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MICROBIOLOGICA DE PLANTAS
MEDICINALES Y PRODUCTOS
FITOFARMACEUTICOS
Armando Cceres
Facultad de CCQQ y Farmacia, Univ. de San Carlos y
Laboratorio de Productos Naturales Farmaya,
Comisin Asesora de Productos Naturales (CAPRONAT)
Guatemala. E-mail: acaceres46@hotmail.com
IDENTIDAD
Etnobotnica
PRODUCCION
Agrotecnologa
BP
Articulacin
UTILIZACION
Fitoterapia
VALIDACION
Biomedicina
Regulacin
TRANSFORMACION
Fifofarmacia
FITOTERAPIA:
Cadena de servicios
multidisciplinarios
FACTORES DETERMINANTES DE
CALIDAD DE PLANTAS MEDICINALES
VARIABLE
g
g
g
g
g
g
g
Genotipo
Desarrollo
Morfognesis
Ambiente natural
Ambiente humano
Proceso
Contaminacin
EJEMPLOS DE AGENTES
Especies, cultivar
Crecimiento, floracin
rgano, tejido
Fertilidad del suelo, luz,
temperatura, competencia
poca de corte (fase lunar)
Manejo de desechos, hbitos
Secado, destilado, extraccin
Fsica, biolgica, qumica
A apartir de Mth A & Franz C (1999) J Herbs, Species & Med Plan 6:101-113.
FACTOR
Disponibilidad
Manipulacin agro
Adulteracin
Identificacin
Aprovicionamiento
Mejoramiento gentico
Control de calidad
Manejo postcosecha
SILVESTRE
CULTIVADA
Disminuyendo
No
Frecuente
Poco confiable
Inestable
No
Pobre
Pobre
Aumentando
Si
Rara
Inquestionable
Constante
Si
Alto
Bueno
DESHIDRATADO VEGETAL
Parmetros a controlar
z
z
z
z
z
z
z
z
70s
80s
PROCESAMIENTO POSTCOSECHA Y
PRDIDA DE PRINCIPIOS ACTIVOS
Los procesamientos poscosecha tienen por objeto la
conservacin de las caractersticas fsicas, qumicas,
organolpticas y farmacolgicas de la droga vegetal.
Los factores que inciden en la prdida son:
Degradacin por procesos metablicos
Hidrlisis de principios activos
Descomposicin por la luz y por enzimas
Degradacin de substancias termolbiles por calor
Volatilizacin de los aceites esenciales
Contaminacin por hongos y bacterias
ECOLOGIA MICROBIANA
Efecto en la industria farmacutica
9
9
9
9
9
z
9
9
9
9
9
9
Atmsfera
Recuentos microbianos
Reduccin del recuento
Desinfeccin qumica
Irradiacin UV
Aire comprimido
Agua
Fuentes de agua
Calidad del agua usada
Desages y aguas negras
Ablandamiento de agua
Sistema de distribucin
Almacenaje de agua
9
9
z
z
z
9
z
9
9
9
z
Flora respiratoria/drmica
Transferencia de operarios
Diseo de reas
Materias primas
Empacado
Edificios
Paredes y cielos
Equipos
Material de colecta
Lavado y desinfeccin
Chequeo microbiano
Equipos de limpieza
MATERIA MEDICA/
DROGA VEGETAL
g
g
CALIDAD MICROBIOLOGICA
NIVEL DE RIESGO
Ninguno a bajo
Alto
Alto
Bajo a mediano
Ninguno a bajo
Bajo a mediano
Generalmente ninguno
CALIDAD MICROBIOLOGICA
Factores determinantes
INTRINSECOS
z
Naturaleza de la planta
y barreras naturales.
Estructura de la planta
Composicin de la
planta (compuestos
antimicrobianos)
Contaminacin
intracelular microbiana
EXTRINSECOS
z Clima
z Humedad
z Ubicacin/Posicin
z Mtodo de cosecha
z Poscosecha
z Estado fsico
z Tratamiento tecnolgico
z Empaque/almacenaje
z Contaminacin
bacteriana exgena
VALIDACION DE METODOLOGIA
Cepas y medios selectivos recomendados
Para validar el mtodo, cultive las cepas de referencia en los
medios de cultivo sugeridos a 30-35C durante 18-24 horas
(Candida spp. 20-25C por 48 horas), diluya en solucin salina
amortiguada a una suspensin de 103 microorganismos/ml.
MICROORGANISMO
Bacillus subtilis
Candida albicans
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella abony
Staphylococcus aureus
CEPA
ATCC 6633
ATCC 2091
ATCC 8739
ATCC 9027
NCTC 6017
ATCC 6538
MEDIO
Soya-Caseina
Caldo Sabouraud
Caldo lactosado
Soya-Caseina
Caldo lactosado
Soya-Caseina
CUANTIFICACION DE
MICROORGANISMOS
TECNICA
CARACTERISTICAS
Recuento en cmara
Citometra de flujo
Nmero ms probable
Siembra cuantitativa
Filtracin por membrana
Fluorometra
Fluorocult/cromocult
esporas, protozoos
equipo sofisticado
determinacin en tubo
en tubo o en placa
proceso en serie
equipo sofisticado
rapidez, alto costo
PRUEBA DE PUREZA
Recuento total de aerbicos viables en placa
g
g
TUBOS MULTIPLES
Equipo y materiales
EQUIPOS Y MATERIALES
FUNGIBLES
9
9
9
9
9
9
9
9
9 Pipetas estriles de 1
Incubadora a 35oC
Incubadora a 44oC
Campana bacteriolgica
Mechero
Autoclave
Gradillas
Asas bacteriolgicas
Campanas de Durham
ml en 0.1 ml
en frascos de 9 a 90 ml
9 Tubos con 9 ml de
caldos: Lactosado,
Caldo Bilis Verde
Brillante y EC
9 Agar MacConkey
RECUENTO MICROBIANO
Clculo del nmero ms probable (NMP)
0.1 ml/ 0.01 ml/ 0.001 NMP/g
tubo
tubo ml/tubo o ml
3*
3
3
>1,100
3
3
2
1,100
3
3
1
500
3
3
0
200
3
2
3
290
3
2
2
210
3
2
1
150
3
2
0
90
0.1 ml/
tubo
3
3
3
3
3
3
3
3
NMP/g
o ml
160
120
70
40
95
60
40
23
9 Incubadora a 35oC
9 Contador de colonias
9 Campana bacteriolgica
9 Filtro para membrana
9
9
9
(acero o vidrio)
Bomba de vaco
Mechero
Pinzas planas
FUNGIBLES Y
REACTIVOS
9 Membrana de <0.45 mm
de nitrato o acetato de
celulosa
9 Cajas de petri estriles
9 Agar Plate Count o Agar
Casena-Soya
9 Agar Endo C
0.1g
o ml
0.01g
o ml
> 102
< 10 pero ms de 1
Menos de 1
PRUEBA DE PUREZA
Confirmacin del Control Sanitario
g
PRUEBA DE PUREZA
Demostracin de Salmonella
g
PRUEBA DE PUREZA
Pseudomonas y Staphylococcus
g
g
n
n
n
n
g
n
n
n
PRUEBA DE PUREZA
Shigella y Clostridia
Shigella
n Pretratar material en amortiguador peptonado.
n Inocular Medio MacConkey+1 g de telurito de potasio.
n Incubar a 35C, 18-24 h. Confirmar XLD o desoxicolato,
seguido de inoculacin en TSI o KIA
n Si no hay crecimiento la prueba es negativa.
g Clostridia
n Inocular 2x100 ml de Medio de Carne Cocida con 10 g
n Sellar uno con una capa de parafina estril
n Calentar el otro a 65C por 30 min y sellar.
n Incubar a 37C, examinar cada 24 h/4 das
n Sin crecimiento en ninguno, la prueba es negativa.
n Identificar los esporoformadores
g
FLUOROCULT/CROMOCULT
Equipo y materiales
9 Mechero Gas propano
9 Campana bacteriolgica LUV
9 Pipetas estriles de 1 ml en 0.1 ml Autoclave
9 Agua peptonada 0.1% en recipientes de 9 a 90 ml
CALDO FLUOROCULT
Tubos con 9 ml de
Caldo Fluorocult
AGAR CROMOCULT
Cajas de petri estriles
Agar para Coliformes
9Incubadora a 35C
9Reactivo de Kovacs
PROCEDIMIENTO
Homogenizar y diluir la muestra
Inocular 9 tubos con caldo Fluorocult: los primeros 3 con 1 ml de la
dilucin, los siguientes 3 con 0.1 ml y los ltimos 3 con 0.01 ml.
Incubar a 35-37oC por 24 hrs.
INTERPRETACIN
Negativo: No existe cambio de color en el tubo de ensayo
Positivo: Viraje de coloracin de amarillo a verde-azulado confirma
la presencia de CT, segn tabla de NMP.
CF y E. coli: Exponer los tubos positivos a LUV de longitud de onda
larga para fluorescencia. Una fluorescencia azul indica la presencia
de E. coli y por lo tanto de CF.
Confirmar la presencia de E. coli en los tubos con fluorescencia
positiva, agregar dos gotas de reactivo de Kovac, un cambio de
coloracin a rojo confirma la presencia de E. coli.
LMX FLUOROCULT
AGAR CROMOCULT
Fundamento y Procedimiento
AGAR CROMOCULT
Identificacin e interpretacin
IDENTIFICACIN DE COLIFORMES
9 La enzima caracterstica de coliformes, BGal se adhiere al
sustrato GAL-Salmn y causa una coloracin de salmn a roja
de las colonias de coliformes.
IDENTIFICACIN DE E. coli
9 El sustrato X-glucurnido es usado para la identificacin de D-glucoronidasa, que es una enzima caracterstica de E. coli.
9 E. coli se adhiere a GAL-Salmn y X-glucornido tomando las
colonias positivas una coloracin de azul oscuro a violeta.
9 Para la confirmacin de E. coli, demostrar la produccin de
indol con reactivo de Kovac.
INTERPRETACIN
9 E. coli: colonias azul oscuro a violetas
9 Coliformes totales: Colonias salmn a rojas y colonias de
color azul oscuro a violetas.
AGAR CHROMOCULT
LIMITES MICROBIANOS
Contaminacin mxima aceptada
CALIDAD MICROBIOLOGICA
de las preparaciones farmacuticas
g
g
g
g
g
g
CALIDAD MICROBIOLOGICA
Evaluacin de 10 especies de uso medicinal
z
z
z
z
CALIDAD MICROBIOLOGICA
CALIDAD MICROBIOLOGICA
CALIDAD MICROBIOLOGICA
Tamizaje en drogas vegetales
z Universo y muestra:
138 muestras escogidas al azar de 31 drogas vegetales,
provenientes de 9 proveedores de Austria y Alemania.
z Metodologa:
9 Parmetros estndar: Recuento aerbico mesoflico,
enterobacterias, coliformes, esporoformadores aerbicos,
levaduras y mohos, enterococos, lactobacilus y pseudomonadales
y aeromonades.
9 Selectivos: E.coli EH, Salmonella, Campylobacter jejuni,
Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Clostridium
perfringens, Listeria monocytogenes, Estafilococo coagulasa +,
Candida albicans, mohos potencialmente aflatoxignicos.
Czech E et al. Planta Med. 2001; 67:263-269.
CALIDAD MICROBIOLOGICA
Resultados en drogas vegetales
z
z
z
z
z
z
CONTROL MICROBIOLOGICO
Valor indicativo de grupos de MOs
GRUPO
Recuento total mesoflico
Enterobacterias
Coliformes
Enterococos
Pseudo- y aeromonadas
Estafilococos coagulasa +
Bacterias esporoformadoras
Lactobacilos
Levaduras y mohos
Microorganismos patgenos
SIGNIFICADO
Parmetro general de higiene
Indica contaminacin fecal
Indica contaminacin fecal
Indica contaminacin fecal
Presagia descomposicin
Patgeno de origen humano
Microflora del suelo
Indica plantas descompuestas
Micotoxigenicidad potencial
Alto riesgo
Fisicoqumico-Sanitario
g
n
n
n
n
n
n
n
FISICOQUMICAS
Color
Sabor
Olor
Aspecto
Forma
Humedad (%)
Aceite esencial (%)
CONTROL SANITARIO
Fisicoqumico-Sanitario
FISICOQUIMICO
n Color
n Sabor, olor
n Aspecto y forma
n Densidad
n pH
n Viscosidad
n Alcohol (%)
g
CONTROL SANITARIO
n Recuento en placa
n Mohos y levaduras
n Coliformes (totales y fecales),
ausencia de Salmonella,
Shigella y Clostridia
g
CONTROL QUIMICO
n Capilografa
n TLC/HPLC
g
Fisicoqumico-Sanitario
g
n
n
n
n
n
FISICOQUIMICO
Color,
Sabor, olor
Densidad
pH y viscosidad
Humedad (%)
SENSIBILIDAD
FUNDICION
g
n
n
n
CONTROL SANITARIO
Recuento en placa
Mohos y levaduras
Coliformes (totales,
fecales), ausencia de E.
coli, Salmonella y Shigella
Ausencia de Pseudomonas
ni Staphylococcus
FITOQUIMICA
CONTROL DE ACTIVIDAD
Bioensayos farmacolgicos
g
n
n
n
g
g
n
n
n
n
g
n
n
CONTROL DE CALIDAD
Textos de apoyo
1991 WHO. Guidelines for the assessment of herbal medicines.
1998 WHO. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials. Geneva.
2000 Martnez et al. Fundamentos de Agrotecnologa de Cultivo de Plantas
Medicinales Iberoamericanas. Bogot, SECAB-CYTED.
Sharapin. Fundamentos de Tecnologa de Productos
Fitoteraputicos. Bogot, SECAB-CYTED.
Mazza & Oomah. Herbs, Botanical & Teas. Lancaster
2002 Mukherjee. Quality Control of Herbal Drugs. New Dehli.
Rajpal. Standardization of Botanicals. Neh Dehli, Eastern Pub.
2003 Gaedcke & Steinhoff. Herbal Medicinal Products. Stuttgart.
Verpoorte & Mukherjee. GMP for Botanicals. New Dehli.
2004 WHO. Directrices de la OMS sobre buenas prcticas agrcolas y de
recoleccin (BPAR) de plantas medicinales, Ginebra
2005 WHO. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials. Revised
Update, QAS/05.131.Rev. 1