ZAIRA ZYANYA RAMREZ SOTO

Microbiologa
Recombinera en bacterias: ingeniera
del ADN usando recombinacin
homloga

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Microbiologa

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Microbiologa
Ttulo del artculo: Recombinera en
bacterias: ingeniera del ADN usando
recombinacin homloga
Autor: Gustavo Santoyo
Datos:
Microbiologa.
Revista
Latinoamericana Vol. 50, Nos. 1 y 2
Enero - Marzo. 2008 Abril - Junio. 2008
pp. 38 47.
El artculo del cual se hablara a
continuacin es un artculo de revisin
en el cual el tema a abordar es la
recombinera, la cual se define como
una metodologa para la recombinacin
de ADN bacteriano (cromosomal o
plasmdico), esta tcnica no usa
enzimas de restriccin ni ADN ligasas.
La ingeniera gentica tuvo sus inicios
al ser descubiertas las enzimas de
restriccin, ADN ligasa y vectores
plasmdicos (como Pbr322), con ellas
fue posible incursionar en la biologa
molecular y ampliar el conocimiento
sobre
organismos
eucariontes
y
procariontes.
La recombinera es una tcnica que
utiliza la recombinacin homloga y las
funciones de los genes Red del
bacterifago lambda () y as proceder
a los procesos de clonacin y
modificacin gentica. Los genes red de
() son capaces de intercambiar
material gentico entre dos molculas
de ADN con regiones homlogas de 50
pares de bases (pb) o menos, la tcnica
se realiza in vivo, por la transformacin
de la bacteria con ADNcd usando
ologonucletidos sintticos o reginos
amplificadas por PCR con extremos
homlogos a la zona que se desea
amplificar. El artculo se enfoca en la
recombinacin homloga en E. coli, as
como la recombinacin mediada por los
genes red del bacterifago ().

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La recombinacin homloga es el
intercambio reciproco de informacin
gentica entre dos molculas de ADN
idnticas (Szostak y col., 1983). La
recombinacin homloga en E. coli
inicia por medio de las vas de
combinacin: RecBCD, RecFOR y RecET;
el
complejo
RecBCD
inicia
la
recombinacin con ADN de cadena
doble, el complejo RecFOR y otras
protenas inician el proceso usando ADN
que presenta discontinuidades de
cadena sencilla; la va RecBCD es
mucho ms eficiente que RecFOR,
teniendo como principal funcin el
reparar y reiniciar la replicacin de
horquillas atoradas. RecE es una
exonucleasa 5-3 dependiente de
ADNcd, y junto con RecT (promotora del
alineamiento de cadenas sencillas); los
genes recE y recT son parte del prfago
Rac presente en algunas cepas de E.
coli. La funcin final de cada va de
recombinacin es generar extremos de
ADN 3, los cuales son necesarios para
el evento de invasin y apareamiento
de regiones complementarias en el
ADN, etapa dependiente de la protena
RecA.
La protena RecA se une a los extremos
3 iniciando la bsqueda e invasin de
la regin homloga. Durante esta etapa
de la recombinacin; se forma una
estructura de cuatro cadenas de ADN
conocida como el intermediario de
Holliday.

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sencilla (ADNcs), para proceder a la
degradacin de mononucletidos y as
generar extremos 3, estos extremos
son reconocidos por beta en una
direccin de 3-5, beta se une al
ADNcs de ms de 35 nucletidos,
protegiendo
al
ADNcs
de
la
degradacin, a continuacin beta va a
promover el apareamiento y alineacin
de regiones homlogas del ADNcs.

Figura 1.
homloga.

Modelo de recombinacin

Esta estructura la procesa RuvAB o

RecG y es resuelta por medio de un
corte endonucleoltico por la enzima
RuvC.
Finalizando el proceso de intercambio
de informacin, una ADN ligasa sella las
cadenas
y
termina
el
evento
recombinacin homloga.
E. coli necesita del gen recA para llevar
a cabo la recombinacin homloga; en
contraste la recombinacin del fago
es eficiente, esto se le adjudica a que
su genoma tiene los genes de
combinacin Red: exo, beta y gam, los
cuales se hallan en el opern PL del
fago , donde se requiere 50 pb a
contraste de RecA donde se necesitan
ms ADN.
La protena exo del fago es una
exonucleasa que degrada ADN lineal en
direccin 5-3, reconoce los extremos
de ADN de cadena doble (ADNcd) o

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Figura 2. . Modelo de accin de los

genes
red
del
fago
lambda
en
recombinacin

Exo y beta necesitan a gamma para

realizar su funcin; gamma se une a
RecBCD e inhibe sus funciones de
nucleasa y forma el complejo GammaRecBCD.
Con la inhibicin de las
nucleasas (sbcCD, etc.) efectuado por
gamma permite que las secuencias de
ADN exgeno sean ms estables y con
esto se permite integrar en las regiones
homlogas del genoma bacteriano
(plsmido o cromosoma).
El sistema RecET tiene la ventaja de
utilizar extremos muy pequeos de

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homologa, al igual que el sistema ,
ste tiene la desventaja de que la
recombinacin no es muy eficiente. Sin
embargo, ha sido muy til para la
modificacin
de
BACs
(Bacterial
Artificial Chromosomes).
Los genes red de han sido clonados
en plsmidos que contienen orgenes de
replicacin diversos, para facilitar su
uso en bacterias Gram-negativas,
diferentes a E.coli. En el laboratorio del
Dr. Court fue desarrollado un sistema de
recombinera eficiente y verstil, el cual
consta de un prfago que fue
modificado en sus funciones lticas, de
replicacin y carece de los genes
estructurales del fago. Este sistema
contiene los genes red que son
expresados en opern a partir del
promotor pL, y regulado por un represor
sensible a temperatura, el CI857;
cuando
las
clulas
estn
en
temperaturas menores a 37 C el
represor es activo y no hay induccin de
los genes red. Al haber un cambio
momentneo a 42 C durante el
crecimiento celular, el represor CI857 se
desnaturaliza, permitiendo la expresin
del opern de los genes red. Al volver
las clulas a temperaturas de 37 C o
menos, el represor se vuelve activo y
termina la transcripcin del opern pL.
Este sistema permite clonar en vectores
con diferentes orgenes de replicacin,
permitiendo as la expresin de los
genes red en bacterias diferentes a E.
coli.

Figura 3. Sistema de recombinera que

La recombinera presenta ventajas

sobre otras tcnicas usadas para el
mismo
fin;
es
una
herramienta
eficiente, rpida y econmica; los usos

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y aplicaciones de la misma varan y son

muy amplias, algunas de ellas se
enlistan a continuacin:
Recombinera en el cromosoma
bacteriano: se pueden amplificar
cassettes de resistencia por medio de
PCR y ser transformados en cepas
bacterianas que expresen los genes red
del fago . Mediante esta tcnica se han
podido reemplazar segmentos de ADN
de hasta 70 kilobases
Recombinera en plsmidos: se han
intercambiado orgenes de replicacin y
cassettes de resistencia, n, si se desea
clonar o reemplazar cierta secuencia de
ADN en un plsmido, sta debe
contener una regin homloga de ~50
pb y cotransformarse con el plsmido.
La trasformacin conjunta de estas dos
molculas de ADN lineal permite que el
evento de recombinera sea altamente
eficiente.
Recuperacin y clonacin de ADN
cromosomal en plsmidos: Casi
cualquier zona del cromosoma de E.
coli puede ser recuperado y clonado en
un vector por medio de recombinera.
Modificacin genmica por medio
de oligonucletidos de cadena
sencilla:
Pueden
ser
usados
oligonucletidos de tan slo 30 nt para
introducir cambios en la secuencia de
un gen, modificar su expresin, corregir
una mutacin o introducir cualquier tipo
de base. Si se incrementa el tamao del
oligonucletido en 40, 50, 60 o 70 nt, la
eficiencia es varias veces mayor, los
oligonucletidos
que
se
alinean
preferentemente
con
la
cadena
retardada durante la replicacin del
ADN generan ms recombinantes,
mientras que si se alinean a la cadena
lder
o
adelantada
generan
recombinantes a menos frecuencia.

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La recombinera hasta hace poco solo
usaba a E. coli K12, y en la actualidad
se han descrito el desarrollo de
sistemas de recombinera en otras
bacterias gram-negativas (cepas ECEP y
ECEH de E. coli; Salmonella entrica;
Yersinia; Shigella). Fueron modificados
algunos pasos para lograr una mayor
eficiencia de recombinera: optimizacin
del buffer para electroporar, las
condiciones del shock trmico, la
adecuada
posicin
del
marcador
bordeado por las regiones homlogas y
la construccin de un vector especial
(pKM208).
Otro ejemplo interesante del uso de
recombinera en patgenos Gramnegativos, lo representa la construccin
de cepas atenuadas de varios serotipos
en Shigella, se utilizaron el mismo
vector (pKM208) para expresar las
funciones Red de en Shigella. Se logr
suprimir genes localizados en plsmido
y cromosoma; que son importantes en
la virulencia del patgeno.
El desarrollo de la recombinera en E.
coli depende de las funciones Red del
fago . La funcin de estas protenas

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no es universal en bacterias Gramnegativas y Gram-positivas, sta es una

limitante para las aplicaciones de la
recombinera. Por lo tanto se han
buscado alternativas y actividades
anlogas a los genes red de en
bacterias Gram-positivas.
La recombinera est permitiendo que
se revolucione el conocimiento de la
biologa de bacterias como E. coli; el
uso de esta novedosa tecnologa es hoy
en da posible en algunas otras especies
del grupo Gram-negativos.
Actualmente se est desarrollando en
gneros
donde
las
tcnicas
de
modificacin gentica no son tan
adelantadas como en E. coli. Esto
permitir que se aceleren los estudios
de la genmica funcional, incluyendo la
posibilidad de generar colecciones de
mutantes en genomas completamente
secuenciados.
REFERENCIAS:
Santoyo, G. Recombinera en bacterias: ingeniera del
ADN
usando
recombinacin
homloga.
Revista
latinoamericana de microbiologa. Vol. 50, Nos. 1 y 2
Enero - Marzo. 2008 Abril - Junio. 2008pp. 38 - 47

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