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Deteccin de Resonancia Raman de antioxidantes carotenoides en tejido

vivo humano

El aumento de la evidencia apunta a los efectos beneficiosos de los


antioxidantes carotenoides en el cuerpo humano. Varios estudios, por
ejemplo, apoyan el papel protector de la lutena y la zeaxantina en la
prevencin de enfermedades oculares relacionadas con la edad. Si est
presente en altas concentraciones en la regin macular de la retina, la
lutena y la zeaxantina proporcionar pigmentacin en este punto de la retina
sensible a la mayora de la luz, y como resultado de la filtracin de la luz y /
o accin antioxidante, retrasar la aparicin de degeneracin macular con el
aumento de edad. Otros carotenoides, como el licopeno y beta-caroteno,
juegan un papel importante tambin en la proteccin de la piel de los rayos
UV y la radiacin visible de corta longitud de onda. La lutena y el licopeno
tambin pueden tener la funcin de proteccin para la salud cardiovascular,
y el licopeno pueden jugar un papel en la prevencin del cncer de prstata.
Motivado por la creciente importancia de los carotenoides en la salud y la
enfermedad, y reconociendo la falta de cualquier tecnologa no invasiva
aceptado para la deteccin de carotenoides en el tejido vivo humano,
exploramos resonancia espectroscopia Raman como un nuevo mtodo para
la deteccin de carotenoides ptica lser no invasivo. Se revisan los
principales resultados alcanzados recientemente con el enfoque de
deteccin de Raman. Inicialmente se aplic el mtodo para la deteccin de
pigmentos carotenoides maculares, y ms recientemente a la deteccin de
carotenoides en la piel humana y tejidos de las mucosas. El uso de
instrumentos Raman carotenoides piel, medimos la respuesta de
carotenoides de la capa de estrato crneo de la palma de la mano para una
poblacin de 1.375 sujetos y desarrollamos un escner Raman piel porttil
para los estudios de campo. Estos experimentos revelan que los
carotenoides son un buen indicador del estado antioxidante. Ellos muestran
que las personas con alto estrs oxidativo, como los fumadores, y los
sujetos con alta exposicin al sol, en general, han reducido los niveles de
carotenoides en la piel, independientemente de su consumo de
carotenoides en la dieta. Nos encontramos con la tcnica Raman para ser
precisos, especfica, sensible y bien adecuado para clnica, as como
estudios de campo. La tcnica de lser no invasiva puede llegar a ser un
mtodo til para la correlacin entre los niveles de carotenoides de tejido y
riesgo de neoplasias malignas u otras enfermedades degenerativas
asociadas con el estrs oxidativo.

Palabras clave: la espectroscopia Raman, carotenoides, la piel humana,


mcula, antioxidantes, deteccin no invasiva, lutena, zeaxantina, licopeno,
-caroteno
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1. Introduccin
Espectroscopia Raman es una forma muy especfica de la espectroscopia
vibracional que ha sido utilizado rutinariamente para identificar y cuantificar
compuestos qumicos. Molculas carotenoides son especialmente
adecuados para las mediciones Raman, ya que pueden estar entusiasmados
con la luz se superponen sus bandas de absorcin visibles. Bajo esta
condicin de excitacin, exhiben un (RRS) de respuesta muy fuerte
dispersin Raman de resonancia, con un factor de mejora de alrededor de
cinco rdenes de magnitud con respecto a no resonante Raman
spectroscopy.1 Esto permite a uno para detectar los niveles de energa de
vibracin caractersticos de carotenoides a travs de su correspondiente
firma huella espectral incluso en los sistemas biolgicos complejos, como en
el tejido vivo humano. Cualquier fuera de resonancia Raman respuesta de
otras molculas presentes en el volumen de muestreo sera fuertemente
suprimida en estas condiciones y sera enterrado en el ruido de fondo.
Adems, el entorno del tejido de los carotenoides tiene slo un efecto
insignificante sobre la energa de vibracin, con lo que la firma Raman
prcticamente idntica para la molcula aislada de carotenoides, la
molcula en solucin, o la molcula en un entorno celular.

Motivado por la creciente importancia de los antioxidantes carotenoides en


la salud y la enfermedad, y reconociendo la falta de cualquier tecnologa no
invasiva aceptado para la deteccin de antioxidantes carotenoides en el
tejido vivo humano, empezamos a mirar en RRS como un nuevo mtodo
para la deteccin no invasiva, laseroptical. Inicialmente, se aplic este
nuevo mtodo para la deteccin de pigmentos carotenoides maculares (MP),
que se componen de las especies de carotenoides lutena y zeaxantina.
Bound al tejido macular en concentraciones muy altas, se cree que estos
pigmentos a jugar un papel importante en la prevencin de degeneration.2
macular relacionada con la edad Uso de RRS en una geometra de
retrodispersin estamos desarrollando la tecnologa para mediciones in vivo
MP en el laboratorio y clnicos 0,3-6 ensayos independientes que utilizan la
tecnologa Raman ocular para estudios de poblacin y en relacin con
patologas oculares ahora estn en curso en varios sitios worldwide.7-12
Recientemente hemos empezado a desarrollar RRS espectroscopia para la
deteccin de antioxidantes carotenoides en la piel humana y tejido de la
mucosa, 13-16 tejidos donde se cree que otras especies de carotenoides
como el licopeno y beta-caroteno para jugar un importante papel protector,
como en la proteccin de la piel de los rayos UV y la radiacin visible de
onda corta. El carotenoides lutena y el licopeno tambin pueden tener
funciones de proteccin para la salud cardiovascular, y el licopeno pueden
jugar un papel en la prevencin del cncer de prstata. Es concebible que
los niveles de la piel de estas especies se correlacionan con los niveles
correspondientes de los tejidos internos. Estudios clnicos independientes
que utilizan la deteccin Raman de carotenoides en la piel que investigan

posibles correlaciones entre los niveles de carotenoides de la piel y de


mama y el cncer de prstata en grandes bases de sujetos han sido
recientemente iniciado en el Hospital Charit, en Berln, Germany.17

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2 Propiedades pticas y RRS de carotenoides
Los carotenoides son molculas de cadena de carbono de electrones conjugado y son similares a los polienos con respecto a su estructura y
propiedades pticas. Las caractersticas distintivas son el nmero de
enlaces dobles de carbono conjugado (bonos C == C), el nmero de grupos
laterales metilo unidos, y la presencia y la estructura de grupos terminales
conectados. Las estructuras moleculares de algunas de las especies de
carotenoides ms importantes que se encuentran en el tejido humano, junto
con sus espectros de absorcin, se muestran en la Fig. 1. Ellos incluyen caroteno, zeaxantina, licopeno, lutena, y fitoflueno. Las absorciones
electrnicos son fuertes en cada caso, se producen en bandas anchas (~
100 nm de anchura), y cambian a mayor longitud de onda con el aumento
de nmero de longitud de conjugacin eficaz de la molcula
correspondiente. La absorcin de fitoflueno (cinco conjugado C == bonos c)
se posiciona en el UV cercano; -caroteno, lutena, zeaxantina y (11,10 y 11
C == bonos C, respectivamente) se centran en ~ 440 nm, y el licopeno (11
enlaces) picos a ~ 450 nm. Todas las absorciones muestran una
subestructura vibrnica claramente resuelto debido a la dbil acoplamiento
electrn-fonn, con una separacin de ~ 1400 cm-1. Transiciones de
absorcin fuertes, elctrico-dipolo permitidos se producen entre los orbitales
deslocalizados de las molculas del estado fundamental singlete 1 1Ag al
estado excitado singlete 1 1BU (ver recuadro de la Fig. 1).

Fig. 1
Fig. 1
Espectros de absorcin, estructuras moleculares, y el esquema de nivel de
energa de las principales especies de carotenoide que se encuentra en el
tejido humano, incluyendo -caroteno, zeaxantina, licopeno, lutena, y
fitoflueno. Molculas carotenoides, que cuentan con una paridad par inusual
...
En todos los casos, la excitacin ptica dentro de la banda de absorcin 1
1Ag 1 1BU conduce a solamente muy dbil transitions3 luminiscencia (no
mostrado). La eficiencia cuntica extremadamente bajo de la luminiscencia
es causada por la existencia de un segundo estado de singlete excitado, un
estado 1Ag 2, que se encuentra por debajo del estado 1 1BU (ver Fig. 1
recuadro). Despus de la excitacin del estado 1 1BU, la molcula de

carotenoide relaja muy rpidamente, within18 ~ 200 a 250 fs, a travs de


transiciones no radiantes, a este estado inferior 2 1Ag partir de la cual la
emisin electrnica al estado fundamental es la paridad-prohibido
(discontinua, que apunta hacia abajo superior flecha en el recuadro de la
Fig. 1). El bajo 1BU 1 1 1Ag eficiencia resultante de luminiscencia (10-5 a
10-4), y la ausencia de 2 1Ag 1 1Ag de fluorescencia de las molculas, le
permite a uno para detectar la respuesta RRS de las vibraciones
moleculares (que se muestra como slido, abajo flecha apuntando en la
insercin de la fig. 1), sin potencialmente enmascarar las seales de
fluorescencia. Especficamente, RRS detecta las vibraciones de estiramiento
de la columna vertebral polieno, as como la grupos.1 lado de metilo

Para soluciones de tetrahidrofurano de los carotenoides de la Fig. 1


obtenemos los espectros RRS se muestra en la Fig. 2. El beta-caroteno,
zeaxantina, licopeno, lutena y todos tienen seales fuertes y claramente
resueltas Raman superpuestas sobre un fondo dbil fluorescencia, con tres
prominentes lneas Raman Stokes appearing1 en ~ 1525 (C == C
estiramiento), 1159 (C == C estiramiento) y 1008 cm-1 (C-CH3 mecedora
movimientos). En la molcula de fitoflueno de cadena ms corta, slo
aparece el tramo C == C, y se desplaza de manera significativa a
frecuencias ms altas (por ~ 40 cm-1).

Fig. 2
Fig. 2
Resonancia Raman espectros de -caroteno, zeaxantina, licopeno, lutena, y
soluciones fitoflueno, mostrando los tres principales "huella digital" picos
espectrales Raman de carotenoides procedentes de balanceo movimientos
de los componentes de metilo ...
Dispersin Raman no requiere de excitacin resonante, en principio, y es por
lo tanto adecuado para detectar simultneamente las transiciones
vibratorias de todos los compuestos activos Raman en una muestra dada.
Sin embargo, compensacin de resonancia dispersin Raman es un efecto
ptico muy dbil, lo que requiere una intensa excitacin lser, tiempos de
adquisicin de seales de largo, y muy sensible, enfriado criognicamente
detectores. Adems, en los sistemas biolgicos, los espectros tienden a ser
muy complejos debido a la diversidad de compuestos presentes. Este
escenario cambia drsticamente si las bandas de absorcin compuestos
presentan debido a transiciones electrnicas dipolares de las molculas,
particularmente si stos se encuentran en el rango de longitud de onda
visible. Cuando se ilumina con luz monocromtica superpuestas una de
estas bandas de absorcin, la luz dispersada Raman exhibir una mejora
sustancial de resonancia. En el caso de los carotenoides, 488-nm de luz
lser de argn proporciona una mejora extraordinariamente alto de

resonancia de la signals1 Raman del orden de 105. No hay otras molculas


biolgicas que se encuentran en concentraciones significativas en los tejidos
humanos exhibir mejora resonante similar en esta longitud de onda de
excitacin, por lo que en Vivo espectros RRS carotenoides son notablemente
libre de confundir respuestas Raman.

La dispersin Raman es una espectroscopia lineal, lo que significa que la


intensidad de dispersin Raman es escalas linealmente con la intensidad de
la luz incidente IL siempre y cuando el compuesto de dispersin puede ser
considerado como pticamente delgada. Adems, en intensidad de la luz
incidente fija IL, y siempre que los dispersores pueden ser considerados
como pticamente delgada, la respuesta Raman escala con la densidad de
poblacin de los dispersores N (IE) de una forma lineal de acuerdo TO3

Is = N (Ei) R IL.
Aqu, R es una constante cuya magnitud depende de la geometra de
excitacin y coleccin. En los medios pticamente gruesas, como en el
tejido geomtricamente delgada pero pticamente denso, se puede producir
una desviacin de la respuesta Raman lineal de Is frente a la concentracin
N, de ejemplo supuesto-para, debido a la auto-absorcin de la lnea de
Stokes Raman por la fuerte absorcin electrnica . En general, esto puede
tenerse en cuenta, sin embargo, al menos en un intervalo de concentracin
limitado, calibrando la respuesta Raman con fantasmas de tejidos
adecuados.

Espectroscopia RRS tiene una ventaja adicional sobre espectroscopia Raman


ordinaria en la posibilidad de influir en la respuesta Raman por eleccin
juiciosa de la longitud de onda de excitacin. Esto le permite a uno para
mejorar selectivamente la respuesta Raman de una especie de carotenoides
sobre otra en una mezcla de compuestos. Por ejemplo, excitando una
mezcla de fitoflueno y lutena a 450 nm solamente resultara en una
respuesta RRS de lutena (ver Fig. 1), lo que nos permite cuantificar
selectivamente lutena en esta mezcla.

Varias especies de carotenoides estn usualmente presentes en los tejidos


biolgicos complejos. Para la cuantificacin de la respuesta compuesta RRS
lo que es importante para dar cuenta de las respuestas individuales de los
RRS especies excitadas. Puesto que la respuesta RRS, en general, sigue la
forma de la lnea de absorcin, la respuesta individual RRS depende de la
extensin de la superposicin del lser de excitacin con la absorcin. En el
caso de secciones iguales Raman eficaz de dispersin, realizado cuando

emocionante todos los carotenoides en sus respectivos mximos de


absorcin, las respuestas RRS deben aadir. Para verificar esta hiptesis, se
midi espectros RRS de soluciones de -caroteno, licopeno, y una mezcla de
ambos. Los resultados se muestran en la Fig. 3 de soluciones con
concentraciones de carotenoides que son mayores que las concentraciones
fisiolgicas tpicas encontradas en el tejido humano, y vemos que la
respuesta RRS para el carotenoide es aproximadamente igual a la suma de
las respuestas de las concentraciones individuales.

Fig. 3
Fig. 3
Espectros de absorcin y las respuestas de resonancia Raman para las
soluciones de -carotenos, licopenos, y una mezcla de ambos. La respuesta
Raman para la mezcla corresponde a la suma de las respuestas de las
concentraciones individuales, medidos con 488 nm de excitacin. ...
La especificidad de RRS para la deteccin de carotenoides se ilustra en la
Fig. 4, donde la respuesta del RRV en el C == C rango de frecuencia de
estiramiento se muestra para soluciones frescas de -caroteno, junto con
los compuestos noncarotenoid cido ascrbico y -tocoferol. Mientras que la
respuesta Raman de la solucin de carotenoides aumenta al aumentar la
concentracin, no se observa respuesta Raman para los antioxidantes
noncarotenoid.

Fig. 4
Fig. 4
Respuestas RRS en la zona espectral de la C == C frecuencia de tensin,
medida por diversos antioxidantes como una funcin de la concentracin en
etanol bajo excitacin y deteccin idntica condiciones- , -caroteno; , ...
Para evaluar la respuesta relativa RRS para varios carotenoides que se
encuentran en el tejido humano tales como la piel, preparamos soluciones
etanlicas de -caroteno, lutena, zeaxantina y licopeno, y se midi su
respuesta en un intervalo de concentracin de gran tamao. Los resultados
se muestran en la Fig. 5 y revelan una respuesta lineal en un rango de
concentracin muy grande que supera las concentraciones de carotenoides
que se encuentran en la piel humana. Pequeas variaciones en las laderas
de las soluciones de carotenoides en la muestra se encuentran en muy buen
acuerdo con sus respectivas eficiencias de excitacin.

Fig. 5

Fig. 5
RRS respuesta de varias soluciones de carotenoides bajo excitacin 488 nm,
que se muestran como una funcin de concentraciones crecientes llena de
tringulo, -caroteno; tringulo abierto, zeaxantina; abrir cuadrado, lutena;
y el crculo abierto, el licopeno. La respuesta ...
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3 Deteccin de Raman de Macular Pigmentos
3.1 Macular Pigmentos y mtodos de medicin existentes

Se ha planteado la hiptesis de que el macular pigmentos carotenoides


lutena y zeaxanthin19,20 podran desempear un papel en el tratamiento y
prevencin de degeneration21,22 macular relacionada con la edad (AMD).
En los Estados Unidos, esto causa principal de ceguera afecta a ~ 30% de
los ancianos mayores de 70 aos de edad Anlisis de los ojos relacionada
con la edad Disease Study (AREDS) datos reportados en las reuniones
clnicos recientes han confirmado los hallazgos epidemiolgicos iniciales de
la enfermedad de Control de la caja de los ojos study23,24 que el consumo
elevado de frutas y verduras ricas en lutena y zeaxantina se asocian con un
riesgo relativo significativamente menor de AMD. Los resultados fueron lo
suficientemente convincentes que un estudio AREDS II est previsto que
incorporar la lutena y / o suplementacin zeaxantina en un placebo
aleatorizado a gran escala controlado ensayo clnico prospectivo. Anlisis
Qumicamente [cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)] de los ojos
de cadver humano con y sin antecedentes conocidos de AMD asimismo
demuestra una correlacin entre los niveles bajos de la lutena y la
zeaxantina y risk25 de AMD, y reciente fotometra de parpadeo y la
resonancia Raman estudios clnicos alcanzados el mismo conclusion.6,26

Los estudios espectroscpicos de secciones de tejido de mculas primate


[las centrales de 5 a 6 mm de la retina, ver fig. 6 (a)] indican que hay muy
altas concentraciones de pigmentos carotenoides, que se muestran como
rea sombreada en la Fig. 6 (b), en la capa de fibras de Henle la fvea y
cantidades ms pequeas en la capa plexiforme interna, 27 [vase la Fig. 6
(b)]. Los mecanismos por los que estos dos pigmentos maculares, derivados
exclusivamente de fuentes dietticas como las verduras de hoja verde y
frutas y verduras de color naranja y amarillo, podran proteger contra la
DMAE todava no est claro. Ellos son conocidos por ser excelentes
antioxidantes radicales libres de barrido en un tejido en alto riesgo de dao
oxidativo debido a los altos niveles de exposicin a la luz, y abundante
lipids.21,22,28,29 altamente insaturado Adems, ya que estas molculas
absorben en el rango espectral azul-verde, actan como filtros que pueden

atenuar el dao fotoqumico y / o degradacin de la imagen provocada por


la luz visible de onda corta de llegar a la retina.30

Fig. 6
Fig. 6
(A) fotografa del fondo de ojo de la retina humana sana, que muestra la
cabeza del nervio ptico (punto brillante a la izquierda) y la mcula [rea
sombreada oscura esbozar pigmento macular (MP) distribuciones], y (b)
Representacin esquemtica de las capas de la retina que participan en la
absorcin de luz,. ..
Existe un considerable inters para medir los niveles de MP no invasiva en la
poblacin anciana de determine26 si los bajos niveles de MP se asocian con
un mayor riesgo de DMAE. Actualmente, el mtodo no invasivo ms
utilizado para medir los niveles de MP humanos es una prueba subjetiva
fotometra psicofsica parpadeo heterochromatic la participacin de la
intensidad del color a juego de un haz de luz dirigido a la fvea y otro
destinado a la area.31 perifoveal Sin embargo, este mtodo es bastante
tiempo consumiendo y requiere una alerta, sujeto cooperativo con una
buena agudeza visual, y pueden exhibir una alta variabilidad intrasujeto
cuando las densidades de pigmento macular son bajos o si la patologa
macular significativo se present.32 Por lo tanto, la utilidad de este mtodo
para evaluar los niveles de pigmento macular en los ancianos poblacin con
mayor riesgo de AMD es muy limitada. Sin embargo, los investigadores han
utilizado la fotometra de parpadeo para investigar cuestiones importantes,
como la variacin de la densidad del pigmento macular con la edad y la
dieta. En un estudio reciente fotometra de parpadeo, por ejemplo, la
densidad del pigmento se encontr a aumentar ligeramente con la edad, de
33 aos, mientras que otros estudios encontraron el trend.34 opuesta

Un nmero de tcnicas objetivas para la medicin de la MP en la retina


humana se han explorado recientemente como alternativas a las pruebas
psicofsicas subjetivos. Los principios subyacentes de la ptica de estas
tcnicas se basan ya sea en fundus reflexin o fluorescencia del fondo de
ojo espectroscopia (autofluorescencia). En reflectometra fundus tradicional,
que utiliza una fuente de luz con un amplio continuo espectral, espectros de
reflectancia de la retina blanqueada se miden por separado para fvea y
perifovea. La absorcin de doble camino de la MP se extrae de la relacin de
los dos espectros mediante la reproduccin de su forma espectral en un
procedimiento de ajuste utilizando multiparamtrico de absorcin adecuado
y dispersando los perfiles de las diversas capas del tejido del fundus
atravesados por la fuente light.35-38 Una de las variantes de imgenes de
fondo de ojo reflectometra utiliza un reflectmetro de imgenes de fondo
de ojo con sede en TV con secuencial, estrecho ancho de banda de

excitacin de luz en el rango de longitud de onda visible y fondo digitalizado


images.39 Otra variante poderosa utiliza un oftalmoscopio lser de
exploracin, 40,41 empleando trama de exploracin de la fondo de ojo con
longitudes de onda de excitacin lser discretos para producir informacin
muy detallada sobre el distribution42-46 espacial de MP (y fotopigmentos).
En espectroscopia de autofluorescencia, lipofuscina en el epitelio
pigmentario de la retina se excita con luz dentro y fuera de la gama de
longitudes de onda de la absorcin del pigmento macular. La medicin de
los niveles de fluorescencia lipofuscina para fvea y perifovea, una
estimacin de la absorcin de un solo paso de MP puede obtained.47,48 En
un reciente estudio, la comparacin de reflectometra, oftalmoscopia lser
de barrido (SLO) y el parpadeo fotometra en la medicin de la lutena
macular captacin, SLO se encontr que era superior a la reflectancia
espectral del fondo de ojo mientras que las mediciones psicofsicas
produjeron variando ampliamente results.38,49

3.2 Ocular Raman Mediciones

Hemos investigado RRS como una novela Approach2 para la medicin de los
niveles de MP en vivir eyes.50,51 la tcnica es objetivo, as como no
invasiva, parece ser rpido y cuantitativo, y su especificidad para
carotenoides significa que podra ser utilizado para los pacientes con una
variedad de patologas oculares.

In vivo espectroscopia RRS en el ojo se aprovecha de varias propiedades


anatmicas favorables de las estructuras de tejido se encuentran en las vas
de dispersin de luz. En primer lugar, el principal sitio de deposicin de
carotenoides macular en la capa de fibras Henle es del orden de tan slo
100 m de thickness.27 Esto proporciona una distribucin cromforo se
asemeja muy de cerca una pelcula pticamente delgada que no tiene autoabsorcin significativa de la luz iluminada o dispersas . En segundo lugar,
los medios oculares (crnea, cristalino, humor vtreo) son por lo general de
la claridad suficiente para no atenuar la seal, y deben requerir factores de
correccin adecuadas slo en casos de patologa sustancial como cataratas
visualmente significativas. En tercer lugar, ya que los carotenoides
maculares estn situados en sentido anterior en la va ptica a travs de la
retina [ver Fig. 6 (b)], la luz que ilumina y la luz retrodispersada Nunca tuve
ningn pigmentos altamente absorbentes tales como la rodopsina
fotorreceptores y RPE de melanina, mientras que la luz no absorbida por los
carotenoides maculares y el Delantero y luz dispersada lado ser absorbido
eficientemente por stos pigments.3 En contraste, la emisin de lipofuscina
utilizado en autofluorescencia (AF) basados en mediciones de MP debe
atravesar la capa de fotorreceptores [ver Fig. 6 (b)].

Nuestros "prueba de principio" estudios iniciales de la espectroscopia


Raman de resonancia carotenoide ocular emplearon una laboratorygrade de
alta resolucin espectrmetro Raman y retinas de cadver humano-planas
montada, ojeras humanos, y algunos ojos de rana enteros. Hemos sido
capaces de grabar caracterstica espectros RRS de carotenoides a partir de
estos tejidos con una resolucin espacial de aproximadamente 100 micras, y
fuimos capaces de confirmar la linealidad de la respuesta mediante la
extraccin y el anlisis de los carotenoides de tejido por HPLC despus de la
finalizacin de la measurements.2 Raman Para experimentos in vivo y el uso
clnico, hemos desarrollado un nuevo instrumento con una menor resolucin
espectral pero altamente rendimiento mejorado luz. La versin ms reciente
de instrumentos, que se muestra esquemticamente en la Fig. 7 (a),
consiste en un lser de argn refrigerado por aire de baja potencia, que
proyecta un 1 mm de dimetro, 1,0 mW, punto 488 nm en la regin foveal
durante 0,2 s a travs de una luz retrodispersada pupil.4
farmacolgicamente dilatada en 180 grados es colimada con una lente, la
luz dispersada en la longitud de onda de excitacin de lser es rechazada
por un filtro de paso de banda de alta eficiencia, y el resto se enruta a
travs de la fibra ptica a una combinacin de cmara espectrgrafo / CCD
Raman. El instrumento est interconectado a un ordenador personal
equipado con software de diseo personalizado que puede restar la
fluorescencia de fondo y cuantificar la intensidad de los picos Raman. Se
pidi a los sujetos humanos que viven a fijarse en un objetivo adecuado
para asegurar la auto-alineacin, mientras que en experimentos con monos,
se utiliz un sistema de vigilancia de vdeo adicional y haz de encuadre
lser rojo para confirmar la orientacin foveal. El instrumento puede ser
calibrado contra soluciones de lutena y zeaxantina en cubetas de cuarzo de
1 mm pticamente delgados colocados en el punto focal de una lente cuyo
poder duplicar la ptica de refraccin del ojo humano. Respuesta del
detector fue lineal hasta densidades pticas de casi 0,8, mucho ms all de
los niveles de carotenoides que normalmente se encuentran en la mcula
humana. Usando viven ojos mono, linealidad de la respuesta en los niveles
de iluminacin lser "segura" de los ojos de nuevo se pudo establecer
relacin con el anlisis de HPLC, como podemos ver en la figura. 8, en la
que traz la respuesta RRS de seis retinas mono frente datos3 HPLC
derivada

Fig. 7
Fig. 7
(A) Esquema de macular detector de resonancia Raman pigmento diseado
para los estudios clnicos en humanos. La luz procedente de un lser de
argn se enruta a travs de fibra ptica en una cabeza de la sonda ptica
(se indica por la lnea de trazos) y desde all en el ojo de un sujeto ...

Fig. 8
Fig. 8
La correlacin de seales RRS obtenidos para el C == C doble vibracin
bono a 1525 cm-1 con el contenido de carotenoides de retinas seis mono
segn lo determinado por HPLC. Un ajuste lineal a los resultados de los
datos en un coeficiente de correlacin de 0,68.
Espectros Tpica RRS, medida desde la mcula de un voluntario humano
sano, medida con pupila dilatada, se muestran en la Fig. 7 (c). El panel de la
izquierda de esta figura muestra un espectro tpico obtenido a partir de una
sola medicin y revela claramente seales Raman carotenoides
superpuestas en una dbil y espectralmente amplio fluorescencia de fondo.
El fondo es causada en parte por la debilidad de la fluorescencia intrnseca
de carotenoides, y en parte por la longitud de onda corta cola emisin de
fluorforos lipofuscina depositadas en la capa del epitelio pigmentario de la
retina. La relacin entre las intensidades de la carotenoide C == C pico
Raman y la fluorescencia de fondo es lo suficientemente alta (~ 0,25) que
es fcilmente posible cuantificar la amplitud de la C == C pico despus de
sustraccin de fondo digital [panel de la derecha de la figura . 7 (c)].
Espectros de carotenoides RRS obtenida de la mcula humano vivo eran
indistinguibles de los espectros procedentes de soluciones espectros RRS de
lutena pura o solutions.6 zeaxantina

3.3 Consideraciones de seguridad lser

Para cumplir con las normas de seguridad ANSI, los niveles de exposicin
oculares utilizados en nuestro instrumento Raman tienen que permanecer
por debajo de ciertos niveles de umbral especificados. De acuerdo con el
ltimo nmero, 52 ANSI Z136.1-2000, los niveles de exposicin ocular debe
limitarse a proteger el ojo, tanto de la lesin de la retina fotoqumicamente
y trmicamente inducida en las condiciones de medicin (luz visible cerca
de 0,5 micras, ojos inmovilizados, tiempo de exposicin de 0,25 s). El lmite
fotoqumico para la lesin de la retina (Sec. 8.3.1 de directrices ANSI) se
enumera como CB 2,7 J / cm2, donde CB es un factor de correccin de
longitud de onda, y los resultados en 15,5 J / cm2, utilizando CB = 5,75 para
488 nm. El lmite trmico para la lesin de la retina (Sec. 8.3.2.), Vlido para
un tiempo de exposicin 0,07 <t <0,7 s, deben calcularse desde el punto
lser presentes en la crnea, y aparece como 1.8 ( / 1.5) t0 0,75 mJ / cm2.
Aqu, es el ngulo de la fuente de lser en la ubicacin del espectador,
medido en milirradianes. El uso de t = 0,07 s y = 58,8 10-3 rad, se
obtiene una densidad de energa de 9,6 mJ / cm2 a la crnea para el lmite
de exposicin trmica de la retina.

En una medicin-exposicin nica tpica con nuestro instrumento (0,25 s


exposicin ocular con la luz de 1 mW a 488 nm), una energa lser total de
0,25 mJ se proyecta en un lugar de 8 mm de dimetro en la crnea, y un 1
punto -mm-dimetro en la retina. Esto corresponde a un nivel de exposicin
de la retina de 32 mJ / cm2, que es 480 veces menor que el lmite
fotoqumico 15.5-J / cm2. Para la exposicin ocular utilizado, se calcula un
nivel de 0,5 mJ / cm2, considerando que la energa de la luz de 0,25 mJ se
distribuye sobre un dimetro de tamao de punto de 8 mm en la crnea; Por
lo tanto, este nivel de exposicin es de 19 veces por debajo del lmite
trmico de 9,6 mJ / cm2 para la lesin de la retina.

3.4 Resultados clnicos

Se midi los niveles de pigmento macular carotenoide de cientos de seres


humanos en el Centro Oftalmolgico Moran de la Universidad de Utah
utilizando espectroscopia de RRS. La mayora de los pacientes pueden
realizar fcilmente la prueba con intrasesin aceptable y intersesin
repetibilidad de 10%, siempre y cuando han conservado fijacin central
(tpicamente una agudeza visual de 20/80 o mejor). Los sujetos observaron
una estela central desde la iluminacin lser despus de cada medicin que
se sentan era similar a la de un flash de la cmara. Esta imagen residual
generalmente se desvaneci en un minuto o dos. Los sujetos con
opacidades de medios densos, como las cataratas visualmente significativas
o con mala dilatacin pupilar de <6 mm fueron generalmente excluidos de
las mediciones en nuestros estudios clnicos porque encontramos sus
mediciones sean artificialmente bajos.

Cuando medimos una gran poblacin de sujetos normales, ninguno de los


cuales estaban consumiendo suplementos que contienen cantidades
sustanciales de lutena o zeaxantina, encontramos un sorprendente
descenso del promedio de los niveles de carotenoides maculares con la
edad, 3 veces un fenmeno observado con otros MP medicin
techniques.12, 53 Parte de este descenso se explica por "amarillenta" del
cristalino con la edad, lo que atenuara parte de la luz que ilumina y
retrodispersados, pero tambin encontr consistentemente bajos niveles MP
incluso en pacientes que haban tenido previamente una ciruga de
cataratas con implante de pticamente transparente lenses3 intraocular
protsica (pseudofaquia). Tambin, hemos observado que los pacientes con
cataratas unilaterales despus de un traumatismo o la reparacin del
desprendimiento de retina suelen tener RRS muy similares niveles de
carotenoides en el normal y en el ojo pseudofquico. Por lo tanto, llegamos
a la conclusin de que hay una disminucin de los carotenoides maculares
que alcanza un estado de equilibrio baja justo en el momento en que la

incidencia y prevalencia de AMD comienza a aumentar de manera


espectacular. La conclusin se ve confirmado por el anlisis HPLC reciente
MP en 49 ojos extirpados donantes, donde encontramos una disminucin de
los niveles de MP con la edad (datos no publicados). Estos resultados
tambin ponen de relieve la importancia de asegurar que las poblaciones
estn correctamente emparejados por edad utilizando espectroscopia de
RRS en estudios de casos y controles.

Un ejemplo para RRS mediciones clnicas de un subgrupo relativamente


joven (33 ojos), de edades comprendidas del 21 al 29 anos se muestra en la
figura. 9. Si bien las reducciones MP dependientes de la edad an no se
pueden ver en este grupo de edad, una observacin sorprendente es el
hecho de que los niveles medidos MP-RRS varan drsticamente entre los
individuos (el cambio ~ 10 veces). Dado que las propiedades de transmisin
oculares en este grupo de edad se puede suponer que ser muy similares, las
variaciones se pueden atribuir a diferentes niveles fuertemente MP. Esta
conclusin se ve apoyada por el hecho de que vemos la misma variacin
drstica entre los niveles de MP individuales con fotometra de parpadeo,
una tcnica que se correlaciona con Raman measurements.12,54 Los
sujetos con niveles extremadamente bajos de carotenoides pueden estar en
mayor riesgo de desarrollar degeneracin macular ms tarde en la vida.

Fig. 9
Fig. 9
Mediciones RRS MP de 33 ojos normales para un joven grupo de sujetos con
edades 21-29 de aos. Tenga en cuenta el gran tamao (~ 10 veces) la
variacin de los niveles de RRS entre los individuos. Dado que las
propiedades de transmisin oculares en este grupo de edad puede
suponerse que ...
Se compararon varias poblaciones diferentes con patologa macular
significativo frente a los controles de la misma edad. Pacientes con DMAE
que no consumen regularmente suplementos de lutena o zeaxantina,
tuvieron mediciones Raman carotenoides maculares 32% ms bajos que los
de la misma edad controls.6 Curiosamente, los pacientes con DMAE que
haban estado consumiendo suplementos de lutena en dosis altas (4 mg /
da) durante al menos 3 meses despus de su diagnstico de AMD tena
niveles de carotenoides maculares que en promedio seran considerados
normales para su edad. Estos resultados son un gran apoyo de la hiptesis
de que los niveles de carotenoides maculares bajos pueden ser un factor de
riesgo para AMD y que los niveles de pigmento macular se pueden modificar
a travs de suplementos, incluso en una poblacin de ancianos con
patologa macular significativo.

Fig. 10
Fig. 10

Ir:

Fig. 11
Fig. 11

12 (a).

Fig. 12
Fig. 12

Fig. 13
Fig. 13

Fig. 14
Fig. 14
...
Fig. 15
Fig. 15
...

Como se ve en la Fig.

Fig. 16
Fig. 16
...

Fig. 17
Fig. 17

Fig. 18
Fig. 18

Ir:
5. Conclusiones