relief villositaire au niveau du jjunum est apprci suivant diffrents critres,
essentiellement la hauteur des villosits.
10.3.4.1. Principe de la mesure :
Les mensurations des hauteurs des villosits sont effectues sous un microscope
optique muni dun micromtre oculaire. Pour dterminer le nombre de microns correspondant
pour chaque objectif, nous plaons sous le microscope un micromtre objectif qui est une
sorte de lame prsentant des graduations. Nous dterminons le nombre de divisions sur le
micromtre objectif. Ce nombre correspond un nombre prcis de microns. Nous avons
utilis un micromtre 200 divisions qui correspondent 2 mm.
Le micromtre oculaire comporte 100 divisions. Ces 100 divisions correspondent
128 divisions sur le micromtre pour lobjectif (x10).
Puisque les 200 divisions sur le micromtre objectif correspondent 2000 m, donc les 128
divisions correspondent 1280 m.

56

Matriels et mthodes

Tableau 7 : Composition du colorant lhmatoxyline de Harris (Hould, 1984)

Hmatoxyline

5g

Ethanol

50ml

Alun de potassium

100ml

Eau distille

1000ml

Faire bouillir le mlange


Oxyde mercurique

2,5g

Chauffer la solution et filtrer avant usage.

57

Matriels et mthodes
Les 100 divisions du micromtre oculaire correspondent 1280 m, donc une division
correspond 12,8 m pour lobjectif (x10). Le mme principe de calcul est appliqu pour les
autres objectifs.
10.3.4.2. Calcul :
Nous procdons aux calculs des moyennes des hauteurs villositaires des chantillons
dintestin des 4 lots de souris.
10.3.5. Dnombrement des lymphocytes intra-pithliaux :
Nous utilisons la mthode prconise par Rouquette (1980) que nous adaptons la souris.
Pour chaque tissu, nous ralisons 3 comptages en procdant, dans un premier temps, une
numration de 100 entrocytes, et nous dterminons le nombre de lymphocytes intrapithliaux (LIE). Cette mthode est la plus souvent utilise chez le rat et le lapin. Le
dnombrement des lymphocytes dans 100 entrocytes recouvre une tendue pithliale
suffisamment importante.
Pour obtenir un comptage fiable des (LIE), 2 conditions doivent tre runies :

Effectuer la rnumration sur 100 entrocytes contigus.

Renouveler ce comptage sur 3 champs diffrents et si possible sur des fragments


dintestins diffrents.

Remarque :
Ce comptage permet de comparer le nombre des (LIE) dans les chantillons dintestin.
10.4. Analyse statistique :
Les diffrents tests utiliss :
Le seuil de signification p retenu est 0,05.
Les comparaisons de deux moyennes sont ralises en moyen dun test de t de student.
Les comparaisons de plusieurs moyennes sont ralises par lanalyse de variance (ANOVA).
Les rsultats sont prsents sous forme de moyenne erreur standard.
Les diffrentes donnes sont analyses laide dun logiciel STATISTICA version 6,0.

58

Rsultats
1. Etude microbiologique :
1.1. Caractrisation morphologique des ferments :
1.1.1. Aspect macroscopique et microscopique des bactries :
Lidentification des bactries qui nous a permis de vrifier lauthenticit des
espces tudies, a donn les rsultats suivants :
1.1.1.1. Les lactobacilles :
1.1.1.1.1. Lactobacillus acidophilus :
Les bactries Lactobacillus acidophilus (La) (Fig 9 A et B), se prsentent sous
forme de btonnets de diffrents types. Elles sont anarobie facultative ou microarobie.
Ces bactries son sensibles lacide nalidixique et au lithium chloride : ce sont des
lactobacilles.
Les tests raliss montrent que toutes les bactries sont Gram positif, non mobiles,
non sporuls; leur croissance est favorise en anarobie.
1.1.1.1.2. Lactobacillus plantarum :
Les bactries Lactobacillus plantarum (Lb pl) (Fig 10 A et B) se prsentent sous
forme de courts btonnets en chanettes et en paires. Elles sont Gram positif, non mobiles,
non sporules; leur croissance est favorise en anarobie.
1.1.1.2. Les bifidobactries :
Les espces Bifidobacterium bifidum (BB) (Fig 11 A et B), Bifidobacterium longum
(BL), (Fig 12 A et B) se prsentent sous forme de bifides (V, Y), courts btonnets
extrmit arrondie et souvent sous formes spatules de diffrents types ce qui fait le
principal caractre des bifidobactries (polymorphisme cellulaire).
Lobservation macroscopique montre que les colonies de Bifidobacterium bifidum
sont plus grandes que celles de Bifidobacterium longum.
Les tests raliss montrent que toutes les bactries sont Gram positif, non mobiles,
non sporules; leur croissance est favorise en anarobie, catalase et nitrate ngative; elles
sont anarobies strictes.
Les rsultats des tudes macroscopiques et microscopiques des bactries tudies
sont reprsents dans le tableau 8.

59

Rsultats

Aspect macroscopique des colonies de La.

Aspect microscopique de La (Gx 100).

Figure 9: Aspect macroscopique des colonies (A) et microsopique (B) de La, sur milieu MRS
acidifi, aprs coloration de Gram.

Aspect macroscopique des colonies de Lb pl.

Aspect microscopique de Lb pl (Gx100).

Figure 10 : Aspect macroscopique des colonies (A) et microsopique (B) de La pl, sur
milieu MRS, aprs coloration de Gram.

60

Rsultats

Aspect macroscopique des colonies de BB.

Aspect microscopique de BB (Gx100).

Figure 11: Aspect macroscopique des colonies (A) et microscopique (B) de BB, sur milieu
MRS cystin, aprs coloration de Gram.

Aspect macroscopique des colonies de BL.

Aspect microscopique de BL (Gx100).

Figure 12: Aspect macroscopique des colonies (A) et microscopique (B) de BL, sur milieu
MRS cystin, aprs coloration de Gram.

61

Rsultats

Tableau 8: Rsultats des diffrents aspects macroscopiques et microscopiques des souches


tudies.
Souches Milieu
BL

Aspect

Aspect microscopique

disolement

macroscopique

MRS c

Petites

colonies Courts

blanchtres,

regroups

Gram

btonnets +
ou

isols

visqueuses, bombes extrmits arrondies, avec


contour rgulier.
BB

MRSc

des rares bifurcations (V).

Colonies blanchtres, Btonnets


bord rgulier.

extrmits

courts

arrondies,

forme bifide(Y,V).
La

MRSa

Petites

colonies Longs

blanchtres

bacilles

en +

bacilles,

en +

et chanettes.

visqueuses.
Lbpl

MRS

Colonies blanchtres, Courts


bord rgulier.

chanettes ou en paires.

62

Rsultats
2. Etude biochimique des laits ferments :
2.1. Cintique de production de lacide par les associations de lactobacilles et
bifidobactries :
La courbe dvolution en fonction du temps de lacidit titrable produite par les 2
associations des lactobacilles et bifidobactries sont illustrs dans la figure 13. Les
rsultats obtenus sont compars ceux de lait strile pris comme tmoin.
Nos rsultats montrent une augmentation rgulire de lacidit produite en fonction
du temps dincubation dans les deux types de laits (LF1 et LF2). Au temps initial la quantit
dacide produite est de : 21,8 0,33 D, 21,2 0,37 D, 18 0,09 D respectivement pour
le lait LF1, LF2 et LS. Aprs 4h dincubation, la quantit dacide produite atteint 36
0,63D pour le lait LF1 et 34,8 0,37 D pour le lait LF2. La quantit dacide dans les deux
laits ferments est significativement leve (p 0,001) par rapport celle du lait strile
18,4 0,24 D. Nous navons pas not une diffrence significative entre le lait LF1 et le
lait LF2.
Les rsultats obtenus, la fin de lincubation, montrent une augmentation de la
production dacide hautement significative (p 0,001) dans le lait LF1 par rapport au dbut
de la fermentation. Dans le LF2 laugmentation de la production dacide est trs
significative (0,001 p 0,01). Dans le lait strile, la quantit dacide reste stable et
aucune diffrence significative nest tablie entre le dbut et la fin dincubation.
2.2. Cintique de variations du pH au cours de la fermentation du lait par les
associations de lactobacilles et de bifdobactries :
Les cintiques dabaissement du pH du lait de vache ferment par les associations
despces bactriennes ont t suivies au cours de la fermentation 45C (Figure14) et
sont compares avec le lait de vache strile. Les rsultats montrent une baisse du pH dans
les deux laits ferments qui traduit lactivit mtabolique des espces utilises.
Au temps initial dincubation, les valeurs du pH sont de 6,27 0,04 ; 6,31
0,07 et 6,63 0,02 respectivement pour le lait LF1, LF2 et LS. Les rsultats obtenus aprs
4h dincubation montrent une baisse significative du pH dans les deux types de laits
ferments et les valeurs sont de 5,32 0,09 (p 0,001), 5,92 0,1 (p 0,001)
respectivement pour le lait LF1 et LF2, alors que le pH de lait strile reste stable (6,62
0,06) (diminution non significative).
Nos rsultats montrent que, aprs 4h dincubation, le pH du lait LF1 a baiss dune
faon trs significative (p 0,001) par rapport au lait strile (tmoin) et par rapport au lait

63

Rsultats

Acidit titrable
(Dornic)

40

***

35
**
$$$

30
25
20
15
10

Temps (min)

30

60

90

120

150

180

210

240

Figure 13: Cnitique de production de lacide au cours de la fermentation du lait de vache


45C (LF1, ; LF2, ; LS, ).
LF1 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
LF2 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
LS : Lait strile de vache sans ferment (tmoin).
Les valeurs indiques sont des moyennes erreur standard. (n=5).
*** : LF1 (t0) vs LF1 (t240) (p 0,001).
**: LF2 (t0) vs LF2 (t240) (0,001 p 0,01).
:LF1vsLS t240 (p 0,001).
$$$ :LF2vsLS t240 (p 0,001).

Nous notons quil ny pas de diffrence significative entre t0 et t240 dans LS.
Nous notons quil y a une diffrence non significative entre LF1 et LF2 la fin de
lincubation.
La diffrence est significative entre le dbut et la fin de lincubation dans deux laits
ferments.

64

Rsultats

pH

7
6,5

***

$$$

5,5
5
4,5
4
0

30

60

90

120

150

180

210

240

Temps (min)

Figure 14 : Cintique de variations du pH au cours de la fermentation de lait de vache


45C (LF1, ; LF2, ; LS, ).
LF1 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
LF2 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
LS : Lait strile de vache sans ferment (tmoin).
Les valeurs indiques sont des moyennes erreur standard. (n=5).
n :nombre dchantillon
$$$ : LF1 t0 vs LF1 t240 (p0,001).

***: LF2 t0 vs LF2 t240 (p0,001).


: LF1 vs LS t240 (p0,001).

: LF2 vs LS t240 (p0,001).


Nous notons quil ny pas de diffrence significative entre t0 et t240 dans le lait strile.
Nous notons quil y a une diffrence hautement significative (p0,001) entre LF1, LF2 et
LS la fin de la fermentation.
La diffrence est hautement significative (p0,001) entre le dbut et la fin de lincubation
dans les deux laits ferments.

65

Rsultats
LF2 (p 0,001). Nous avons not une diminution trs significative du pH de lait LF2 (p
0,001) par rapport au lait strile.
2.3. Evaluation de la quantit de protines totales dans les laits ferments compare
celle du lait strile :
La caractrisation physiologique des bactries aprs fermentation du lait est ralise
grce lvaluation de la protolyse par la quantification des teneurs en protines totales.
Pour assurer leur croissance, les bactries dgradent obligatoirement les protines
du lait en peptides et acides amins quelles utilisent comme source dazote au cours de la
fermentation grce leurs enzymes spcifiques (exopeptidases et endopeptidases).
2.3.1. Teneurs en protines totales des laits ferments par Lactobacillus
acidophilus (La) associ des bifidobactries :
Les teneurs en protines totales (g/mg) des laits ferments (LF1 et LF2) compares
celles du lait strile (tmoin) sont reportes dans la figure 15. Nos rsultats montrent une
diminution rgulire de la teneur en protines totales au cours de lincubation dans les
deux laits ferments. Nous navons constat aucune diminution de la teneur en protines
dans le lait strile.
Au temps initial de lincubation, les teneurs en protines totales sont de 287,85
4,42 g/mg ; 298,88 4.32 g/mg ; 302,09 1,79 g/mg respectivement pour le lait LF1,
LF2 et LS. Aprs 4h dincubation, nous avons not une diminution significative dans les
deux laits ferments: 215,89 5,68g/mg (p0,001) dans le lait LF1et 242,44 6,34g/mg
(p0,001) dans le lait LF2. Dans le lait crm strile (tmoin) nous navons remarqu
aucune diffrence entre le dbut et la fin de lincubation (301,86 3,19 g/mg).
Nous notons que la diminution de la teneur en protines totales est significative
dans le lait LF1 par rapport au lait LF2 (p0,001).
En conclusion, les rsultats montrent que les associations bactriennes testes
dgradent diffremment les protines du lait et que cest lassociation (La + B longum) qui
donne le meilleur profil protolytique (p0,001) par rapport au lait LF2 et au tmoin (LS)
(p0,001).

66

Rsultats

Protines totales
(g/mg)

350
300

$$$

250
200

***

150
100
50

Temps (min)

30

60

90

120 150

180

210 240

Figure 15 : Teneur en protines totales (g/mg) dans les laits (LF1, ; LF2, ; LS, ) au
cours de la fermentation 45 C.
LF1 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
LF2 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
LS : Lait strile de vache sans ferment (tmoin).
Les valeurs indiques sont des moyennes erreur standard. (n=5).
n :nombre dchantillon.
*** : LF1 t0 vs LF1 t240 (p0,001).
$$$ : LF2 t0 vs LF2 t240 (p0,001).

: LF1 vs LS t240 (p0,001).


: LF2 vs LS t240 (p0,001).
: LF2 vs LF1 t240 (p0,001).

Nous ne notons aucune diffrence significative entre t0 et t240 de LS.


Nous notons une diminution significative de la teneur en protines totales dans le lait LF1
par rapport au lait LF2.

67

Rsultats
3. Titrage des anticorps IgG sriques anti -Lg :
Une technique de dosage spcifique des anticorps a t utilise pour mesurer la rponse
immunologique des animaux aprs sensibilisation par voie parentrale la -Lg. Il sagit
de la mthode ELISA qui permet dvaluer la rponse immune systmique par la mesure
des titres en IgG spcifiques diriges contre lantigne sensibilisant, la -Lg.
3.1. Contrle de limmunisation chez les souris sacrifies au 28me jours:
Les animaux sacrifis au 28me jour ont diffrents titres en IgG sriques anti--Lg.
Les titres en IgG sriques anti--Lg sont de 1/100me et de 1/460me chez les groupes
gavs au lait LF1 et LF2 respectivement et sont de 1/4600me chez le groupe gav avec une
solution saline (Fig.16).
La figure 16 monte galement que les titres en IgG sriques anti--Lg du groupe
gav au lait LF1 sont significativement diminus (p 0,001) par rapport au groupe gav
avec une solution saline (tmoin positif). De mme, nous constatons une diminution
hautement significative des titres en IgG sriques anti--Lg chez le groupe gav au lait
LF2 (p 0,001) par rapport au groupe gav avec la solution saline.
Par ailleurs, nous ne notons aucune diffrence significative des titre en IgG entre le
groupe (LF1+-Lg ) et le groupe (LF2+-Lg ).
Les rsultats montrent que les IgG sriques anti--Lg ne sont pas dtectables chez
les animaux non sensibiliss (tmoins) (Fig. 16).

68

Rsultats
IgG
Log (1/ Titre)

5
4,5
4
3,5
3

2,5

2
1,5
1
0,5
0

Tmoin

SS + -Lg

LF1+-lg

LF2+-lg

Souris

Figure 16 : Titres en anticorps IgG sriques anti--Lg mesurs chez les souris sensibilises
la -Lg (n=5) par voie sous cutane et chez les souris tmoins (n=5) sacrifies au 28me
jour.
n : nombre danimaux.
SS : solution saline.
LF1 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium bifidum.
LF2 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium longum.
-Lg : Betalactoglobuline.
Titre : le plus faible taux danticorps qui dtecte lantigne sensibilisant aprs diffrentes
dillutions.
: (SS+ -Lg) vs (LF1 + -Lg) ((p 0,001).
: (SS+ -Lg) vs (LF2 + -Lg) (p 0,001).
Les valeurs indiques sont des moyennes erreur standard. (n=5).
Nous notons que les IgG sriques anti--Lg ne sont pas dtectables chez les
animaux non sensibiliss (Tmoin). Les titres des IgG spcifiques atteignent, au moment
du sacrifice, des titres significatifs (p0,001) chez les souris gaves avec une solution
saline puis immunises la -Lg (tmoin positif) par rapport aux groupes de souris gaves
aux laits ferments. Nous ne notons pas de diffrence significative en titres IgG sriques
anti--Lg entre les deux groupes coloniss avec Lactobacillus plantarum et gavs aux laits
ferments.

69

Rsultats
3.2. Contrle de limmunisation chez les souris sacrifies au 50me jour :
Au 50me jour, aprs avoir subit deux rappels la -Lg par voie parentrale, les
titres en IgG sriques anti--Lg sont de 1/280me chez le groupe gav au lait LF1, 1/640me
chez le groupe gav au lait LF2 et 1/64000me chez le groupe gav avec une solution saline
(Fig.17).
Nous constatons que les IgG sriques anti--Lg ne sont pas dtectables chez les
animaux non sensibiliss (tmoins ngatifs) (Fig. 17). Nous ne notons aucune diffrence
significative entre les deux groupes gavs aux laits ferments (LF1 et LF2).
Dautre part, nous constatons que les titres en IgG anti--Lg, dans les srums des
groupes de souris gaves aux laits LF1 et LF2, sont significativement diminus (p 0,001)
par rapport au groupe gav avec une solution saline.
Nos rsultats indiquent galement des titres levs en anticorps anti--Lg chez les
animaux gavs avec une solution saline et immuniss la -Lg. Chez les tmoins, la
recherche des anticorps anti--Lg est ngative.
3.3. Etude comparative de linduction de la tolrance orale la -Lg :
Aprs la colonisation bactrienne de lintestin et le gavage des souris au lait LF1,
les rsultats (Fig 18) montrent quil ny a aucune diffrence significative entre les titres en
IgG anti--Lg dans les srums des souris sacrifies au 28me jour et des srums de souris
sacrifies au 50me jour.
Chez les souris ayant subit une colonisation puis gaves au lait LF2, aucune
diffrence significative nest tablie entre les titres en IgG sriques anti--Lg chez les
groupes sacrifis au 28me jour et les groupes sacrifis au 50me jour.
Par contre, nous constatons quil y a une diffrence hautement significative (p
0,001) entre les IgG sriques anti--Lg des groupes qui ont t gavs avec une solution
saline suivie dune immunisation la -Lg puis sacrifis au 28me jour par rapport aux
groupes sacrifis au 50me jour.
Nous concluons de ses rsultats que les deux laits ferments par les associations :
Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium longum et Lactobacillus acidophilus +
Bifiidobacterium longum ont un effet positif sur linduction de la tolrance orale.

70

Rsultats
IgG
Log (1/Titre)
5
4,5
4
3,5

2,5
2
1,5
1
0,5
0

Souris

Tmoin

SS + -Lg

LF1+-lg

LF2+-lg

Figure 17 : Titres en anticorps IgG sriques anti--Lg mesurs chez des souris sacrifies
au 50me jour et sensibilises la -Lg (n=5) par voie sous cutane compars celui des
souris non sensibilises (n=5) (tmoins ngatif).
n: nombre danimaux.
SS : solution saline.
LF1 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium bifidum.
LF2 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium longum.
-Lg : Betalactoglobuline.
Les valeurs indiques sont des moyennes erreur standard. (n=5).
: SS+ -Lg vs LF1 (p 0,001).
: SS+ -Lg vs LF2 (p 0,001).

Nous notons que les IgG sriques anti--Lg ne sont pas dtectables chez les
animaux non sensibiliss (Tmoin). Chez les souris gaves avec une solution saline puis
immunises la -Lg, le titre des IgG spcifiques atteint au moment du sacrifice des
valeurs leves estimes 1/64000me; il est significativement lev par rapport aux
groupes gavs au lait ferment (p 0,001).
Nous ne notons aucune diffrence significative entre les deux groupes gavs aux
laits ferments.

71

Rsultats
IgG
Log (1/Titre)

4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
SS + -Lg

LF1+-Lg

J28

LF2+-Lg
Souris

J50

Figure 18 : Comparaison des titres en anticorps IgG sriques anti--Lg mesurs chez des
souris gaves puis sensibilises la -Lg par voie sous cutane, sacrifies au 28me jour et
au 50me jour.
n: nombre danimaux.
SS : solution saline.
LF1 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium bifidum.
LF2 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium longum.
-Lg : Betalactoglobuline.
J28 : jour de sacrifice des souris.
J50 : jour de sacrifice des souris.
Les valeurs indiques sont des moyennes erreur standard. (n=5).
: J28 vs J50 (p 0,001).

Nous notons une diffrence significative entre les titres en IgG sriques anti--Lg
des groupes de souris sacrifies au 28me jour et les groupes de souris sacrifies au 50me
jour (SS+ -Lg) (p 0,001). La comparaison de moyennes des titres en IgG sriques dans
les deux groupes de souris gaves aux laits ferments

ne montre aucune diffrence

significative.

72

Rsultats
4. Etude histologique de lintestin des souris immunises compar celui des tmoins:
Cette partie de notre travail a pour but de vrifier les consquences de
limmunisation parentrale sur la structure de lpithlium intestinal, particulirement au
niveau de larchitecture des villosits ainsi que sur la composition en lymphocytes intrapithliaux.
4.1. Effet de la sensibilisation et du gavage sur la structure intestinale des souris
sacrifies au 28me jour :
Les rsultats de leffet du gavage et de limmunisation sur la hauteur des villosits
des souris sacrifies au 28me jour sont reports dans le tableau 9 et la figure 19.
4.1.1.

Aspect

des

muqueuses

intestinales

des

souris

tmoins

au

faible

grossissement (Gx10):
Observe au microscope optique, la muqueuse intestinale dune souris tmoin
apparat forme de nombreuses projections en doigts de gant ; il sagit des villosits
spares par des sillons intervilleux communiquant et dans le fond desquels souvrent les
glandes de Lieberkhn (Fig 20).
Dans la figure 21, la muqueuse intestinale dune souris ayant subi une colonisation
bactrienne pendant 18 jours suivit dun gavage avec le lait LF1 montre quil nexiste
aucune diffrence dans la structure du point de vue histologique. Les valvules conniventes
recouvertes de villosits longues et fines (v) possdent une seule couche dentrocytes et
une musculaire muqueuse (MM) fine et sous jacente aux microvillosits. La sous
muqueuse (S) forme des vaginations formant le cur des valvules conniventes et
constitue le sige des glandes. La surface pritonale de la musculeuse se confond avec les
tissus conjonctifs lches de la sreuse (SR).
4.1.2. Aspect des muqueuses intestinales des souris tmoins au fort grossissement
(Gx40):
La figure 24 et la figure 26 reprsente une observation au fort grossissement des
villosits du jjunum de souris tmoins et de souris ayant subi une colonisation bactrienne
suivie dun gavage aux laits ferments respectivement.
Nos rsultats indiquent quil ny a pas de diffrences dans la structure de la
muqueuse intestinale. Sur le plan structural, ces villosits sont longues fines et bordes par
un pithlium simple, unistratifi, cylindrique. Il est form essentiellement de hautes
cellules plateau stri possdant des noyaux rguliers

en positions basales qui

correspondent aux entrocytes.

73

Rsultats
Tableau 9 : Effet du gavage et de limmunisation sur la hauteur des villosits intestinales
des souris (J28).
Groupe danimaux

Mesure de la hauteur des villosits (m)

TNGNS (n=5)

55,04 0,9

GLF1S (n=5)

54,78 1,42

GLF2S (n=5)

54,53 0,82

GSS (n=5)

46,08 2,02

n : nombre danimaux sacrifis au 28me jour.


GLF1S : Tissus des souris gaves au lait ferment (1) puis stimuls la -Lg.
GLF2S : Tissus des souris gaves au lait ferment (2) puis stimuls la -Lg.
GSS : Tissus des souris gaves avec une solution saline puis stimuls la -Lg (tmoin
positif).
TNGNS : Tissus des souris tmoins non gaves et non stimuls la -Lg (tmoin ngatif).
LF1 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus +Bifidobactrium longum.
LF2 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
Les valeurs reportes sont des moyennes et leur erreur standard (n=5).
: GSS vs TNGNS (p0,001).
: GLF1S vs GSS (p0,001).
: GLF2S vs GSS (p0,001).
Nous notons une diminution significative de la hauteur des villosits intestinales
des souris gaves avec une solution saline puis immunises la -Lg (p0,001) par rapport
aux groupes de souris tmoins.
Nous ne notons aucune diffrence significative de la hauteur des villosits dans les
groupes de souris gaves avec les laits ferments puis immuniss la -Lg (p>0 ,05) par
rapport au groupe tmoin ngatif.

74

Rsultats
Hauteur des
villosits (m)
60

55
50

45
40
35
30
25
20
TNGNS

GSS

GLF1S

GLF2S

Souris

Figure 19: Effet du gavage et de la sensibilisation la -Lg sur la hauteur des villosits
des fragments de jjunum des souris sacrifies au 28me jour compar aux souris non
sensibilise (tmoin ngatif).
n= nombre danimaux.
GLF1S : Tissus des souris gaves au lait ferment (1) puis stimuls la -Lg.
GLF2S : Tissus des souris gaves au lait ferment (2) puis stimuls la -Lg.
GSS : Tissus des souris gaves avec une solution saline puis stimuls la -Lg (tmoin positif).
TNGNS : Tissus des souris tmoins non gaves et non stimules la -Lg.
Les valeurs indiques sont des moyennes erreur standard. (n=5).
: GSS vs TNGNS (p0,001).
: GLF1S vs GSS (p0,001).
: GLF2S vs GSS (p0,001).

Nous notons une diminution significative de la hauteur des villosits intestinales


chez les souris tmoins positifs (p0,001) par rapport aux souris tmoins ngatifs. Cette
diminution est significative par rapport aux souris gaves au lait LF1 et aux souris gaves
au lait LF2 (p0,001).
Nous ne notons aucune diffrence significative des hauteurs des villosits entre le
groupe de souris gaves au lait LF1 et le groupe de souris gaves au lait LF2.

75

Rsultats

Figure 20 : Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris tmoin.
V : villosit intestinale.
Chez le groupe tmoin lpithlium est unistratifi et les villosits sont longues et fines.

Figure 21 : Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris gave avec une solution saline et immunise la -Lg et
sacrifie au 28me jour ( tmoin positif).
Chez le groupe tmoin positif, la villosit jjunale est largie. Le dcollement du chorion
de lpithlium est trs accentu. Linfiltrat lymphocytaire est dense.
76

Rsultats
Le chorion est daspect fibreux et apparat polymorphe possdant divers lments
mononucls, peu abondants et qui correspondent des cellules du systme immunitaire :
les lymphocytes.
La hauteur des villosits chez les muqueuses tmoins varie de 52,48 m 57,6 m
avec une moyenne de 55,04 0,9 m.
4.1.3. Aspect des muqueuses intestinales des souris ayant subi un gavage avec une
solution saline et immunises la -Lg :
Les muqueuses intestinales des souris ayant subi un gavage avec une solution saline
et immunises la -Lg prsentent une atrophie partielle (Fig. 21 et 25). Nous constatons
un lger largissement des villosits jjunales ainsi quun dcollement partiel de
lpithlium du chorion.
Nous notons une diminution significative des hauteurs des villosits qui sont de
46,08 2,02m chez les souris

ayant subit un gavage avec une solution saline et

immunises la -Lg par rapport celles des souris tmoins (55,04 0,9 m) et des
deux autres groupes exprimentaux (54,78 1,42 m et 54,53 0,82 m pour LF1 et LF2
respectivement).
4.1.4. Aspect des muqueuses intestinales des souris immunises la -Lg et gaves au
lait LF1 :
La hauteur des villosits des muqueuses jjunales de souris immunises et gaves
au lait LF1 est de 54,78 1,42 m ; cette hauteur compare celle des muqueuses tmoins
ne montre aucune diffrence significative. Les figures 22 et 26 indiquent trs clairement
lunistratification de lpithelium avec des villosits longues et fines. Linfiltrat
lymphocytaire est peu marqu.
4.1.5. Aspect des muqueuses intestinales des souris immunises la -Lg et gaves au
lait LF2:
Chez les souris ayant subit une colonisation bactrienne, gaves au lait LF2 et
immunises la -Lg (Fig 27), la muqueuse intestinale est comparable celle des souris
ayant t gaves au lait LF1 (Fig.26). Nous constatons que les villosits sont longues, fines
( Fig 23) et linfiltration lymphocytaire est peu marque (Fig. 27), leur hauteur est de 54,53
0,82 m. La comparaison des moyennes ne montre aucune diffrence significative par
rapport au tmoin ngatif.

77

Rsultats
A la lumire de ces rsultats, la structure des muqueuses intestinales montre quil
nexiste aucune diffrence significative entre les hauteurs des villosits des groupes gavs

Figure 22 : Observation microscopique(Gx10) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris gave au LF1 et immunise la -Lg puis sacrifie au 28me
jour.

Figure 23 : Observation microscopique(Gx10) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris gave au LF2 et immunise la -Lg puis sacrifie au 28me
jour.
LF1 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
LF2 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
Chez le groupe gav au LF1 et le groupe gav au LF2, les villosits jjunales sont longues
et fines.
78

Rsultats
La hauteur des villosits chez le groupe gav au LF1 et le groupe gav au LF2 est
comparable celle du groupe tmoin.

Figure 24 : Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris tmoin ngatif.
Chez le groupe tmoin ngatif lpithlium est unistratifi et linfiltrat lymphocytaire est
peu marqu.

Figure 25 : Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris gave avec une solution saline et immunise la -Lg et
sacrifie au 28me jour ( tmoin positif).

79

Rsultats
Chez le groupe tmoin positif, lpithlium est dcoll du chorion. Linfiltrat
lymphocytaire est dense.

Figure 26 : Observation microscopique(Gx40) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris gave au LF1 et immunise la -Lg puis sacrifie au 28me
jour.
Chez le groupe gav au LF1, linfiltrat lymphocytaire est peu marqu.

Figure 27 : Observation microscopique(Gx40) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris gave au LF2 et immunise la -Lg puis sacrifie au 28me
jour.

80

Rsultats
Chez le groupe gav au LF2, linfiltration lymphocytaire est plus au moins marque par
rapport au groupe tmoin ngatif.
avec les laits ferments et le groupe tmoin. Ces rsultats suggrent que la sensibilisation
des souris par la -Lg et le gavage par les laits (LF1 et LF2) ferments par des bactries
probiotiques reste sans effet sur la structure de lpithlium intestinal.
4.2. Aspect des muqueuses intestinales des souris gaves avec une solution saline puis
immunises la -Lg et sacrifies au 50me jour :
Les rsultats de leffet du gavage et de limmunisation sur la hauteur des villosits
des souris sacrifies au 50me jour sont reports dans le tableau 10 et figure 28.
Au 50me jour, nous avons sacrifi les autres groupes de souris et nous avons
prlev la partie jjunale de lintestin sur laquelle nous avons effectu des coupes
histologiques.
Nous constatons (Fig 30) chez le groupe de souris gaves avec une solution saline,
une atrophie partielle des villosits; ces villosits sont largies et bordes par un pithlium
pseudostratifi.
Au niveau des villosits, nous constatons que le dcollement du chorion de
lpithlium est trs accentu et linfiltration des lymphocytes inta-pithliaux est trs
prononce par rapport celle des souris tmoins.
La hauteur des villosits des souris gaves avec solution saline et immunises la
-Lg est de 42,75 2,2 m. Compare celle des tmoins ngatifs (55,04 0,9), cette
hauteur rduite traduit une atrophie partielle (Fig 34).
4.2.1. Aspect des muqueuses intestinales des souris immunises la -Lg et gaves au
lait LF1 :
Nos rsultats (Fig 30 et 34) montrent que les souris gaves au lait LF1 puis
immunises la -Lg, ont des villosits fines et longues dont lpithlium est unistratifi.
Linfiltrat lymphpcytaire est peu marqu.
La hauteur des villosits intestinales de ce groupe est de 54,01 1,1 m ; cette
valeur est non significative compare celle des tmoins ngatifs.
4.2.2. Aspect des muqueuses et des villosits intestinales des souris immunises la Lg et gaves au lait LF2:
Les rsultats obtenus chez ce groupe de souris (Fig 32 et 36), montrent que les
villosits jjunales sont longues avec un lger largissement et bordes dun pithlium

81

Rsultats
unistratifi. Les lymphocytes sont plus ou moins marqus par rapport aux lymphocytes
intrapithliaux des souris tmoins (Fig 29 et 33).
Tableau 10: Effet du gavage et de limmunisation sur la hauteur des villosits intestinales
des souris (J50).
Groupe danimaux

Mesure de la hauteur des villosits (m)

TNGNS (n=5)

55,04 0,9

GLF1S (n=5)

54,01 1,1

GLF2S (n=5)

53,76 1,67

GSS (n=5)

45,05 2,57

Les valeurs rapportes sont des moyennes et leur erreur standard.


n : nombre danimaux sacrifis au 50me jour.
GLF1S : Tissus des souris gaves au lait ferment (1) puis stimuls la -Lg.
GLF2S : Tissus des souris gaves au lait ferment (2) puis stimuls la -Lg.
GSS : Tissus des souris gaves avec une solution saline puis stimuls la -Lg (Tmoin
positif).
TNGNS : Tissus des souris tmoins non gaves et non stimuls la -Lg.
LF1 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus +Bifidobactrium longum.
LF2 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
: GSS vs TNGNS (0,001 p 0,01).
: GLF1S vs GSS (0,001 p 0, 01).
: GLF2S vs GSS (0,001 p 0, 01).
Nous notons une diminution significative de la hauteur des villosits des souris
gaves avec une solution saline puis immunis la -Lg (p0,001) par rapport aux groupes
tmoins.
Nous ne notons aucune diffrence significative de la hauteur des villosits chez les
souris gaves avec les laits ferments puis immuniss la -Lg (p>0 ,05) par rapport aux
groupes de souris tmoins ngatifs.

82

Rsultats
Hauteur des
villosits (m)

60

55

50

45
40
35
30
25
20

Souris

Tmoin

GSS

GLF1S

GLF2S

Figure 28 : Effet du gavage et de la sensibilisation la -Lg sur la hauteur des villosits


de fragments de jejunum des souris sacrifies au 50me jour compare aux souris non
sensibilises (tmoin).
n= nombre danimaux.
GLF1S : Tissus des souris gaves au lait ferment (1) puis stimuls la -Lg.
GLF2S : Tissus des souris gaves au lait ferment (2) puis stimuls la -Lg.
GSS : Tissus des souris gaves avec une solution saline puis stimuls la -Lg (tmoin
positif).
TNGNS : Tissus des souris tmoins non gaves et non stimuls la -Lg.
Les valeurs indiques sont des moyennes erreur standard. (n=5).
: GSS vs TNGNS (0,001p0,01).
: GLF1S vs GSS (0,001p0, 01).
: GLF2S vs GSS (0,001p0, 01).
Nous notons une diminution trs significative de la hauteur des villosits jjunales
du groupe (GSS) par rapport au groupe tmoin et aux groupes (GLF1S) et (GLF2S)
(p<0,001). Nous ne constatons aucune diffrence significative entre les groupes (GLF1S) et
(GLF2S).

83

Rsultats

Figure 29 : Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris tmoin.
Chez le groupe tmoin ngatif lpithlium est unistratifi et les villosits sont longues et
fines.

84

Rsultats

Figure 30 : Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris tmoin positif, sacrifie au 50me jour.
Chez le groupe tmoin positif, la villosit jjunale est largie. Le dcollement du chorion
de lpithlium est trs accentu. Linfiltrat lymphocytaire est trs dense.

Figure 31 : Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris gave au LF1 et immunise la -Lg puis sacrifie au 50me
jour.

85

Rsultats

Figure 32 : Observation microscopique (Gx10) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris gave au LF2 et immunise la -Lg puis sacrifie au 50me
jour.
LF1 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
LF2 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
Chez le groupe gav au LF2, nous notons un lger largissement des villosits jjunales.
La hauteur des villosits chez le groupe gav au LF1 et le groupe gav au LF2 est
comparable celle de groupe tmoin.

Figure 33: Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris tmoin.

86

Rsultats

Figure 34: Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris tmoin positif, sacrifie au 50me jour.
Chez le groupe tmoin lpithlium est unistratifi et linfiltrat lymphocytaire est peu
marqu.
Chez le groupe tmoin positif, la villosit jjunale est largie et raccourcie. Lpithlium
est dcoll du chorion. Linfiltrat lymphocytaire est trs dense.

Figure 35 : Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris gave au LF1, immunise la -Lg puis sacrifie au 50me
jour.

87

Rsultats
LF1 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum.
Chez le groupe gav au LF1, linfiltrat lymphocytaire est peu marqu.

Figure 36 : Observation microscopique (Gx40) dun fragment de jjunum color


lhmalun-osine dune souris gave au LF2, immunise la -Lg puis sacrifie au 50me
jour.
LF2 : Lait ferment par Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium bifidum.
Chez le groupe gav au LF2, nous notons un lger largissement des villosits jjunales
ainsi quune infiltration lymphocytaire plus au moins marque.
La hauteur des villosits est de 53,76 1,67 m ; cette valeur est non significative par
rapport celle des souris non sensibilises (tmoins).
La comparaison des moyennes montre quil ny a aucune diffrence significative
des hauteurs des villosits entre les deux groupes gavs aux laits ferments. Concernant les
villosits jjunales du groupe de souris gaves avec une solution saline puis immunises
la -Lg et des deux groupes de souris gaves aux laits (LF1 et LF2) puis immunises la
-Lg., la comparaison des moyennes montre une diffrence significative (p0,001).
4.2.4. Etude comparative de la hauteur des villosits des souris sacrifies au 28me jour
et des souris sacrifies au 50me jour :
Laspect et la hauteur des villosits jjunales sont deux paramtres cruciaux dans
linterprtation de leffet de la sensibilisation la -Lg des souris gaves avec du lait de
vache ferment avec diffrentes associations de bactries lactiques et bifidobactries
choisis au dpart comme tant des bactries probiotiques. La figure 36 rsume les rsultats
concernant lvaluation de leffet de limmunisation la -Lg sur la hauteur des villosits

88

Rsultats
de fragments de jjunum dans diffrents groupes exprimentaux. Les valeurs obtenues
nvoquent aucune diffrence significative dans tous les groupes et nous constatons que
les rappels de limmunisation la -Lg au 21me et au 35me jour du protocole nont pas
modifi la hauteur des villosits.
Nous avons constat galement que les villosits jjunales du groupe gav avec
une solution saline et immunis la -Lg sont plus largies avec une importante infiltration
lymphocytaire et un dcollement du chorion de lpithlium plus accentu chez les souris
sacrifies au 50me jour compares celles des souris sacrifies au 28me jour.
Chez les souris gaves au lait LF1, immunises la -Lg et sacrifies au 50me jour,
nous avons not une lgre diffrence de la structure, de laspect et de la hauteur des
villosits par rapport aux souris sacrifies au 28me jour.
Nos rsultats montrent que chez les souris gaves au lait LF2 et immunises la Lg puis sacrifies au 50me jour, linfiltration lymphocytaire est plus ou moins marque par
rapport aux souris sacrifies au 28me jour.
Les rsultats de ltude histologique de la muqueuse intestinale suggrent que
linduction de la tolrance orale la -Lg est vidente chez les souris ayant subit une
colonisation avec Lactobacillus plantarum suivit dun gavage au lait LF1 (Lactobacillus
acidophilus +Bifidobactrium longum).

89

Rsultats
Hauteur des
villosits (m)
60
55
50
45
40
35
30
25
20

Souris
GSS

GLF1S

J28

GLF2S

J50

Figure 37 : Evaluation de leffet de limmunisation la -Lg sur la hauteur des villosits


de fragments de jjunum entre les groupes sacrifis au 28me jour et les groupes sacrifis au
50me jour.
n= nombre danimaux.
J28 : groupe de souris sacrifies aux 28me jour.
J50 : groupe de souris sacrifies aux 50me jour.
GLF1S : Tissus des souris gaves au lait ferment (1) puis stimuls la -Lg.
GLF2S : Tissus des souris gaves au lait ferment (2) puis stimuls la -Lg.
GSS : Tissus des souris gaves avec une solution saline puis stimuls la -Lg (tmoin
positif).
Les valeurs indiques sont des moyennes erreur standard. (n=5).
Nous notons quil nexiste aucune diffrence significative des hauteurs des villosits entre
les groupes sacrifis le 28me jour et le 50me jour.

90

Rsultats
5. Dnombrement des lymphocytes intra-pithliaux (LIE) :
Le dnombrement des lymphocytes intra-pithliaux qui permet de comparer le
nombre de ces derniers dans les diffrents chantillons dintestin cest avr difficile sur
nos coupes histologiques et montrent quil y a une grande diffrence dans la structure
entre les intestins de lapin ou de rat par rapport aux souris utilises dans notre protocole.
Le nombre de lymphocytes intra-pithliaux (en pourcentage) a t estim dans les
diffrents tissus et nous avons compar ce nombre (%) celui des tissus de souris tmoin
ngatif.
5.1. Dnombrement des lymphocytes intra-pithliaux chez les souris sacrifies au
28me jour:
Les lymphocytes sont normalement prsents dans lpithlium de surface ainsi que
dans le chorion. Sur lensemble de nos figures, nous remarquons clairement linfiltration
lymphocytaire, mais celle-ci varie selon la nature des solutions de gavage et les fragments
jjunaux mis en contact ou non avec lantigne sensibilisant.
Nous notons que le nombre de lymphocytes intra-pithliaux de souris gaves avec
une solution saline puis immuniss la -Lg est de 50% par rapport au nombre des
lymphocytes de souris tmoins ngatifs.
Chez le groupe de souris stimules la -Lg et gaves avec le lait LF1 le nombre
des lymphocytes intra-pithliaux est proche de celui des souris tmoins, soit 2% de plus
ce qui signifie quil ny a pas de diffrence entre ces deux groupes.
Chez les souris gaves au lait LF2 suivit dune immunisation la -Lg, le nombre
de lymphocytes est peu abondant ; il y a 5% de plus de LIE infiltrs par rapport aux
lymphocytes des souris tmoins ngatifs.
5.2. Dnombrement des lymphocytes intra-pithliaux chez les souris sacrifies au
50me jour:
Limmunisation ainsi que le gavage des souris avec une solution saline provoque
non seulement une atrophie partielle des villosits mais galement une augmentation
considrable de lymphocytes intra-pithliaux soit 80% de LIE supplmentaires compare
aux lymphocytes des groupes tmoins ngatifs (Fig.33). Nous avons remarqu galement
quil existe une diffrence dans le nombre des LIE dans les tissus des groupes de souris
immunises et gaves aux laits (LF1, LF2) et les tissus des groupes de souris immunises et
gaves avec une solution saline.

91

Rsultats
Nous remarquons que le nombre des lymphocytes des souris gaves au lait LF1 et
immunises la -Lg est voisin des lymphocytes des souris non sensibilises (tmoins),
soit 2% de LIE supplmentaires.
Le nombre de lymphocytes intra-pithliaux des souris gaves au lait LF2 et
immunises la -Lg est augment de 8% par rapport aux lymphocytes des souris non
sensibilises.

92

Discussion

Le prsent travail a pour objectif principal dtudier linduction de la tolrance orale,


in vivo, induite par des souches de bactries probiotiques implantes par gavage dans
lintestin de souris pour sa colonisation durant la priode dtermine dans le protocole suivit
dun gavage par deux laits ferments. Il vise lucider certains mcanismes daction par
lesquels les probiotiques stimulent le phnomne immunitaire. Deux modes daction sont
retenus :
Le premier mode daction est que les bactries probiotiques stimulent linduction de la
tolrance orale en dgradant la - lactoglobuline.
Le deuxime mode daction est que les bactries probiotiques stimulent linduction de
la tolrance orale en inhibant la prolifration lymphocytaire.
Ltude microbiologique matre que les bifidobactries utilises sont des bactries
Gram positif, de diffrentes formes cellulaires (bifides, spatules). Nos rsultats sont en
accord avec ceux obtenus par Boudine, 2005 et Hadadji et al., 2005. Ce polymorphisme est
d principalement la composition du milieu de culture (Tamine et al., 1995).
Nos rsultats sont en accord avec ceux obtenus par Guessas & Kihal (2004) qui ont
montr que les lactobacilles sont mtabolisme htrofermentaire. Elles sont Gram positif ;
ce sont de longs btonnets (Lactobacillus acidophilus) ou de courts btonnets (Lactobacillus
plantarum) et anarobiques.
Daprs Bensoltane et al (1997), les bifidobactries se dveloppent 42C en culture
mixte. Il a t montr par Hadadji & Bensoltane (2006) que les bifidobactries se dveloppent
37C comme elles peuvent se dvelopper 45C. Les bifidobactries ont une production
maximale dacide 45C en culture mixte associes Lactobacillus acidophilus et cela est d
aux facteurs bifidognes.
Au cours de la fermentation du lait 45C, des diffrences de l'acidit titrable et du pH
sont observes entre les laits LF1 et LF2 compars au lait strile (tmoin). Les quantits
d'acide produites sont diffrentes tout au long de la fermentation et la fin de celle-ci, la
production dacide dans le lait tmoin demeure significativement infrieure celle des laits
LF1 et LF2. Ces rsultats sont en accord avec ceux obtenus par Chekroun, 2005, sachant que
la production dacide est troitement lie la prsence des bactries lactiques dans le lait.

92

Discussion
Ces cultures utilisent le lactose du lait comme source dnergie pour assurer leur
croissance. Ces bactries transforment le lactose en glucose et galactose puis le glucose est
tout de suite transform en deux molcules dacide lactique et acide actique (Tamine et al.,
1995). Cette transformation du lactose est due laction denzymes provenant des
microorganismes des levains. La quantit dacide produite exprime en degr dornic par litre
de lait (D/l) intervient comme facteur de coagulation du lait; elle est le reflet de lacidit du
ferment (Stadhouders, 1986).
Le pH des laits ferments est diminu au cours du temps de fermentation compar a
celui du lait strile sans ferment ; cette baisse du pH est expliqu par la croissance des
cultures bactriennes utilises comme ferments qui hydrolysent le lactose en acide lactique
et/ou acide actique pour leur nergie. Nous avons constat que la baisse du pH est
significative dans le lait LF1 compar au lait LF2 et le lait strile.
La production dacide entrane une diminution du pH du lait qui a un effet modulateur
sur la croissance des bactries au cours de la fermentation et limite la croissance des germes
pathognes (Gilliland, 1985b ; Payne et al., 1999 ; Boudine, 2005 ; Rouissat & Bensoltane,
2006) comme E. coli, Staphylococcus aureus et Bacillus cereus.
1. Evaluation de lactivit protolytique des bactries au cours de la fermentation :
Dune manire gnrale, lactivit protolytique des bactries au cours de la
fermentation montre que les deux associations bactriennes sont doues dun pouvoir
protolytique des protines du lait de vache et que ce dernier est spcifique de chaque
association qui possde une aptitude propre dgrader la protine intacte.
La meilleure protolyse des protines est obtenue par Lactobacillus acidophilus
associ Bifidobactrium longum (LF1) ; cette protolyse peut sexpliquer par lexistence
dune synergie entre Bifidobacterium longum et Lactobacillus acidophilus (Tamine,1995 ;
Abu-Tarabuche et al., 1998 ; Gomes, 1998 ; Payne et al., 1999).
La strilisation 105C ne rduit pas le taux des protines du lait. Selon Lorient,
2001 ; Pougheon, 2001 ; Chekroun, 2005, il ny a pas de diffrence entre le taux de protines
du lait cru et celui du lait strile.
Lactivit protolytique des lactobacilles est de plus en plus tudie pour son
importance dans la fabrication fromagre et le dveloppement darmes (Bintsis et al., 2003).

93

Discussion
Cependant, plusieurs souches de Lactobacillus paracasei ssp. paracasei montrent le mme
profil dactivit protolytique (Bintsis et al., 2003).
Dautre part, des enzymes dorigine bactrienne sont utilises pour la production de
formules infantiles (Fritsch, 2003). Cependant, lactivit protolytique des bactries lactiques
au cours de la fermentation est une voie importante pour la dgradation des protines du lait.
2. Evaluation de la sensibilisation des souris la -Lg par voie parentrale:
Nous avons choisi la souris, comme modle dtude, car elle est caractrise par un
complexe majeur dhistocompatibilit relativement proche de celui de lhomme et par une
balance Th1/Th2 plus nette et plus facile mettre en vidence que chez lhomme (Magnan &
Vervloet, 1997).
De nombreux modles animaux sont cits dans la littrature pour induire la tolrance
orale. Le modle (souris BALB/c conventionnelle), utilis dans ce prsent travail, a t tudi
par Prioult, 2003.
Ltape initiale a consist induire une tolrance la -Lg chez des souris BALB/c
sensibilises cette protine et gaves avec diffrents laits ferments. Nous avons valu le
degr dimmunisation de ces animaux par dosage ELISA qui a rvl des titres IgG sriques
anti--Lg trs levs chez le groupe de souris gaves avec une solution saline et sensibilises
la -Lg par rapport aux groupes de souris ayant subi une colonisation de lintestin par
Lactobacillus plantarum suivi dun gavage par un lait ferment (souris sacrifies au 28me
jour). Nos rsultats tmoignent dune rponse immunitaire systmique prononce chez les
souris BALB/c prises comme modle animal dinduction la tolrance orale et sont en accord
avec les donnes de la littrature (Prioult et al., 2003) sachant que les IgG ont une prfrence
pour les pitopes conforme la -Lg (Duchateau et al., 1998).
Jedrychowski & Wrblewska (1999), Chekroun, 2005, ont rapport que la
fermentation du lait de vache 45C par des bactries lactiques msophiles et thermophiles
induit une diminution significative de lantignicit vis vis l-lactalbumine, la lactoglobuline et la SAB.

94

Discussion
De nombreuses tudes mentionnent un effet anti-allergique des produits laitiers
ferments, mais peu dauteurs prcisent si cet effet est li lhydrolyse des pitopes
allergniques des protines laitires, ou une modulation de la rponse immune par les
bactries lactiques lorigine de la fermentation (Cross et al., 2001).
Au 50me jours, nous avons sacrifi les autres groupes qui ont reu deux rappels avec la
-Lg. Lvaluation des titres en IgG sriques anti--Lg chez les souris gaves avec une
solution saline et sensibilises la--Lg a montr une importante augmentation du taux des
IgG sriques anti--Lg par rapport a celui obtenu au 28me jour. Nous navons constat aucune
diffrence significative des taux en IgG sriques anti--Lg chez les souris coloniss avec
Lactobacillus plantarum et gaves avec du lait ferment puis sensibilis la--Lg (sacrifies
au 28me jour) par rapport aux souris qui ont reu deux rappels avec la -Lg et sacrifies au
50me jour.
Une meilleur induction de tolrance orale est observe chez le groupe de souris gaves
au lait LF1 (Lactobacillus acidophilus + Bifidobactrium longum) ; ce dernier a produit des
taux bas en IgG sriques anti--Lg. Ces rsultats sont en accord avec les donnes de la
littrature (Prioult et al., 2003 ; Tanaka & Ishikawa, 2004) et montrent que les probiotiques
stimulent linduction de la tolrence orale et prviennent les allergies en dgradant la lactoglobuline. En effet, Moreau & Gaboriau-Routhiau (1996) rapportent quune faible
production dIgG et dIgE anti-ovalbumine a t maintenue chez des souris conventionnelles
pendant plus de trois mois, alors quune augmentation significative du titre en IgG antiovalbumine a t observe trois semaines aprs linduction de la tolrance chez des souris
axniques. Par contre, un faible titre en IgE anti-ovalbumine a t maintenu chez les souris
axniques durant plus de 60 jours aprs la tolrisation.
Il a t montr que linduction dune rponse allergique est dpendante de la dose
dantigne induite par ladjuvant. Cependant, ladjuvant est ncessaire pour lobtention dIgE
dtectables et modifie galement la rponse IgG spcifique (Lifrani et al., 2006) ; mme si
lalun augmente le taux dIgE, la rponse spcifique reste dpendante de lantigne (Newman,
1998).

95

Discussion
3. Aspect histologique des muqueuses intestinales en rponse limmunisation la -Lg,
la colonisation de lintestin et au gavage par un lait ferment par des probiotiques :
Lpithlium gastro-intestinal constitue la premire ligne de dfense de lhte (Basset
et al., 2003). Les mucines scrtes sa surface par les cellules caliciformes sont variables
la fois dans leur quantit mais aussi dans leur nature.
Laspect et la hauteur des villosits jjunales sont deux paramtres cruciaux dans
linterprtation de leffet de la sensibilisation la -Lg des souris gaves avec des laits
ferments et des souris gaves avec une solution saline.
Les rsultats obtenus montrent quen prsence de lantigne sensibilisant, la -Lg
modifie considrablement la structure de la muqueuse intestinale des animaux gavs avec une
solution saline et immunniss la -Lg, par rapport aux animaux tmoins. Ces rsultats sont
en accord avec ceux obtenus par Addou et al., 2004. Chez les animaux immuniss, les coupes
histologiques prsentent une atrophie partielle des villosits avec une importante infiltration
lymphocytaire au niveau du chorion et du lpithlium. Selon Phillips et al., 1987, le nombre
des lymphocytes intra-pithliaux augmente dans lintestin grle des enfants intolrants aux
protines du lait de vache de faon significative par rapport aux enfants tmoins intolrants au
gluten. Lorsque lantigne sensibilisant est limin de lalimentation des 2 groupes denfants,
il a t constat une diminution des lymphocytes intra-pithliaux (Kaczmarski et al., 1989).
Nos rsultats sont en accord avec ces auteurs qui justifient que laugmentation des
lymphocytes intra-pithliaux serait caractristique de lintolrance la -Lg.
Chez le groupe de souris colonises avec Lactobacillus plantarum et gaves avec du
lait ferment puis sensibilises la--Lg, laspect et la structure des villosits nont pas t
modifis dune faon considrable. Nos rsultats sont en accord avec ceux obtenus par
(Simon et al., 2003 ; Dalloul et al., 2003; Jijon et al., 2004) qui ont mont que
ladministration de bactries probiotiques influence ltablissement des lymphocytes T dans la
muqueuse intestinale chez diffrentes espces animales.
Des sous populations de lymphocytes T, appeles cellules T rgulatrices
(CD4+CD25+), comme Tr et Th3, ont t rcemment dcrites (Allez & Mayer, 2004; van
Amelsfort et al., 2004; Rook & Brunet, 2005). Le rle des lymphocytes T rgulateurs
(CD4+CD25+), en particulier, semble intressant dans la tolrance orale. Ces lymphocytes

96

Discussion
scrtent des cytokines anti-inflammatoires telles que lIL-10 et le TGF- qui ont la
particularit de diminuer les rponses Th1 et Th2 (Akdis et al., 2005 ; Chatila, 2005).
Laspect et la structure des villosits intestinales des souris tmoin positif ont chang
au 50

me

jour. Nous avons constat une atrophie importante des villosits par rapport au

tmoin ngatif, avec une dense infiltration lymphocytaire de une raction immunitaire vis-vis de la -Lg . Chez les souris gaves avec du lait LF1, limmunisation la -Lg na pas
deffet sur la structure et la hauteur des villosits intestinales compares avec celles des souris
tmoins ngatif. Il est admis que lintolrance la -Lg, chez lenfant, se caractrise par une
permabilit intestinale leve la protine (Sadi et al., 1995; Heyman et al., 2000;Molkou
,2002).
Selon Prioult et al., 2003, la composition de la flore intestinale, en particulier la
prsence de bactries du genre Bifidobacterium, joue un rle primordial dans la prvention
des allergies ; ladministration orale de certaines souches bactriennes probiotiques semble
avoir un effet bnfique sur linduction de la tolrance orale la -Lg, protine majeur
incrimine dans lAPLV .
La composition de la microflore intestinale des enfants allergiques diffre
quantitativement et qualitativement de celle des enfants sains (Bjrksten et al., 2001 ;
Kalliomaki et al., 2001; Kirjavainen et al., 2002 ; Watanabe et al., 2003). La flore des enfants
allergiques contient moins de bifidobactries et plus de clostridies que les enfants sains, et
cette diffrence se maintient jusqu lge adulte (Apostolou et al.,2001a). De plus, la souche
de B. adolescentis, caractristique de la flore des adultes, est majoritairement retrouve dans
la flore des enfants allergiques alors que B. bifidum prdomine dans la flore des enfants sains
(He et al., 2001).
Hormis leffet observ sur la prvention des allergies, quelques tudes cliniques
rapportent leffet bnfique des probiotiques pour le traitement des allergies. En effet,
ladministration de Lactobacillus rhamnosus GG ou Bifidobacterium lactis Bb12 des jeunes
enfants manifestant des symptmes deczma atopique durant lallaitement maternel, diminue
significativement la svrit de leczma aprs deux mois de traitement (Isolauri et al., 2000).
Leffet bnfique de Lactobacillus rhamnosus GG a t confirm par une rcente tude
clinique effectue par le mme groupe de recherche (Kirjavainen et al., 2003). Ces effets sont,
en partie, expliqus par une diminution de la production dIL-4 (Stas et al., 1996), la
stimulation de lIL-10 (Pessi et al., 2000), laugmentation de la production de TGF- dans le
lait maternel (Rautava et al., 2002), la diminution de la rponse inflammatoire chez les
97

Discussion
patients allergiques (Pelto et al., 1998) et la suppression de la prolifration lymphocytaire en
prsence de Lactobacillus rhamnosus GG (Pessi et al., 1999). Enfin, la combinaison de deux
lactobacilles (L. rhamnosus et L. reuteri) a galement permis de diminuer de faon
significative leczma chez des enfants allergiques (Rosenfeldt et al., 2003). Ces rsultats
obtenus, in vivo, peuvent tre en partie expliqus par une tude ralise in vitro, dmontrant la
capacit de nombreux lactobacilles rduire la scrtion de cytokines de type Th2 par les
cellules mononucles de patients allergiques (Pochard et al., 2002).
Ces rsultats montrent que ladministration, de certaines bactries probiotiques,
amliore la rponse immunitaire vis--vis des antignes alimentaires. Cependant, leurs effets
sur linduction de la tolrance orale aux protines du lait de vache ont t peu tudis.

98

Conclusion
La partie microbiologie de notre travail nous a permis de purifier et de r-identifier

lauthenticit des souches de Bifidobacterium et Lactobacillus utilises, appartenant la


collection du Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et Industrielle. Nos rsultats montrent
que :

Les bifidobactries prsentent un polymorphisme d la composition du milieu. Par


contre, les lactobacilles ne se prsentent que sous la forme de btonnets.

Lvolution de lacidit au cours du temps de la fermentation du lait montre que les


bactries lactiques acidifient le milieu ce qui mne la diminution du pH. Les
bactries utilises prsentent un pouvoir protolytique lev et la meilleure protolyse
des protines du lait est obtenue par Lactobacillus acidophilus associ
Bifidobactrium longum.
Linduction de la tolrance orale, in vivo,chez des groupes de souris BALB/c dont

lintestin a t colonis par Latobacillus plantarum et gaves par deux laits ferments par
lassociation de 2 souches de bactries probiotiques montre que :

Les groupes gavs aux laits ferments produisent un taux bas en IgG sriques anti-Lg par rapport au groupe gav avec une solution saline et immunis la -Lg; cela
confirme que nos laits ferments LF1 (Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium
longum) et LF2 (Lactobacillus acidophilus + Bifiidobacterium bifidum) ont un effet
probiotique et stimulent linduction de la tolrance orale en dgradant la -Lg du lait
de vache.

Ltude histologique nous a montr que la meilleure induction de la tolrance orale est
obtenue chez les souris colonises par Lactobacillus plantarum puis gaves au lait
LF1 (Lactobacillus acidophilus + Bifidobactrium longum). Les lymphocytes intrapithliaux sont peu marqus et les villosits sont longues et fines.

99

Etudier leffet de combinaisons de souches probiotiques afin de formuler des mlanges


efficaces pour linduction de la tolrance.
Etudier dune manire approfondie lactivit mtabolique des souches probiotiques
afin de slectionner les meilleures souches qui hydrolysent les pitopes allergniques
sur diffrents allergnes alimentaires.
Etudier les caractristiques des souches stimulant la tolrance orale.

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