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UNIVERSIT DU QUBEC
MMOIRE
PRSENT
L'UNIVERSIT DU QUBEC TROIS-RIVIRES
COMME EXIGENCE PARTIELLE

DE LA MAITRISE EN BIOPHYSIQUE
PAR
NATHALIE MILLER
"EXPRESSION D'UNE THERMOTOLRANCE AU NIVEAU DE LA

FONCTION DU PHOTOSYSTME II''
DCEMBRE 1993
Universit du Qubec Trois-Rivires

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ou dune partie importante de ce mmoire ou de cette thse requiert son
autorisation.
A mes parents ...
... et celle ou celui qui grandit en moi

et qui m'apporte dj tant de joie.
William n le 2 fvrier 94
111
RESUM
Les biologistes sont depuis longtemps fascins par la croissance

de certains organismes vgtaux dans des conditions dsertiques,
des temprature trs leves. Et depuis ce temps, les fondamentalistes
cherchent une explication cette adaptation des vgtaux la chaleur
ou face ce que l'on appel un stress thermique.
Une lvation de temprature de IDCC au dessus de la
temprature ambiante bouleverse la croissance des organismes
vgtaux dont le mtabolisme est modifi pour faire face cette
agression. L'une des stratgies choisies par les tissus cellulaires pour
s'adapter aux variations de temprature est la synthse rapide de
nouvelles protines appeles protines du choc thermique (HSP). Leur
implication ainsi que leur mode de fonctionnement ne sont pas
vritablement lucids.
Les principaux objectifs de ce travail sont d'tudier l'activit
photosynthtique de la membrane thylacodienne ainsi que sa
composition polypetidique lors d'un stress thermique. L'intrt pour
cette membrane est bas sur le fait que celle-ci semble tre le site o les
effets ngatifs de tempratures leves se font sentir en tout premier
lieu. Par consquent le site prouv par un choc thermique est le
thylacode et plus particulirement le photosystme II (PSII), qui est
trs vulnrable l'effet de la chaleur. Les recherches ont t
habituellement effectues sur des membranes, isoles du chloroplaste,
que l'on incube dans un bain d'eau thermostate temprature leve.
Par contre dans notre tude nous voulions considrer les effets et
consquences apports par le stress thermique sur le thylacode encore
intgr la plante. Cette approche de l'adaptation la chaleur permet
de considrer la fois son effet sur la plante entire ainsi que sur les
IV
mcanismes de la photosynthse. Nos membranes thylacodiennes

l'tude ne seront isoles de leur milieu naturel qu'une fois le stress
thermique complt. Suite nos conditions d'acclimatation sur les
plants
d'orge,
nos
rsultats
dmontrent
que
l'activit
photosynthtique n'est pas perturbe par l'effet de la chaleur,
contrairement a ce qui a t observ sur la membrane isole.
Des techniques de sparation des protines par lectrophorse
nous ont permis d'tudier la composition polypeptidique des
membranes thylacodiennes de plants d'orge exposs une lvation
de temprature. Ainsi, deux protines de stress thermique (HSPs) ont
t dceles et localises au niveau de la membrane photosynthtique.
L'inhibition slective de la synthse des protines par l'utilisation
d'antibiotiques spcifiques fut employe dans le but de concrtiser
l'implication des protines de stress thermique dans l'acquisition de la
thermotolrance. En prsence des HSPs le processus de photosynthse
devient plus rsistant l'effet de la chaleur. Par exemple, le
polypeptide extrinsque de 33 kDa, dont le rle est de stabiliser le
complexe responsable du dgagement d 'oxygne, est particulirement
sensible aux tempratures leves mais devient rsistant aprs
l'acclimatation des plants d'orge. Ainsi, le complexe de dgagement
d'oxygne semble prserver une intgrit accrue dans les plants
acclimats par l'intgration des HSPs.
REMERCIEMENTS
J'aimerais tout d'abord faire part de ma graqtude mon

directeur de recherche, le Dr Robert Carpentier, pour son soutien
scientifique apport depuis plusieurs annes, ainsi que le support
financier accord dans le cadre de congrs intemationnaux.
Des remerciements galement aux collgues de laboratoires,
prsents et passs, pour les bons moments d'entraides et de rigolades.
Je tiens tout particulirement dire un grand merci Marc,
un collgue de laboratoire et depuis mon conjoint, pour sa confiance et
ses nombreux encouragements terminer ce travail.
V1
LISTE DES ABRVIATIONS
BSA:
CCL:
ChI :
CPI :
CPII :
DCBQ:
DGDG:
DMSO:
EDTA:
FTIR:
HEPES:
HSG:
HSP:
LDS:
MES:
MGDG:
POPOP:
PPO:
PMSF:
PSI:
PSII :
QB:
SDS:
TEMED:
TES :
Srum albumine bovine

Complexe collecteur de lumire
Chlorophylle
Complexe pigment-proteine associ au PSI
Complexe pigment-proteine associ au PSII
2,S-dichloro-p-benzoquinone
digalactosyl diacylglycerol
dimthyl sulfoxide
acide thylnediaminettraactique
Infra-rouge transform de Fourier
acide (N-[2-hydroxythyle] piprazine
N'-[2-thanesulfonique] )
granule du stress thermique
protine du stress thermique
lauryl dodcyl sulfate
acide (2[ N-morpholino] thane sulfonique
monogalactosyl diacylglycerol
(l,4-bis 2,5-phnyloxazolyl) benzne
2,5- diphnyloxazole
phnylmthyl sulfonyl fluorure
photosystme 1
photosystme II
deuxime accepteur d'lectrons du PSII
sodium dodcyl sulfate
N,N,N,'N'- ttramthyl-thylne diamine
acide N-tris [hydroxymthyl] mthyl-2aminothanesulfonique
vu
TABLE DES MATIRES

page
RSUM ........................................ . ......... .iii
REMERCIEMENTS ................................... . ..... v
ABRVIATIONS ............................... . ............ vi
TABLE DES MATIRES ......................................vii
LISTE DES TABLEAUX.............. . ........................xii
LISTE DES FIGURES ........................................ xiv
1. INTRODUCTION ....... . ........ . ....................... .1

1.1 Objectifs du travail ....................... . ..............2
1.1.1 Vrifier les modifications possibles au
niveau de la membrane thylacodienne lors
d'un stress thennique ................... . ..........2
1.1.2 Vrifier la prsence de HSP au niveau de la
membrane thylacodienne ..........................3
1.1.3
Evaluer l'implication des HSP dans l'activit

photosynthtique................................. .4
vi
2. APPAREIL PHOTOSYNTHTIQUE .......................... 5

2.1 Le chloroplaste................... ; ..................... 6
2.2 Composition protique, lipidique et

pigmentaire de la membrane photosynthtique ............ 7
2.3 Organisation de la membrane thylacodienne .............. 12
2.4 Structure des complexes pigmentaires .................... 14
2.5 Chane de transport d'lectrons .......................... 19
3. STRESS THERMIQUE ..................................... 24

3.1 Consquences d'un choc thermique ....................... 25
3.1.1 Changements structuraux au niveau

de la membrane thylacodienne .................... 25
3.1.2 Altrations de la composition lipidique
de la membrane thylacodienne .................... 29

3.1.3 Modifications possibles aux niveaux des
complexes pigmentaires .......................... 32
3.1.4 Synthse des protines de choc thermique ........... 33
3.1.5 Origine des protines de choc thermique ............ 34

3.1.6 Localisation des protines du choc thermique ........ 35
IX
3.2 Thermotolrance et protines du choc thermique .......... 37

3.2.1 Induction de la thermotolrance ................... 38
3.2.2 Relation entre l'apparition des HSP et
l'expression de la thermotolrance ................ 39
4. MATRIEL ET MTHODES ............................... 42

4.1 Prparation du matriel biologique ...................... 42
4.1.1 Culture de l'orge................................. 42
4.1.2 Traitement du choc thermique ..................... 42
4.1.3 Incorporation d'antibiotiques ...................... 43
4.1.4 Incorporation de la radioactivit................... 43
i)
Compteur scintillation ........................ 43
4.2 Extractions du matriel biologique ...................... 44

4.2.1 Extraction des cellules ............................ 45
4.2.2 Extraction des chloroplastes....................... 45
4.2.3 Extraction des membranes thylacodiennes .......... 46
4.2.4 Extraction des complexes protiques ............... 46
4.2.5 Extraction des protines totales ................... 47
4.3
Techniques biochimiques............................... 47
4.3.1 Electrophorse SDS-page ......................... 49
4.3.2 Electrophorse non dnaturante ................... 49
4.3.3 Analyse des lectrophorses ....................... 50
i)
Techniques de coloration ....................... 50

A. Coloration au bleu de coomasie ............... 50
B. Coloration l'argent ........................ 50
ID Densitomtrie ................................. 51
iii) Autoradiographie.............................. 51
4.4 Techniques biophysiques ............................... 52
4.4.1 Spectrophotomtrie UV-visible et
dtermination de la chlorophylle ................... 52

4.4.2 Electrode oxygne et
activit photosynthtique ......................... 52

4.4.3 Microscope optique et
intgrit des chloroplastes ........................ 53

4.4.4 Infra-rouge transform de Fourier ............... 54
i) Prparation des chantillons.................... 55
5.
RSULTATS ET DISCUSSION ......... . .................. 56

PARTIEl
5.1 Modifications structurales de la membrane

photosynthtique .... . ................................ 57
5.1.1 Etude des changements conformationnels des
protines de la membrane thylacodienne
en FI1R ............................ . ............ 57
5.1.2 Etude des complexes pigments-protines ............ 58
PARTIE II
5.2 Prsence des HSP au niveau de la membrane

photosynthtique......... . ............................ 68
5.3 Adaptation du PSII au stress thermique .................. 78
5.4 Thermotolrance........... . .......................... 95
5.4.1 Thermotolrance en prsence d'antibiotiques
spcifiques ................................ . .... 102
i) Influence du chloramphnicol .................. 106
li) Influence du cycloheximide .................... 116
6. CONCLUSION .......................................... 121

RFRENCES .......................................... . ... 124
Xli
LISTE DES TABLEAUX
Page
1. Nomemclature et localisation des complexes
photosynthtiques ............... . ....................... 17

2. Analyse quantitative des protines membranaires de
thylacodes isols de plants d'orge ......................... 72
3. Activit photosynthtique des membranes
thylacodiennes provenant de plantes acclimates
ou non acclimates la chaleur
en prsence de lumire ................................... 81

ou non acclimates la chaleur
en absence de lumire .................................... 83
5. Pourcentage de chloroplastes intacts aprs
extraction.............................................. 84
6. Activit photosynthtique des membranes provenant
de chloroplastes acclimats ou non acclimats la
chaleur en prsence de lumire ............................ 89
7. Analyse quantitative des protines membranaires de
thylacodes isols de chloroplastes......................... 94
Xl11

ou non acclimates dans le mthanol ... . ........ . ......... 105
9. Activit photosynthtique de membranes acclimates
ou non acclimates la chaleur en prsence ou en
absence de chloramphnicol .............................. 112
xiv
LISTE DES FIGURES

page
1. Localisation du chloroplaste................................. 6
2. Structure interne du chloroplaste, reprsentant
l'organisation de la membrane thylacodienne ................. 7

3. Composition et origine des protines de la
membranethylacodienne................................... 8
4. Enveloppe du chloroplaste .................................. 9
5. Transport des protines l'intrieur du

chloroplaste............................................... 10
6. Complexes de polypeptides et de chlorophylles qui
constituent la membrane thylacodienne ...................... 13

7. Localisation des complexes du PSI et PSII ..................... 14
8. Complexes pigment-protine isols de la membrane
thylacodienne d'pinard .................................... 16

9. Reprsentation du complexe collecteur de lumire
du PSII.................................................. .. 18
10. Reprsentation du complexe collecteur de lumire

du PSI .................................................... 19
Il. Spectre d'absoption des chlorophylles a et b ...................20
12. Transport d'lectrons travers le thylacode ..................22
xv
13. Rorganisation de la membrane thylacodienne

sous des conditions de stress thermique .......................30
14. Spectre Infra-rouge transform de Fourier de la
membrane acclimate ou non acclimate la chaleur.......... .59
15. Isolation des complexes pigment-protine des
membranes acclimates ou non acclimates
la chaleur................................................ 61
16. Comparaison par densitomtrie des complexes
pigment-protine des membranes acclimates ou
non acclimates la chaleur ................................62
17. Spectre d'absorption du complexe CPI isol de
la chaleur................................................ 63
18. Spectre d'absorption du complexe CPII* isol de
la chaleur................................................ 65
19. Spectre d'absorption du complexe CPII isol de
la chaleur................................................ 66
20. Spectre d'absorption des pigments libres de
la chaleur................................................ 67
21. Composition polypeptidiques de la membrane

thylacodienne acclimate ou non acclimate
la chaleur
(technique de coloration au bleu de coomasie) ..................70
22. Comparaison par densitomtrie de la composition
polypeptidique de la membrane thylacodienne ................71
XV1
23. Composition polypeptique de la membrane par la

technique de coloration au nitrate d'argent ...................74
24. Autoradiogramme, illustrant les polypeptides
nouvellement synthtiss en prsence

de 35S-mthionine ......................................... 75
25. Analyse par densitomtrie de l'autoradiogramme..............77
26. Composition polypeptidique des membranes
photosynthtiques extraites de chloroplastes.................. 86
27. Densitogramme reprsentant la composition
polypeptidique des membranes photosynthtiques
extraites de chloroplastes ................................... 87
polypeptidique des membranes photosynthtiques
extraites de chloroplastes ................................... 88
29. Composition polypeptidique de membranes
thylacodiennes extraient de chloroplastes
acclimats ou non acclimats la chaleur .....................92
polypeptidique de membranes thylacodiennes
extraientes de chloroplastes acclimats ou non
acclimats la chaleur...................................... 93
31. Pourcentage d'activit photosynthtique en
fonction du temps d'incubation 30C des membranes
provenant de plantes acclimates ou non acclimates
la chaleur................................................ 97
la chaleur................................................ 98
XVII

la chaleur, en absence de lumire .......................... 100
provenant de chloroplastes acclimats ou
non acclimats la chaleur ................................ 101
35. Pourcentage d'activit photosynhttique en
fonction du pourcentage de mthanol prsent sur les
membranes thylacodienne provenant de plantes
acclimates ou non acclimates la chaleur.................. 104
polypeptidique des membranes provenant de plants
acclimats ou non acclimats la chaleur en
prsence de mthanol ..................................... 107
provenant de plants acclimats ou non acclimats
la chaleur en prsence de mthanol. ....................... 108
38. Pourcentage d'activit photosynhttique des membranes
thylacodiennes en fonction de la concentration de
chloramphnicol. ......................................... 109
la chaleur en prsence de mthanol et de
chloramphnicol. ......................................... 113
XV111
40. Activit photosynthtique en fonction du temps

d'incubation 30 de la membrane thylacodienne
isole de plants d'orge non acclimats en prsence
de 5 ou 15 mM de chloramphnicol. ......................... 115
la chaleur en prsence de mthanol et de
cycloheximide............................................ 117
42. Activit photosynthtique en fonction du temps
d'incubation 30 de la membrane thylacodienne
isole de plants d'orge non acclimats en prsence
de 5 ou 15 mM de cyclohexximide........................... 118
CHAPITRE 1
INTRODUCTION
La recherche sur les effets des stress physiologiques au niveau des

plantes remonte plusieurs annes. Toutes ces tudes dmontrent que
les plantes suprieures ont la capacit de survivre et de crotre sous
des conditions environnementales dfavorables. Entre autres les
plantes sont aptes tolrer des tempratures qui dpassent la
temprature normale de croissance.
Les tres vivants croissent et se dveloppent dans une zone de
tempratures trs troite: au-dessous de -3C et dans certains cas
jusqu' -13C, la plupart des ractions biochimiques ne peuvent se
produire, c'est aussi le cas au-dessus de la zone de 37 47C (Mazliak
1981). Pour des tempratures en-dessous de _3 -13C, le
mtabolisme devient pratiquement impossible dO la forte teneur en
eau de tous les tissus vivants. Par contre pour des tempratures dans
la zone de 37 47C, on peut observer une tolrance certaine du
mtabolisme qui mrite d'tre tudie et discute longuement.
Un changement de temprature, au niveau de tout organisme
vivant entrane certaines modifications dans la structure
fondamentale de ceux-ci. Toute variation de temprature provoque
deux types de modifications trs diffrentes: a) la vitesse des ractions
biochimiques du mtabolisme est modifie, b) la structure ainsi que la
composition des macromolcules cellulaires (protines et lipides) est
altre.
Les transformations apportes au monde vgtal par des

tempratures leves (soit entre 10-15C au-dessus des tempratures
normales de croissance) sont trs nombreuses. Ces modifications sont
par exemple, la dnaturation de protines, l'inactivation des enzymes,
la rduction de l'activit photosynthtique du chloroplaste etc. Cette
tude traitera de quelques transformations apportes par le choc
thermique au niveau de l'appareil photosynthtique, puisque ce
dernier constitue l'lment o les effets ngatifs de tempratures
leves se font sentir en tout premier lieu. En particulier nous
tudierons les modifications au niveau des protines de cette
membrane thylacodienne ainsi que l'influence du choc thermique sur
l'activit photosynthtique.
La condition de stress thermique employe dans ce travail sera une
augmentation de temprature de 17C au-dessus de la temprature
normale de croissance de notre espce vgtale et d'une dure de trois
heures. Puisque dans cette tude nous voulons spcifiquement tudier
le rle des protines de stress thermique (HSPs), il est alors
primordial, selon les tudes de Glackinski en 1988 de travailler dans de
telles conditions pour ainsi produire la synthse de ces protines.
1.1 Objectifs du travail
1.1.1 Vrifier les modifications possibles au niveau

de la membrane thylacodienne lors d'un choc
thermique.
sur
les
membranes
Un stress
thermique
provoque
photosynthtiques de grandes perturbations. Des changements
conformationnels des rorganisations des membranes etc. Dans un
premier temps nous voulons observer si le fait de provoquer un stress

thermique sur la plante entire, entrane aussi des chambardements
aussi considrables sur la membrane thylacodienne. La spectroscopie
FTIR (infra-rouge par transforme de Fourier) permettra une analyse
globale de la structure des protines membranaires. Suite ces
recherches sur les modifications conformationnelles produites par la
chaleur, notre intrt se portera sur les complexes pigment-protine et
de leur sort durant un stress thermique. Une isolation des complexes
sera d'abord effectue partir des membranes thylacodiennes et
ensuite ils seront spars par lectrophorse dans la but de les tudier
sparment par spectroscopie d'absorption. Les transformations
lipidiques apportes aussi par le stress thermique n'ont pas t
tudies dans ce prsent travail, mais seulement l'apport de la partie
protique.
1.1.2 Vrifier la prsence de HSP au niveau de la membrane

thylacodienne.
Un stress thermique ne provoque pas seulement des dommages
aux plantes, mais entrane aussi des rponses positives de la plante
face la chaleur en guise de protection. Entre autre la synthse de
nouvelles protines (protines du choc thermique). L'intrt de ce
travail porte sur cette synthse de protine et sur leurs fonctions
encore nigmatiques. Il est tout d'abord primordial d'identifier toutes
les modifications entranes par le stress thermique au niveau de la
membrane thylacodienne pour ensuite explorer le ru veau
d'implication de ces protines.
Cet objectif consiste vrifier l'existence d'une ou plusieurs
protines du choc thermique (HSP) au niveau de la membrane
thylacodienne isole de plants d'orge acclimats la chaleur. Pour se
faire, il faut tout d'abord dterminer une temprature d'incubation
laquelle il y aura synthse de ces protines ainsi que la dure du temps
d'incubation permettant aux protines de gagner leur site respectif.

Par l'extraction des protines de cette membrane et leur analyse par
lectrophorse, il sera facile d'accder ce premier objectif.
1.1.3 Evaluer l'implication des HSP dans l'activit

photosynthtique.
Le troisime objectif fix est d'tudier le rle de protines HSP (de

la membrane thylacodienne acclimate) au niveau des changements
dans le comportement ainsi que dans l'activit de la membrane
photosynthtique.
La mthode employe, pour accder notre but consiste en
l'analyse de l'activit de l'appareil photosynthtique en termes de
dgagement d'oxygne. Nous pourrons vrifier que la prsence des
HSP au niveau de la membrane thylacodienne (observe dans
l'objectif prcdant) permet de modifier ou de protger l'activit
photosynthtique lors d'exposition des tempratures relativement
leves.
1.1.4 Etablir une relation entre la prsence de HSP

et l'acquisition de la thermotolrance.
Cet objectif vise tablir une relation entre la prsence de HSP et
la rsistance de la membrane photosynthtique la chaleur.
L'utilisation d'antibiotiques spcifiques pour l'inhibition de la
synthse des protines chloroplastiques ou nuclaires nous permettra,
en plus de dfinir l'origine des HSP, de confirmer le rle d'importance
de ces protines dans la thermotolrance de l'appareil
photosynthtique.
CHAPITRE 2
APPAREIL PHOTOSYNTHTIOUE
La photosynthse est le processus par lequel les plantes, algues et

plusieurs espces de bactries utilisent l'nergie lumineuse pour
gnrer leur propre nergie. L'quation gnrale du processus de la
photosynthse
montre l'utilisation du dioxyde de carbone et de l'eau, pour la

formation d'hydrate de carbone et la libration de molcules
d'oxygne. Le mcanisme de la photosynthse est reli aux
membranes thylacodiennes qui sont spares en deux rgions
spcifiques, le photosystme 1 (PSI) et le photosystme II (PSII). La
prsence de complexes de pigments et de protines l'intrieur de ces
membranes permet le transport des lectrons qui sont gnrs par
l'absorption photonique. Ce mme transport d'lectrons amne la
synthse d'ATP et de NADPH ncessaires au droulement du cycle de
Calvin, et responsable de la production d'hydrates de carbone
(principale source d'nergie chez les plantes).
O se retrouve la membrane photosynthtique, comment est-elle
constitue exactement et comment le transport d'lectrons est-il

possible au niveau de celle-ci ?
2.1 Le chloroplaste.
Des chloroplastes de forme et de taille diffrentes existent dans

une varit de plantes (Kirk et Tilney-Bassett, 1978). Le chloroplaste,
un organite cellulaire trouv seulement dans les cellules des
eucaryotes et les bactries photosynthtiques, est identifi comme site
d'action du processus de la photosynthse. Cet organite est constitu
d'une double membrane, qui permet un certain contrle sur les
changes entre le cytoplasme (liquide interstitiel des cellules) et le
stroma (liquide intracellulaire du chloroplaste, riche en enzymes et en
amidon). La prsence de pores au niveau de la membrane permet
certaines molcules, de faible poids molculaires (10 kDa), d'avoir la
possibilit de se retrouver dans le stroma du chloroplaste. Lorsque l'on
observe les chloroplastes de plus prs, nous pouvons constater la
prsence d'un systme membranaire en son coeur. Ce systme
membranaire est appel aussi membrane photosynthtique ou
membrane thylacodienne et reprsente prcisment le lieu o l'on
identifie l'activit photosynthtique (Menke, 1962).
cytoplasme
chloroplaste
--.
stroma
membran e
externe
Cell ule vegetale
membrane
interne .
Chloroplaste
FIGURE 1 Localisation du chloroplaste dans la cellule vgtale.
Les thylacodes prennent gnralement une forme complexe

d'enchevtrements dans lesquels existent des rgions empiles,
constitues de 2 ou plusieurs membranes replies, appeles grana et
des rgions non empiles qui reprsentent une membrane simple,
appele lamelle du stroma. (Foyer, 1984)
lamelles
stromatiques
Grana
Stroma
Structure interne du chloroplaste reprsentant

l'organisation de la membrane thylacodienne
FIGURE 2
2.2 Composition protique, pi&mentaire et lipidique de

la membrane photosynthtique
Puisque l'activit photosynthtique est rattache cette

membrane, il est primordial d'en tudier sa composition. Comme
toute autre membrane, son agencement complexe est constitu de
protines, de pigments et de lipides. L'intrt porte sur sa composition
en protines membranaires ainsi que sur sa constitution pigmentaire
(ce dernier point sera trait de faon plus dtaille la section 2.4).
Des protines de diffrentes tailles et de poids molculaire trs

varis composent la membrane. Chaque protine possde une fonction
trs particulire et est essentielle l'intgrit et au fonctionnement de
la membrane thylacodienne. Certaines sont associes aux pigments
(collecteurs d'nergie), d'autres sont lies aux activits des
photosystmes, d'autres encore semblent indispensables aux
accolements membranaires et d'autres enfin ont des proprits
enzymatiques trs prcises (rductase, ATPase etc).
La membrane thylacodienne est forme de protines synthtises
soit au niveau du chloroplaste par des gnomes chloroplastiques, soit
au niveau du noyau. ADN, ARN, ribosomes et plusieurs enzymes se
retrouvent dans le chloroplaste et constituent tout le matriel
ncessaire pour la synthse des protines. Toutes ces molcules sont
prsentes dans le stroma lors de la transcription et la translation. Le
chloroplaste possde 85 gnes pour la transcription et translation de
protines, par contre cela n'est pas suffisant et plusieurs protines de
la membrane thylacodienne sont codes par les gnes nuclaires
(Steinback et al., 1985; Murphy et Thompson, 1988). Une
reprsentation de la membrane nous indique l'origine de chacune des
protines de structure.
PSI
cy.
"'/1
FIGURE 3 Composition et origine des protines de la membrane

thylacodienne.
Les
protines
ombrages
sont
d'origine
chloroplastique et celles claires d'origine nuclaire (Simpson et Von
Wettstein, 1989).
Certains chercheurs (Chua et Schmidt, 1978; Schmidt et al., 1980)

dmontrrent que ces protines, synthtises par le gnome nuclaire,
sont importes, aprs synthse dans le chloroplaste. Ce transfert des
protines, du cytoplasme vers le stroma du chloroplaste, implique
ncessairement l'existence de rcepteurs trs complexes, localiss sur
la membrane du chloroplaste et responsables de la reconnaissance des
protines et de leur transport (Douce et Joyard, 1979; Pfisterer et al.,
1982). Les protines, destines au chloroplaste et synthtises par le
noyau, ont deux membranes traverser, soit celles qui dlimitent le
chloroplaste. Certaines protines doivent de plus traverser une
troisime membrane, celle du thylacode, avant d'atteindre la
localisation finale (Weisbeek et al., 1991).
Thylakoid membrane
Inner membrane
Intermembrane space
Outer membrane
FIGURE 4 Reprsentation de l'enveloppe du chloroplaste ainsi
que de sa structure interne. (Smeekens et al., 1990)
10
Les protines venant du cytosol et destines au chloroplaste

peuvent tre orientes vers diffrents compartiments de l'organite.
Certaines sont promises au stoma, d'autres sont des protines pour la
membrane thylacodienne, d'autres encore sont voues au lumen.
Thylakoid
membrane
proteina
Thytakoids )
Stroma
Spp
Thyllkoid lumen prottina'
Mcanisme illustrant le transport des protines

d'origine nuclaire l'intrieur du chloroplaste. Une protine
prcurseur est ncessaire pour l'importation du polypeptide dans le
stroma (reprsente par le carr). Cette protine sera enleve par une
peptidase du stroma (SPP). Les polypeptides destines la partie
lumnale du thylacode contient une information additionnelle
localise sur le N-terminal (reprsent par un hexagone) essentielle
la translocation de la membrane thylacodienne. Cette partie sera elle
aussi enleve par une peptidase du thylacode (TPP) (Smeenkens et al.,
FIGURE 5
1990).
11
La plupart des protines tudies qui vont vers le chloroplaste,

sont prcdes d'une protine ayant un N-terminal de transition, pour
l'adhsion au niveau de l'enveloppe. Ce peptide de transition contient
toute l'information ncessaire l'exportation vers l'organite. Une fois
la protine arrive destination, ce prcurseur est limin par des
peptidases du stroma. D'autre protines, orientes vers la membrane
ou vers le lumen possdent de l'information supplmentaire
essentielle pour la translocation de la membrane thylacodienne, ce
prcurseur sera aussi limin par des peptidases du thylacode.
La partie pigmentaire, se compose de photorcepteurs (ou
pigments photosynthtiques), capables de transfrer la photonergie
aux centres ractionnels des photosystmes. La plupart, soit 99% de
ces pigments contenus dans la membrane photosynthtique jouent le
rle de collecteur d'nergie lumineuse. Cette absorption de l'nergie
sera traite plus en dtail la partie 2.4.
Les plantes vertes possdent des pigments photosynthtiques, les
chlorophylles a et b, ainsi que des carotnodes (les carotnes et les
xanthophylles). C'est la chlorophylle-a qui est directement implique
dans la capture de la lumire tandis que les carotnodes sont
considrs comme protecteurs des chlorophylles (Yamamoto, 1979).
La partie lipidique est constitue de deux sortes de galactolipides
dans des proportions de 2:1, soit le monogalactosyldiglycride
et
le
digalactosyldiglycride
(DGDG).
La
(MGDG)
phosphatidylcholine (PC) et la phosphatidylglycrol (PG), y sont aussi
prsentes dans un rapport de 1:3. Le rle des lipides membranaires est
fondamental, puisqu'il permet de maintenir une conformation dfinie
et une orientation particulire des protines (Siegenthaler et Rawler,
1986)
12
De telles molcules (protines, pigments et lipides) possdent des

proprits de solubilit, de polarisation et de conformation qui
permettent un arrangement complexe et structur, constituant le
centre mme du phnomne fondamental de la photosynthse.
2.3 OrKanisation de la membrane thylacodienne
La membrane photosynthtique forme six complexes de

polypeptides et de chlorophylles, soit le facteur de couplage CFoC FI
(ATP synthtase), le cytochrome b 6 / f, le centre ractionnel du
photosystme 1 (PSI), le centre ractionnel du photosystme II (PSII),
le complexe collecteur de lumire du PSI (LHO) et le complexe
collecteur de lumire du PSII (LHCII) (Lagoutte et Mathis, 1989;
Govindjee et Coleman, 1990). Le rle des deux complexes collecteurs
de lumire est d'absorber l'nergie lumineuse. Une fois cette nergie
capte, elle sera canalise au niveau des photosystmes PSI et PSll
pour ainsi amorcer les ractions photochimiques. Les complexes
peuvent tre tudis sparment, puisqu'ils sont stables en l'absence
d'un ou de plusieurs autres complexes. Puisque l'tude se rapporte
l'activit photosynthtique et au dgagement d'oxygne, il est donc
important d'orienter notre rflexion sur le PSII et le PSI. Ces deux
photosystmes sont de taille et de composition diffrentes, ce sont des
regroupements de protines et de pigments impliqus dans la capture
de l'nergie ainsi que dans le transport d'lectrons.
13
H'
stroma
ADP + Pi
+1
ATP
PS Il
PO
02~ 4W ------- ----
2:' _______________________________________ Jt
lumen
FIGURE 6
Schmatisation des complexes polypeptidiques
constituant la membrane thylacodienne, soit le photosystme 1, le
complexe cytochrome b6/ f, le photosystme II et le complexe collecteur
de lumire. (Hader et Tevini, 1987)
Les deux photosystmes se trouvent distribus de faon non

alatoire au niveau de la membrane. Une tude en microscopie
lectronique fait constater que les PSI et les PSII ne sont pas dans des
proportions de 1:1 et qu'ils sont distribus dans des rgions bien
prcises de la membrane thylacodienne (Anderson et Anderson, 1981).
Les lamelles du stroma, soit la rgion non empile, contiennent, une
quantit importante de photosystme 1, et seulement entre 10 et 20%
des complexes de PSII. Contrairement, les rgions empiles sont
enrichies en PSII et pauvres en complexes de PSI (Foyer, 1984). La
partie exprimentale, de ce prsent travail, se fera sur la membrane
complte du thylacode, soit en prsence de grana et de lamelle du
stroma.
14
@PS ,
complex - LHC ,
({} PS 2 comple x - LHC 2
ATP synthetase
() Cytochrome Q ! complex
FIGURE 7 Localisation sur la membrane thylacodienne des

photosystmes 1 et II ainsi que des complexes, collecteur de lumire et
cytochrome b6/f
2.4 Structure des complexes piimentaires
Les tudes en microscopie lectronique ne donnent aucune

information relative l'organisation des pigments sur la membrane
thylacodienne. Cependant d'autres techniques dmontrent que les
chlorophylles sont intgres aux thylacodes en tant rattaches par
des liaisons covalentes (hydrophobes) des protines Ounge, 1977). Le
regroupement donne naissance des complexes pigments-protines
qui sont le lieu o l'absorption de la lumire et de la conversion de
l'nergie se produisent (Thornber, 1986).
15
La prsence des chlorophylles permet de distinguer les complexes.

Certains sont constitus de chlorophylle-a uniquement tandis que
d'autres possdent les chlorophylles a/b. Il y a aussi distinction des
complexes par la composition en protine. Ces protines ont des poids
molculaires diffrents et sont d'origine diverses (chloroplastique ou
nuclaire). Les complexes qui sont en relation directe avec le centre
ractionnel, sont composs de chlorophylle-a et associs des
polypeptides, d'origine chloroplastique et de poids molculaires
variant entre 32-67 kDa (Machold, 1983). Les complexes de
chlorophylles a/b, des complexes collecteurs de lumire, sont associs
des protines d'origine nuclaire de poids molculaires entre 20-30
kDa (Schmidt et al., 1981). L'tude des complexes pigments-protines
de la membrane thylacodienne est accessible puisqu'il est possible de
les isoler, par l'ajout d'agents de surface actifs soit des dtergents et
ensuite les analyser par mthode lectrophortique, (d la diffrence
des poids molculaires des constituants).
Dans certaines conditions de solubilisation de la membrane, il est
possible de retrouver par des mthodes de sparation
lectrophortique jusqu' 10 complexes pigments-protines (Anderson
et al., 1978; Camm et Green, 1980; Dunahay et Staehelin, 1984)
(Figure 8)
L'isolation des complexes a donn naissance plusieurs tudes

qui ont portes sur les spectres d'absorption des chlorophylles
(Anderson et al., 1978). L'attachement des chlorophylles aux protines
donne des spectres dont le maximum d'absorption est distinctif pour
chaque type de complexe. Une perturbation de l'environnement
entrane des dplacements des maxima sur les spectres d'absorption
(Miller et Carpentier, 1991).
16
--cPI-Iili
1 1 [
-
..
CPI--- '
--CPII ___
:::::g~:~
.,' 7
....
----____--_-_--..'_.~_-~_-.-'. --~..
-iiii_
E_
" ..
S
-CP29_
. ' ~CPU --._. _-_, , ._.- .. . - _. -._ CP24/ '
--FP_
FIGURE 8
Reprsentation des complexes pigment-protine
isols de la membrane thylacodienne d'pinard sur gel
d'lectrophorse non dnaturant. Les complexes protiques (CP) dont
CPI et CPI * reprsente deux forme du complexe PSI, CPII et CPII*
sont des formes monomriques et oligomriques partir des Chi a/b
du light harvesting complexe. Les complexes CP47 et CP43 sont
respectivement associs avec le centre ractionnel du PSII et avec
l'antenne "interne" du PSII. Les complexes CP29 et CP24 sont aussi des
complexes protine-chlorophylle a/b ayant comme fonction d'tre
l'antenne du PSII. Les pigments libres sont reprsents par FP (free
pigment) (Dunanay et Staehelin, 1986).
Chaque complexe est rattach soit aux centres ractionnels ou

aux centres collecteurs de lumire de l'un ou l'autre des photosystmes
(PSI ou PSII) (Tableau 1).
17
TABLEAU 1 Nomenclature des complexes pigment-protine des

plantes photosynthtiques. (Thornber et al., 1987)
Other names for complex:

CPI; PSI-65; ChIQ-Pl;
P700-Chl a-protein;
{ PSI reaction center;
/CC 1
PS 1
"'-LHC 1
CPO
__ cc I1-RC
CC II........ CC lIa
........ CC IIp
/
PS II
\
/LHC lia
LHC II-LHC
Hp
\LHC Ill'
CP Ill; CP47; ChIQ-P2

CP IV ; CP43; ChIQ-P3
CP29; ChIQ,b-Pl
CP II; LHCP; LHC; ChlQ/b-P2;
{ Light-harvesting ChI alb-protein
CP24
Ce sont les collecteurs de lumire CCLI et CCLII (LHCI et LHCII),

en particulier les pigments de chlorophylle-a, qui sont responsables de
l'absorption lumineuse. Ensuite l'nergie est transmise aux centres
ractionnels. A ce niveau les chlorophylles-a de ces centres absorbent
700 nm pour le complexe de PSI et 680 nm pour le PSII. La
propagation de l'nergie venant des collecteurs de lumire (CCL) et
allant vers les centres ractionnels est diffrente pour les PSI
comparativement aux PSII. Le CCL du PSII est form de chlorophylles
a/b pour la capture de l'nergie. Sa fonction est de distribuer cette
nergie vers le centre ractionnel P680' par des complexes
pigmentaires intermdiaires comme le CP29, le CP26 et le CP24.
L'nergie est alors transfre aux complexes CP43 et CP47 qui sont
eux associs directement au centre ractionnel du PSII (P680)'
18
Abs 671,.5 nm
chI. alb ,alio " .4
Abs : 57t.. 5nm~

afb : I.6
Abs : 677nm~
clb ,' .'
Abs : 676nm
o/b : 2.2
FIGURE 9
Reprsentation du complexe collecteur de lumire
du PSII. (Bassi et al., 1990)
Pour le PSI, les collecteurs de lumire (CCLI) sont en contact

direct avec ceux du PSII (CCLII). Une fois l'nergie capte par les CCI,
elle est canalise vers le centre ractionnel du PSI (CPI) pour
permettre la continuit du transport d'lectrons ( voir section 2.5 ).
19
P700 Chi, Pl
Chl,lo ' P2"
LHC Il
LHCI
LHCI
680
730
24 Chi.
~IS
Chi.
'CPI
90 Chi.
21 Chi b
FIGURE 10 Reprsentation du complexe collecteur de lumire

du PSI. (Bassi et al., 1990)
2.5 Chane de transport d'lectrons.
Pour comprendre comment la lumire entrane le transport

d'lectrons et ainsi conduit au phnomne de la photosynthse, il faut
d'abord connatre ses proprits. Cette lumire se compose de
particules (quanta ou photons) qui sont associ des longueurs d'onde
spcifiques. Une partie de ce spectre lectromagntique est constitu
de la lumire visible ( l'oeil) soit entre 390 et 760 nm. Seulement une
faible portion de cette lumire visible peut tre absorbe par la
chlorophylle. Le spectre d'absorption des chlorophylles a et b montre
une trs faible absorption de la lumire verte (jaune/vert) entre 500 et
600 nm et une forte absorption de la lumire violette, bleue, orange et
rouge.
20
.,
t:
.2
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'"
Vl
Vl
Vl
()
-G>
"0
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transm ission
et
Vl
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:;
Vl
Ql
5,
c:
rflexion
.,
:0
: I---On-de-Sr-adio ~
.,
.~
.,c:
.,
absorption
FIGURE 11 Reprsentation du spectre d'absorption des pigments

de chlorophylle a et b.
Selon le principe de l'absorption de la lumire (appel la loi de

Stark Einstein) chaque molcule peut absorber un seul photon qui
cause l'excitation d'un seul lectron. Ainsi la molcule de pigment
passe d'un tat stable (ou fondamental) un tat excit. L'nergie de
cette excitation est utilise pour la photosynthse, elle est capte et
ensuite achemine vers d'autres molcules voisines (Sauer, 1979).
21
Ce mcanisme photosynthtique peut se diviser en 5 phases ou

tapes.
1
2
3
4
5
: Absorption lumineuse
: Photolyse de l'eau
: Transport d'lectrons
: Photophosphorylation
: Fixation du dioxyde de carbone
1. Premirement la lumire est absorbe par les pigments

photosynthtiques des photosystmes et transfre leur centre
ractionnel, P700 pour le PSI et P680 pour le PSII o la lumire est
convertie en nergie chimique.
2. Cette nergie permet par la suite le clivage d'une molcule

d'eau. La photolyse de l'eau permet de librer quatre lectrons, quatre
protons et une molcule d'oxygne (facilement dtectable).
3. Depuis longtemps les grandes lignes du fonctionnement du

mcanisme de transport d'lectrons ont t traces. Les transferts du
PSII vers le PSI, via une srie de transporteurs, sont gnralement
reprsents par le schma en "z" (Hill, 1960) (Figure 12).
22
_1.5
-1.0
-J 0.0
+0.5
+1.0
FIGURE 12
schma en Z.
Reprsentation du transport d'lectrons selon le
Les lectrons arrachs aux molcules d'eau sont transfrs d'un

intermdiaire l'autre, par des molcules qui ont des proprits
d'oxydo-rduction et qui se comportent comme des agents de transfert
de charges lectriques, pour arriver finalement un accepteur
d'lectrons, le NADP+ qui donne la forme rduite NADP- (NADPH).
4. Le processus de photophosphorylation permet la synthse de

l'ATP par l'action de l'ATP-synthtase.
23
5. Le mcanisme de fixation du carbone, est le processus par

lequel le dioxyde de carbone est fix et rduit avec l'utilisation de l'ATP
et du NADPH. Les processus ractionnels 1 4 ont lieu au niveau de la
membrane thylacodienne et sont associs la phase lumineuse. Par
contre la fixation du CO2 se fait au niveau du stroma et est associe
la phase obscure.
24
CHAPITRE 3
STRESS THERMIQUE
Les biologistes ont t longtemps fascins par la croissance de

certains organismes vgtaux dans des conditions dsertiques, des
tempratures trs leves (Brock, 1978; Aragno, 1981). Les plantes sont
gnralement sensibles des changements de quelques degrs
seulement au-dessus ou au-dessous de leur temprature de croissance
qui est trs leve pour les plantes dsertiques ou relativement plus
faible chez les plantes retrouves dans les rgions tempres. Chaque
espce ou varit de plante possde une temprature minimale audessous de laquelle la croissance est impossible, une temprature
optimale qui reprsente la temprature idale de croissance, une
temprature maximale au-dessus de laquelle la croissance est
interrompue et qui peut mme entraner la mort de la plante. Si nous
nous rapprochons de ces tempratures maximales, les espces
vgtales seront dans des conditions de choc thermique.
Il est important de prciser ce que nous considrons, dans cette
tude, comme choc thermique pour le matriel vgtal tudi. Bien
entendu, une faible variation de temprature seulement peut
influencer la biochimie des cellules et ainsi tre considre comme
tant un stress thermique. D'un autre ct, une augmentation de
temprature de 10 15C au-dessus de la temprature ambiante de
croissance entrane des modifications au dveloppement habituel de la
plante et ceci sans tre dans des conditions ltales: cela constitue le
stress thermique.
25
3.1 Consquences d'un choc thermique
Un changement de temprature bouleverse la croissance des

organismes vgtaux dont le mtabolisme est modifi pour faire face
cette agression. La stratgie choisie par un organisme vivant pour
s'adapter aux changements de temprature dpend normment du
temps pendant lequel se droule la variation de temprature, soit le
choc thermique (Mazliak, 1981).
Si la variation est graduelle, continue et relativement lente,
l'organisme dveloppe une stratgie d'adaptation long terme: il peut
changer la quantit de certains enzymes, varier l'importance de
certains pools mtaboliques, modifier la constitution de ses
biomembranes (autant lipidique que protique), etc.
Si la variation est brusque, l'organisme ne peut mettre en jeu
qu'un faible nombre de ractions d'ordre physico-chimique qui
interviennent essentiellement au niveau des liaisons faibles:
changements dans la structure tertiaire et quaternaire des protines,
modifications de la fluidit des membranes, altrations des complexes
pigmentaires et/ ou synthse rapide de nouvelles protines, appeles
protines du choc thermique (HSP).
3.1.1 Chan&ements structuraux au niveau de la membrane

thylacodienne
L'exposition de matriel vgtal aux tempratures leves

a dmontr des perturbations fonctionnelles et structurelles
irrversibles la membrane thylacodienne. (AI-Khatib et Wiest, 1990;
Mukohata et Yagi, 1973a,b; Krause et Santarius, 1975; Santarius,
1975; Gounaris et al., 1983, 1984)
26
En gnral, lors d'un choc thermique, il y a des

changements dans la stabilit, la composition et la fonction du plasma
et de la membrane thylacodienne (Benzioni et Itai, 1973; Klein et
Ferguson, 1987; Sss et Yordanov, 1986; Wu et Wallner, 1984).
L'exposition des tempratures leves perturbe la structure du
thylacode en diversifiant directement ou indirectement les protines
membranaires (Thomas et al., 1986; Wiest, 1986), en perturbant
l'organisation lipidique (Gounaris et al., 1983) et en dstabilisant les
interactions lipide-protine.
Certaines tudes dmontrent, comme consquences
physiologiques d'un choc thermique, une diminution de l'activit
photosynthtique du chloroplaste (Berry et Bjorkman, 1980), tout en
conservant par contre l'intgrit de l'enveloppe de cet organite
(Krause et Santarius, 1975). Les tudes analysant l'influence de la
temprature sur l'activit photosynthtique, et plus prcisment sur la
fixation du C 02, dmontrent une diminution graduelle de la
photosynthse avec l'augmentation de la temprature (Bauer et al.,
1975; Berry et Bjorkman, 1980). En gnral (tout dpend de l'espce
l'tude), il y a une certaine protection de l'activit photosynthtique
allant jusqu' des tempratures de 30C, pour entraner, par la suite,
une diminution de l'activit en fonction de l'augmentation de la
temprature et ainsi atteindre l'inhibition 40C (Bar-Tsur et al.,
1985). D'autres observations indiquent que la membrane
thylacodienne (qui est le centre de l'activit photosynthtique),
retrouve l'intrieur du chloroplaste, semble un peu moins sensible
l'exposition la chaleur comparativement une membrane
compltement isole de son milieu car, sous des conditions de stress
thermique, les thylacodes isols du chloroplaste amnent une
inactivation totale du transport d'lectrons ainsi que de la
photophosphorylation cyclique (Santarius, 1973). Cette diffrence de
stabilit entre la membrane isole et in-vivo peut-tre explique en
supposant que les composants du le stroma du chloroplaste jouent un

rle dans la protection du thylacode lors de l'acclimatation la
chaleur (Krause et Santarius, 1975). Malgr tout, cette membrane
demeure extrmement sensible la chaleur; que celle-ci soit analyse
chez la plante entire ou encore totalement isole, il y a diminution de
l'activit photosynthtique. Mais comment cette membrane est-elle
perturbe et quel niveau?
Le premier site prouv par un choc thermique est la
membrane thylacodienne et plus particulirement le PSIT, qui est le
photosystme le plus sensible l'effet de la chaleur (Mohanty, 1987).
Par contre, le PSI est considr comme rsistant toute lvation de
temprature (Sabat et Mohanty, 1989; Boucher et al., 1990; Boucher et
Carpentier, 1992). La susceptibilit du PSII face un traitement la
chaleur est provoque par une inactivation du complexe de
dgagement d'oxygne (incapacit de raliser la photolyse de l'eau).
Les travaux du Dr Sabat raliss en 1986, dmontrent que le complexe
de dgagement d'oxygne est relativement plus sensible l'effet de la
chaleur que la chane entire de transport d'lectrons. Ainsi, par
l'utilisation de donneurs artificiels d'lectrons, comme le 1,5diphenylcarbazide ou l'ascorbate, il est possible de rtablir le transport
d'lectrons malgr l'inhibition cre par un stress thermique (Sabat et
al., 1986). D'autres travaux sur le sujet indiquent que le complexe
antennique du PSII est particulirement susceptible aux dommages
thermiques (Krause et Santarius, 1975; Schreiber et Berry, 1977). Ces
transformations de l'appareil photosynthtique au niveau du PSU sont
tudies par fluorescence de la chlorophylle. Il a t observ que la
fluorescence mise par la chlorophylle dcroissait lorsque les
chloroplastes taient traits des tempratures allant de 20-48C.
Cette fluorescence apporte de l'information directe sur l'aspect
nergtique de la membrane. Lorsque QA est sous forme rduite, la
fluorescence est leve tandis que sous l'tat oxyd, il y a une baisse de
cette fluorescence. Ainsi, par l'tude de fluorescence, il a t affirm
que l'effet de temprature provoque une baisse de la fluorescence de la
28
Chl-a associe au PSII, qui indique alors une inhibition directe au

niveau de ce photosystme (Schreiber et Armond, 1978; Downton et
Berry, 1982; Bilger et Schreiber, 1990). Les travaux de Havaux raliss
en 1991, dmontrrent une inhibition de l'activit du PSII (analyse du
dgagement d'oxygne) et par contre une certaine stimulation du PSI,
d une redistribution de l'nergie en faveur de ce photosystme
(PSI), lors d'une exposition la chaleur. Ces tudes confirment ainsi
les travaux prcdents (Ivanov et Velitchkova, 1990; Velitchkova et al.,
1989; Stidham et al., 1982; Armond et al., 1978). L'intrt de ses
recherches s'est orient vers l'implication de la lumire lors du stress
thermique (Havaux et al., 1991). L'interprtation du rle de la lumire
lors d'un choc thermique a t modifie plus d'une fois. Les premires
tudes sur des chloroplastes isols, incubs de hautes tempratures,
ont indiqu que la prsence de lumire produit des effets nuisibles sur
la chane de transport d'lectrons (Ageeva, 1977). Selon Havaux, la
prsence de lumire (30 W.m- 2) interagit avec la rponse des
photosystmes et protge l'activit photochimique contre l'effet de la
chaleur. Le stress thermique, la noirceur, augmente la capacit du
transport cyclique d'lectrons au niveau du PSI et diminue l'activit du
PSII. Par contre, une illumination des plantes lors d'un stress
thermique rduit la stimulation du transport cyclique et permet ainsi
au PSII de s'activer (Havaux et al., 1991)
Le stress thermique est habituellement accompagn d'une
combinaison d'autres stress comme le stress la lumire (selon
l'intensit lumineuse) ou encore le stress hydrique, comme on en
retrouve dans certains climats dsertiques. De rcents travaux publis
en 1992 par Havaux, montrent que le stress hydrique au niveau des
plantes intactes, intensifie considrablement la rsistance du PSII aux
stress thermiques et cela en prsence ou en l'absence de lumire
(Havaux, 1992). Mais comment le stress hydrique conduit-il une
protection du PSII face aux dommages que provoque le stress
thermique? Le stress hydrique augmenterait la stabilit du PSII la
chaleur par le renforcement des interactions entre les protines du
29
PSII et les lipides environnants. Cette hypothse repose sur certaines

autres tudes traitant uniquement du stress hydrique. Cette condition
de stress altrerait la composition lipidique de la membrane
thylacodienne (Ferrari-Iliou et al., 1984; Prabha et al., 1985).
L'implication des lipides lors du stress thermique fera
l'objet de la prochaine section.
3.1.2 Altration de la composition lipidique du thylacode:
Les fluctuations thermiques crent des variations de la

fluidit membranaire lies aux changements d'tat physique
(sparation de phases, transitions d'un tat ordonn vers un tat
dsordonn des lipides) (Mazliak, 1981). Ces changements sont causs
par le degr de saturation des lipides dans la membrane
chloroplastique (Pearcy, 1978; Raison et al., 1982).
Certaines tudes ont dmontr qu'un choc thermique
provoque une dcroissance du rapport monogalactosyl diacylglycrol
(MGDG) / digalactosyl diacylglycrol (DG DG) et augmente
l'incorporation de DGDG (avec acides gras saturs) au niveau du
thylacode. Il y a alors dcroissance de la fluidit membranaire et, de
ce fait, dcroissance de la permabilit passive des ions dans les
membranes (Sss et Yordanov, 1986).
La morphologie normale de la membrane thylacodienne,
en des empilements que l'on nomme grana, rsiste jusqu' une
temprature de 35C. Entre 35 et 45C, Gounaris et al. (1983,1984)
ont montr que l'incubation de chloroplastes cause un dsempilement
complet des grana et l'apparition de sites d'attachement entre les
surfaces membranaires (Sundbdy et Andersson, 1985) (Figure 14).
30
~=r
l
Figure 13 Modle illustrant l'effet de la dissociation du complexe

collecteur de lumire du photosystme II (LHCII) lors de
l'organisation de la membrane dans des conditions de stress
thermique. Le PSI n'est pas reprsent sur ce schma pour des raisons
de clart, ( .) reprsente les complexes collecteurs de lumire, ( ) les
protines du centre ractionnel du PSII (Gounaris et al., 1984)
31
Un chauffement des membranes provoque une
augmentation de l'nergie cintique moyenne des molcules, une
rupture des liaisons hydrognes, une transition de l'tat de gelcristallin vers un tat dsordonn (fluide) des chanes aliphatiques et
un renforcement des liaisons hydrophobes. Heureusement les
membranes biologiques ne contiennent pas seulement qu'une espce de
lipide (ou phospholipide) mais plutt plusieurs types de lipides qui se
diffrencient par leurs ttes polaires et par leurs chanes aliphatiques,
ce qui permet l'intgrit possible de ces membranes (Mazliak, 1981;
Sss et Yordanov, 1986). Toujours selon les travaux de Gounaris
raliss en 1984, s'il y a diminution de l'activit photosynthtique
durant un stress thermique (voir section 3.1.1) c'est principalement dt
une rorganisation structurale de la membrane thylacodienne
rsultant d'un dsempilement des grana (dissociation ainsi du
complexe collecteur de lumire au niveau du PSII), suite aux
modifications des lipides formant la structure membranaire.
Pour la protection de la membrane face ces modifications
lipidiques apportes par le stress thermique, certains chercheurs ont
observ qu'une hydrognation de la membrane thylacodienne
entrane une rsistance thermale de cette membrane en empchant
d'ventuels "dsempilements" des grana. Ainsi, l'augmentation des
lipides saturs au niveau du thylacode stabilise le PSII face au stress
thermique (Thomas et al., 1986; Vigh et al., 1989). D'autres tudes ont
dmontr que la prsence de sucre, selon la concentration et le type de
sucre, protge la membrane thylacodienne (isole) durant le stress
thermique (Back et al. 1979; Santarius et Bauer, 1983; Al-khatib et
Wiest, 1990). La stabilisation de la membrane la chaleur est possible
via un effet d'orientation des molcules d'eau qui augmentent la
rsistance des interactions hydrophobes de la membrane.
L'acclimatation ou les modifications des plantes
diffrentes tempratures leves de croissance rsulte, selon toutes les
tudes analyses prcdemment, en un changement dans la saturation
32
des lipides de la membrane thylacodienne et/ ou en un changement
dans les rapports lipides-protines de cette membrane (Chapman et
al., 1983) qui entrai ne une dsorganisation de la membrane (Al-Khatib
et Wiest, 1990).
3.1.3
Modifications possibles au niveau des complexes

pigmentaires:
Comme dj mentionn auparavant, l'exposition de

feuilles ou de chloroplastes des tempratures au-dessus de 40-45C
amne une perte quasi totale de l'activit photosynthtique. L'tude de
l'mission de fluorescence de la chlorophylle-a sous de telles
conditions de stress indique que le complexe collecteur de lumire
(CCL ou LHCII) et le centre ractionnel du PSII sont particulirement
susceptibles aux dommages thermiques (Armond et al, 1978; Schreiber
et al., 1976; 1977; 1978). Ces tudes dmontrent que des tempratures
leves conduisent une rorganisation fonctionnelle irrversible du
CCL au niveau du PSII.
De plus, une incubation des chloroplastes des
tempratures leves en prsence de lumire cause, selon certaines
tudes un blanchiment slectif des pigments photosynthtiques
(Gounaris et al., 1983: Thomas et al., 1984). Selon les tudes de
Gounaris ralises en 1983, l'exposition des chloroplastes au stress
thermique ( 40C) en prsence de lumire conduit un ''blanchiment''
substantiel dans les rgions rouges et bleues du spectre. En absence de
lumire le spectre d'absorption montre des maxima 440, 490 et 680
nm. La perte d'absorption 680 nm (stress en prsence de lumire)
reflte un ''blanchiment'' de la chl-a associe au P700 (principal
complexe du PSI), lequel possde son maximum d'absorption dans
cette rgion de longueurs d'ondes (Thornber, 1975). La chl-b,
possdant son maximum d'absorption 650 nm, ne prsente aucun
33
signe de ''blanchiment'' qui laisserait supposer que le complexe

collecteur de lumire (LHC), associ au PSII, serait touch dans ces
conditions de stress. Ce rsultat est en corrlation avec les travaux de
Havaux vus prcdemment et qui annoncent que le PSII est protg
durant le stress thermique par la prsence de la lumire.
3.1.4
Synthse des protines de choc thermique:
En 1962, Ritossa rapporte, suite des tudes sur la

Drosophila, qu'un choc thermique entrane l'activation de diffrents
gnes, ce qui conduit la synthse de plusieurs protines. En 1974,
toujours en utilisant la Drosophile, Tissieres et ses collaborateurs ont
dmontr pour la premire fois la formation de protines
correspondant un choc thermique, soit les protines de choc
thermique ou HSP (Nover et al., 1989). Il fut galement prouv que
tous les organismes produisent ces protines spcifiques (HSP) en
rponse une lvation de temprature. Des protines spcifiques
sont aussi synthtises lors de certains autres stress, comme un choc
aux tempratures froides, stress de dshydratation, etc (Lindquist et
Craig, 1988). Physiologiquement et gntiquement, les rsultats
indiquent que la production de ces protines spcifiques durant un
stress, soit les HSP, est essentielle pour la survie d'une cellule (Chen et
al., 1990), jouerait le rle de protecteurs contre les dommages
provoqus par la chaleur (Bauer et Senser, 1979).
Durant le choc thermique, soit une variation de
temprature de 10 15C au-dessus de la temprature ambiante de
croissance, la synthse d'un nouveau groupe de protines (HSP) est
privilgie aux dpens de la synthse des protines normalement
synthtises (Kimpel et Key, 1985). Durant le stress, l'extrme
sensibilit des ribosomes du chloroplaste entrane une limination des
protines synthtises par le gnome chloroplastique (Feierabend et
34
Mikus, 1977; Ellis, 1981). Cette rponse est rversible puisqu'un retour
des tempratures "habituelles de croissance" permet, aprs trois
heures, une rapparition des protines "normales". (Key et al., 1981)
3.1.5
Origine des protines de choc thermique:
La synthse des nouveaux polypeptides, en rponse un

stress thermique, est possible par l'alternance d'un gne d'expression,
(Sachs, 1986). Suite des expriences utilisant des anticorps
spcifiques et des gnes sondes, il est maintenant vident que les HSP
appartiennent des familles de protines. Pour tous les organismes
tudis, ces protines sont codes par des familles de gnes, par
exemple le gne HSP 70 kDa et le HSP 90 kDa chez la Drosophila
(Lindquist, 1988). Jusqu'ici, cinq familles peuvent tre dfinies: la
famille HSP90 (80-95 kDa), la famille HSP70 (63-78 kDa), la famille
HSP60 (53-62 kDa) relie aux organelles, la famille HSP20 (14-30 kDa)
et la famille relie l'ubiquitine (8.5 kDa). Chaque famille code pour
diverses protines qui se retrouveront par la suite dans diffrentes
parties de la cellule.
Bien que les plantes synthtisent une srie de HSP de
poids molculaires levs, la capacit translationnelle est consacre
la synthse des HSP de faibles poids molculaires (LMW) regroups
entre 14 et 30 kDa (Mansfield, 1987).
La provenance des protines du choc thermique a t
identifie comme d'origine nuclaire. Il a donc t dmontr par des
expriences effectues en prsence de cycloheximide ( antibiotique )
que la synthse des HSP peut-tre inhibe in vivo par le cycloheximide,
celui-ci empchant la synthse de protines provenant du gnome
nuclaire (Vierling, 1986). Les HSP ont ainsi une origine nuclaire et
peuvent se retrouver soit dans le cytoplasme cellulaire soit au niveau
35
du chloroplaste. C'est par les travaux de Kloppstech en 1985, que les

premires protines du stress thermique furent localises dans le
chloroplaste (Kloppstech et al., 1985). Indpendamment et
relativement au mme moment, d'autres groupes de recherche
parviennent la mme constatation (Vierling et al., 1986; Sub et
Yordanov, 1986). Par les tudes de Glaczinski en 1988, seulement deux
polypeptides ont t reconnus comme tant des protines du choc
thermique codes au niveau du noyau lors de stress thermique et
retrouves dans le chloroplaste (Glaczinski et Kloppstech, 1988). Pour
permettre le transfert de ces protines du cytoplasme vers le
chloroplaste, la synthse des protines se produit par la duplication
d'un gne nuclaire, pour une protine cytoplasmique, laquelle
acquiert une squence amino-terminale suffisante pour diriger par la
suite cette protine au niveau du chloroplaste (Vierling, 1988) (voir
section 2.2). Les protines prcurseurs de 26 et 30 kDa sont alors
transportes dans le chloroplaste o, par processus de maturation, ils
formeront les protines du choc thermique de 22 et 25 kDa.
3.1.6
Localisation des protines du choc thermique:
Comme mentionn auparavant et pour comprendre et

lucider le rle possible des HSP, il est essentiel d'tudier la
localisation intracellulaire de celles-ci. La localisation de ces protines
a t longtemps controverse. Par exemple, certains rapports
affirment qu'elles sont d'origine chloroplastique (Krishnasamy, 1988)
ou nuclaire (Vierling et al., 1986), qu'elles sont lies la membrane
thylacodienne (Kloppstech et al., 1985) ou retrouves libres dans le
cytosol chloroplastique (Chen et al,. 1990), ou encore associes des
ribosomes ou des prosomes au niveau du cytoplasme (Lindquist, 1988).
La majorit de ces protines du choc thermique, en
particulier celles de faibles poids molculaires, ont t localises dans
36
le cytosol. Durant le choc thermique, elles sont l'tat libre, ou

associes au cytosquellette (Lim, 1984). D'autres tudes ont dmontr
une incorporation des HSP dans les granules du choc thermique
(HSG), qui sont des agrgats de protines prsents dans le
cytoplasme, et dtectables au microscope lectronique. Ces agrgats
sont principalement composs de sous-ensembles de HSP (Nover,
1983; 1984; Neumann, 1984). Ces tudes sur les agrgats de HSP,
dmontrent que le rle des HSG est d'emmagasiner ou de protger le
ARNm prvenant ainsi sa dgradation lors du stress thermique
(Nover 1989). Lorsque les tempratures reviennent la normale, les
HSG se dispersent et s'associent troitement aux organelles actives
dans la synthse de protines, comme les polysomes (Neumann, 1989).
Des tudes plus rcentes ont dpist la prsence de HSG au niveau du
chloroplaste du pois (Chen 1990). Ces HSG, d 'environ 200 kDa, sont
des complexes de HSP, plus prcisment d'agrgats de protines de
choc thermique de 21 kDa (Glaczinski, 1988; Vierling, 1988, 1989), qui
possderaient un rle de protection analogue aux HSG prsents dans
le cytoplasme (Chen, 1990).
L'existence de HSP spcifiques aux chloroplastes a t
dmontre par plusieurs groupes diffrents (Kloppstech, 1985, 1986;
Vierling, 1986, 1988, 1989; Sss, 1986; Restivo, 1986; Schuster, 1988).
Diffrents rapports noncent que les HSP de faible poids molculaire,
tout spcifiquement les HSP 21, sont localises au niveau du
chloroplaste et sont clairement contenues, des tempratures
infrieures 38C, dans la partie soluble (Chen, 1990; Clarke, 1992).
Par contre, les tudes de Schuster (1988) ont dmontr que les HSP
seraient localises dans la membrane thylacodienne et suggrent, de
ce fait, qu'elles interagissent directement avec le PSU pour prvenir ou
rparer les dommages dus la chaleur (Schuster 1988). Dans cette
mme orientation, les tudes de Glaczinski en 1988 ont rapport que la
majorit des HSP sont lies la membrane thylacodienne des
tempratures suprieures 38C (Glanczinski et Kloppstech, 1988). La
transition entre la constatation des protines accoles ou non accoles
37
la membrane est trs troite, allant entre des tempratures de 36
40C selon l'espce vgtale. Les modifications lipidiques et protiques
de la membrane survenues lors du stress thermique faciliteraient
l'association des protines de stress avec la membrane. La liaison des
protines du choc thermique la membrane, par contre, ne peut tre
confirme dans les tudes de Vierling qui considrent cette liaison
comme le rsultat d'agrgations des HSP, sous forme de granules,
plutt que d'une association avec la membrane (Vierling et al., 1986;
Vierling, 1990).
3.2
Thermotolrance et protines du choc thermiqUE
Les physiologistes du monde vgtal sont depuis longtemps

familiers avec le phnomne d'adaptation au stress thermique, c'est-dire l'acquisition d'une tolrance ou rsistance la chaleur que les
espces vgtales prconisent (Sapper, 1935, Yarwood, 1961,
Alexandrov, 1970). La principale raison qui suscite l'intrt durable de
l'tude des stress physiologiques, et en particulier le choc thermique,
est que les plantes qui sont fixes leur habitat naturel, ne peuvent pas
chapper aux conditions de stress. Il est primordial de comprendre et
d'expliquer ce phnomne de thermotolrance qui rend les plantes
aptes supporter une lvation de temprature. Le mcanisme de
protection contre les tempratures leves n'a pas encore t lucid.
Par contre, avec la dtection et la caractrisation des HSP, les aspects
cellulaires de la rponse au stress thermique et le rle possible de ces
HSP pour l'induction de la thermotolrance sont devenus les champs
d'tudes de prdilection depuis ces dernires annes (Al-Khatib, 1990;
Bames, 1990; Mackey, 1990; Clarke, 1990; Krishnan, 1989; Marmiroli,
1989; Bonham-Smith, 1987; Sss, 1986; Burke, 1985; Xiao, 1985; Barry,
1983; Santarius, 1979).
38
3.2.1 Induction de la thermotolrance:
Selon la procdure utilise pour administrer le choc

thermique, il y aura diffrentes perspectives de l'induction de la
thermotolrance (Nover, 1990). Il existe des diffrences videntes des
tats de thermotolrance observs:
a) aprs un court et lger choc thermique.

b) aprs une longue adaptation (graduelle).
c) aprs un svre choc thermique appliqu durant
plusieurs heures (Boon, 1986).
Des travaux raliss en 1977 par Pearcy dmontrent que

la temprature de croissance des plantes a un effet substantiel sur la
performance photosynthtique de ces plantes (Pearcy et al. 1977;
Pearcy, 1977). Ces tudes sur l'induction de la thermotolrance par une
longue adaptation montrent que la croissance de plants 23 / 18C
(jour / nuit) en comparaison avec une culture 43 /23C a t trs
susceptible l'effet d'une augmentation de la temprature. L'analyse
de l'absorption du C02 demeure constante jusqu' l'exposition des
plantes 30.9C pour la culture base temprature. Cependant,
l'exposition des plantes cultives temprature leve supporte l'effet
de la chaleur jusqu' une temprature de 40.9C. Ces tudes
dmontrent donc la possibilit de l'acquisition d'une tolrance la
chaleur.
Selon certaines autres tudes (Marmiroli et al., 1989),
pour acqurir cette adaptation (ou thermotolrance), il est primordial
de provoquer d'abord la synthse des HSP. Cette synthse est obtenue
en faisant subir aux spcimens un prtraitement la chaleur (de
courte dure) de une heure 34C (les prtraitements diffrent
39
lgrement par la temprature et la dure selon l'auteur). La synthse
de protines du choc thermique est alors observe par des techniques
d'lectrophorse qui dmontrent la prsence de protines de diffrents
poids molculaires, 81, 69, 37, 31, 27, 21 et 17 kDa (les poids
molculaires ainsi que le nombre de protines de choc thermique
retrouves varient selon l'espce vgtale). Cette variation dans la
composition protique permettrait nos spcimens biologiques, selon
ces tudes, de prsenter une thermoprotection lors d'un second choc
thermique une temprature normalement ltale ou tout simplement
une temprature qui empche habituellement la croissance normale
de l'espce vgtale. Cette thermotolrance est caractrise par la
capacit des spcimens pr-traits continuer leur croissance (tude
des vitesses de croissance) lors d'un retour aux tempratures normales
(25C) (Seemann et al., 1986). Il est prciser que cette
thermotolrance est inexistante chez le spcimen tmoin n'ayant pas
t soumis des petites lvations de temprature durant leur
croissance.
L'induction de la thermotolrance est possible et des
tudes sur l'activit photosynthtique (fixation du C 02) ainsi que sur
la croissance des plantes concrtise ce phnomne. L'explication de
cette rsistance la chaleur est attribue des causes diffrentes selon
l'auteur. Certains prconisent l'influence des HSP, d'autres des
modifications lipidiques ou encore une rorganisation de la
membrane.
3.2.2
Relation entre l'apparition des HSP et

l'expression de la thermotolrance.
Il n'y a pas de fonction spcifique qui a t tablie pour

chacune des protines de choc thermique. Par contre, certaines tudes
viennent confirmer un rle spcifique quelques protines. Plusieurs
40
protines de stress thermique, comme celles provenant des familles

HSP60, HSP70 et HSP 90, sont connues pour tre des protines ou
molcules "chaperones". Ces polypeptides sont classs parmi les
protines qui jouent un rle dans le transport.. le repliement et
l'assemblage de certaines autres protines. Ainsi les chaperones aident
d'autres protines, synthtises au niveau du noyau, traverser
certaines membranes telle que les membranes mitochondriale et
chloroplastique, pour permettre la protine de gagner son
emplacement dfinitif. Ces chaperones facilitent le repliement des
protines (formation de structure tertiaire) et aussi permettent la
formation de structures multimriques par l'assemblage de protines
(Rothman, 1989; Gething et Sambrook, 1992). Beaucoup d'tudes
labores sur le HSP70 ont permis de concrtiser son rle dans la
cellule. Le HSP70 facilite la translocation de protines travers les
membranes d'organites telle que le rticulum endoplasmique ainsi que
de la mitochondrie (Deshaies et al., 1988). Un homologue de ce HSP70
a t aussi identifi pour le chloroplaste (Marshall et al., 1990) et
localis l'extrieur de l'organite ainsi que dans le stroma. Celui-ci
permet la translocation de certaines protines dans le chloroplaste.
Ces HSP70, localiss au niveau du chloroplaste ont t confirms par
plusieurs auteurs et chez diffrentes espces, tels l'pinard (Ko et al.,
1992) et le pois (Marshall et Keegstra, 1992). De toutes rcentes tudes
suggrent que le HSP70 dans le stroma du chloroplaste aurait comme
fonction d'entraner l'intgration de l'apoprotine prcurseur du
complexe collecteur de lumire (au niveau du PSII) dans la membrane
thylacodienne (Yalovsky et al., 1992; Tsugeki et Nishimura, 1993). Par
contre, plusieurs autres protines de stress n'ont pas de fonction qui
leur soit attribue, seulement des hypothses qui confrent certaines
HSP un rle dans la protection contre les dommages entrans par un
choc thermique (Mc Alister, 1980; Key, 1985; Schlesinger, 1986). Les
HSP doivent jouer un rle lors du stress thermique, puisque leur
synthse est active la chaleur. De plus la protine de HSP21 est une
protine synthtise seulement lors du stress thermique (Chen et al,.
1990) ainsi elle a surement une fonction bien particulire. Les HSP
41
sont-ils l'origine de l'acquisition de la thermotolrance ? Si

comment agissent-ils? A quel niveau interagissent-ils?
OUI,
Les recherches les plus nombreuses et les plus importantes

sur l'implication des HSP ont t produites par Marmiroli en 1986 1989 ainsi que Krishnan en 1989. (Lin, 1984; Wu, 1984; Xiao, 1985;
Bienz, 1987; Key, 1983, 1985; Kimpel, 1985; Linquist, 1986; Schlesinger,
1986; Schuster, 1988; Schoffl, 1984; Ougham, 1986). Ces recherches
dmontrent une certaine corrlation entre l'accumulation de HSP chez
les plantes et leur adaptation tout autre augmentation de
temprature. Les cintiques de thermotolrance induites par un choc
thermique sont en corrlation avec les cintiques de synthse des HSP
(Howarth, 1990). D'autres tudes de vitesse de croissance sur le bl
(Krishnan, 1989), sur les fves de soya (Lin, 1984), ainsi que sur des
plantules (Goycoolea et Cardemil, 1991), ralises dans des conditions
de pr-taitement lgrement diffrentes, convergent toutes vers un
mme rsultat. Ces recherches n'ont pas identifi la localisation de ces
HSP, ni de quelle faon ils interagissent pour crer l'adaptation et
permettre la croissance de l'espce malgr le choc thermique.
Cependant, ils sont tous en accords sur le fait que les HSP ont une
tche jouer dans l'acquisition de cette thermotolrance.
Puisque la prsence de ces protines pourrait tre
l'origine de l'acquisition de la thermotolrance, il est indispensable de
localiser ces HSP. Est-ce que la prsence des HSP dans la partie
soluble (stroma) suffit permettre la croissance des plantes malgr un
choc thermique? Les HSP ont-ils une localisation plus prcise pour
entraner la thermotolrance, par exemple au niveau de la membrane
thylacodienne qui est a l'essence mme de la survie des espces
vgtales?
42
CHAPITRE 4
MATRIEL ET MTHODES
4.1 Prparation du matriel biologique
4.1.1 Culture de l'orge:
Le Matriel biologique utilis dans cette tude est une culture

d'orge ralise sur vermiculite, sans autre ajout. La pousse se droule
sous des conditions contrles de temprature et d'illumination. Une
phase lumineuse 24 oC est suivie d'une phase sombre de 8 h 20 oC.
La croissance est mene jusqu'au jour 7, dans des conditions
d'humidit adquates.
4.1.2 Traitement du choc thermique:
L'augmentation de la temprature pour le choc thermique

s'effectue durant la phase lumineuse de croissance. Les plants d'orge
sont ainsi dposs dans une chambre de croissance pr acclimate 40
oC. Ce traitement est d'une dure de 3 h et pour empcher une
dshydratation des plants nous avons recours des priodes
frquentes d'arrosage.
43
4.1.3 Incorporation d'antibiotiques:
Dans cette tude nous observons l'influence de certains

antibiotiques sur le phnomne photosynthtique de nos plants d 'orge.
Il faut tout d'abord introduire ces antibiotiques aux plants. Pour
permettre l'incorporation, il est primordiale premirement de couper
les plants d'orge la racine et de les dposer par la suite dans la
solution antibiotique. La coupe des plants permet une meilleur
pntration des antibiotiques par osmose. Les antibiotiques utilises
sont le chloramphnicol et le cydoheximide, tous deux solubiliss soit
5 mM ou 15 mM dans un alcool. Le solvant qui t utilis dans ces
expriences est le mthanol.
4.1.4 Incorporation de la radioactivit:
Pour permettre une bonne et rapide incorporation de la

radioactivit dans nos plants d'orge, nous devons procder une
coupe des plants la racine. Ces plants sont ensuite dposs dans une
solution de 10 mM Tris-HCI pH 7.5, contenant 20 ~Ci/ml de 3%methionine. Cet acide amin a pour but de s'incorporer aux protines
nouvellement synthtises. Nous avons observ qu'aprs 15 min de
trempage, 50 % de la radioactivit totale incorpore se retrouve par
osmose, au bout de la feuille d'orge.
i)
Compteur scintillation:
Le dosage de la radioactivit, aussi bien lors de la

prparation des solutions que une fois la radioactivit incorpore aux
plantes, est effectu par un compteur scintillation de marque LKB
44
Wallac 121S RackBeta. L'chantillon analyser (solutions, bouts de

feuille, extractions des membranes etc) doit tre dpos sur un papier
filtre (pour les chantillons en solution) et ensuite dpos dans un petit
rcipient de plastique contenant pralablement une solution
scintillations. Cette solution comporte un solvant, le tolune et un
solut, soit un compos organique de la srie aromatique, comme le
PPO et le POPOP. Cette solution organique a pour but d'absorber
l'mission de radioactivit et de se retrouver ainsi sous l'tat de
molcules excites. Le retour de celle-ci l'tat fondamental est
observ par l'mission de photons. La quantit de photons alors mise
est proportionnelle au nombre d'missions radioactives. L'mission de
photons est dtecte au moyen d'un tube photomultiplicateur (MPT)
trs sensible, qui amplifie le signal et gnre un voltage puls
proportionnel au nombre de photons mis.
4.2 Extractions et purifications du matriel bioloiigue
Toutes les extractions suivantes sont ralises partir de feuilles

d'orge ges de 7 8 jours. Les extractions sont de plus effectues
rapidement sur la glace (pour ainsi empcher la dgradation du
matriel) et en prsence d'un clairage vert (pour empcher le
processus photosynthtique de se faire).
Pour chacune des mthodes d'extraction, toutes les centrifugations
sont effectues 4C dans une centrifugeuse Sorval RC-SB avec un
rotor de type 55-34 godets fixes.
45
4.2.1 Extraction des cellules:
Les plantes sont soumises une priode de noirceur de 24 h suivie

d'une priode d'clairement de 2 h avant l'isolation des cellules. Les
feuilles sont coupes finement et incubes, avec agitation, dans un
tampon contenant 300 mM de sorbitol, 12.5 mM de K2S 04, 1 % de
sulfate dextran, 0.00075 % de pectolyase et 100 mM d'HEPES-KOH
pH 7.3. Ensuite les cellules sont filtres sur filtres de nylon de 100 um et
de 20 um. Les cellules sont replaces en suspension dans un tampon
constitu de 100 mM d'HEPES-KOH (.5M) pH 7.8, 100 mM de Tri ci ne
KOH pH 7.8 et 200 mM de sorbitol et ensuite le tout est centrifug
1500 x g pendant 5 min. Les culots sont mis en suspension dans un petit
volume du tampon fonn de 100 mM d'HEPES-KOH pH 7.8, 250 mM
de sorbitol, 2 mM de CaCI2" 1 mM de MgS04, 5 mM de KN03, 0.5
mM de KH2P04, 0.01 mM de CuS04 et 0.2 % de BSA.
4.2.2 Extraction des chloroplastes:
L'utilisation de 50 g de feuilles est ncessaire pour cette extraction.

L'homognisation est obtenue dans 300 ml de tampon contenant 6 ml
de la solution suivante: sorbitol 660mM, 20 mM de KCl, 2 mM de
EDTA et 100 mM HEPES-KOH ( pH 7.9 ) et de 294 ml de sorbitol 330
mM pour obtenir finalement une solution d'extraction de 300 ml. Le
rsultat de l'homognisation est filtr sur du coton fromage et
centrifug 2000 x g pendant 100 sec. Les culots sont alors mis en
suspension dans 80 ml du tampon d'homognisation et centrifugs
2000 x g pour une dure de 90 sec. Il y a resuspension des culots dans 1
ml du tampon contenant 330 mM de sorbitol, 10 mM de KCI, 1 mM de
EDTA, 1 mM de MgCI2" 1 mM de MnCI2" 1 % de BSA et 50 mM du
tampon HEPES-KOH ( pH 7.9 )
46
4.2.3 Extraction des membranes thylacodiennes:
Dans un malaxeur commercial, environ 50 g de feuilles d'orge,

laves et assches, sont broyes dans un tampon d'homognisation
constitu de 330 mM de sorbitol, 5 mM de MgCl2 et 20 mM de TesNaOH (pH 7.5) dans un volume final de 300 ml. L'homognat est
ensuite filtr sur des couches de coton fromage et centrifug 2000 x g
pour une min. Le culot est resuspendu dans le tampon
d'homognisation 20 fois dilu et ensuite centrifug 4000 x g pour
une min. Finalement le culot est resuspendu dans un tampon
contenant 50 mM de Tes-NaOH (pH 7.5), 300 mM de sorbitol, 2 mM
de MgCI2, 1 mM de NH40 et 2 mM de EDTA pour obtenir une
concentration finale de 2 mg Chl/ml.
4.2.4 Extraction des complexes protiques:
L'extraction des complexes protiques peut se faire partir d'une

extraction de thylacodes de PSI ou de PSII. Lors de la dernire
centrifugation de l'extraction de la membrane thylacodienne, les
culots sont resuspendus dans 2 mM de Tris-malate pH 7.0 et incubs
dans la glace l'obscurit pour une priode de 10 min, suivi d'une
centrifugation de 15 min 4000 x g. Les culots sont resuspendus dans 2
mM de Tris-malate pH 7.0 et 10 % de glycrol. Une deuxime
centrifugation de l'chantillon est ncessaire de 15 min 4000 x g. Le
culot est resuspendu dans le tampon final form de 2 mM de trismalate pH 7.0, 0.88 % d'octyl glucoside, 0.22 % de SDS, et 10 % de
glycrol, dans un rapport de 20/5/1 ( octyl glucoside/SDS/Chl ). Une
incubation de 5 min l'obscurit est requise avant une dernire
centrifugation de 5 min 2000 x g. Les complexes protiques sont
recueillis finalement dans le surnageant.
47
4.2.5 Extraction des protines totales:
Deux mthodes d'extraction des protines totales ont t utilises.

La premire d'aprs la mthode de Lin et al. (1984) et la seconde
d'aprs celle de Terao (1989). Une seule feuille suffit pour ce genre
d'extraction.
Selon la mthode de Lin, la feuille est broye dans 50 mM de TrisHCI pH 8.5 contenant 2 % de SDS, 2 % de mercaptothanol et 1 mM
de PMSF. Le tout est centrifug 5000 x g pour 30 min et le filtrat est
trait avec 5 volumes d'actone - 20C pour une nuit. Le prcipit
form est alors sch au lyophilisateur et les protines totales peuvent
tre resuspendues dans un tampon pour tude.
Selon l'autre mthode, la feuille est homognise dans un
tampon contenant 50 mM de tricine-NaOH ph 7.8, 2 mM de MgCI~
10 mM de NaCI et 2 mM de PMSF. L'homognat est centrifug 2000
x g pendant 10 min. Le prcipit est lav deux fois dans le mme
tampon d'homognisation pour rcuprer les protines solubles du
surnageant. Les protines insolubles sont obtenues aprs un
traitement du culot 25C pendant 30 min avec 125 mM de Tris-HCI
pH 6.8 contenant 2.5 % de SDS et 5 % de mercaptothanol. Les
protines sont isoles du surnageant aprs une centrifugation de 10
min 2000 x g.
4.3 Techniques biochimiques
Les mthodes biochimiques employes sont les lectrophorses

pour la sparation de nos polypeptides tudier. Ces protines
peuvent se sparer et se distinguer les unes des autres grce au tamis
d'acrylamide qui constitu le gel d'lectrophorse. Le gel est form par
48
la polymrisation d'un monomre d'acrylamide CH2=CH-CO-NH2

en une longue chane de polyacrylamide et est li par l'inclusion d'un
co-monomre bifonctionnel soit le N,N'-methylene-bis-acrylamide
CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2.
La
raction
de
polymrisation est initie par le persulfate d'ammonium qui active un
second compos, le TEMED. A son tour le TEMED active un
monomre d'acrylamide qui ragit avec un monomre non activ pour
ainsi former une chane de polymrisation tridimentionnelle. La
concentration utilise d'acrylamide dtermine la longueur de la chane
du polymre tandis que la concentration de bis-acrylamide dtermine
l'tendue des liaisons entre les chanes du polymre. Ainsi les deux
concentrations influencent les proprits physiques du gel, comme sa
densit, son lasticit et la dimension de ses pores.
La mobilit lectrophortique d'une molcule dpend la fois de
sa charge nette et de sa dimension (en relation avec son poids
molculaire). Une protine possdant une charge nette trs leve
aura tendance se dplacer plus rapidement (d au champ lectrique
appliqu) qu'une protine de faible charge. Par contre, pour une mme
charge nette, une protine de faible dimension se dplacera beaucoup
plus vite qu'une protine possdant un volume imposant (d aux
forces de friction).
Deux types d'lectrophorse sont utiliss, l'lectrophorse dite
dnaturante, soit celle contenant un dtergeant du type SDS ou LDS
qui ont pour effet de dnaturer les polypeptides et l'lectrophorse non
dnaturante en absence de ces dtergeants pour l'tude des complexes
de protines.
49
4.3.1 Electrophorse SDS-Page (dnaturante):
Les gels d'acrylamides sont couls entre deux plaques de verre et

ensuite fixs sur un bassin de plexiglasse pour la migration. Les
chantillons analyser sont dposs sur un gel (de rsolution)
gradient de 10 17.5 % d'acrylamide contenant un tampon de TrisHCL SDS pH 8.8, une quantit de sucrose (pour la formation du
gradient), 1.8 % de persulfate d'ammonium et 0.04 % de TEMED. Le
gel d'empilement est de 5 % en acrylamide et contient un tampon de
Tris-HCI SDS pH 6.8, 63 % de H20, 0.2 % de persulfate d'ammonium
et 0.04 % de TEMED. Le temps de polymrisation complet du gel est
d'environ 1 h. Le tampon de migration contient 25 mM de Tris, 200
mM de glycine et 0.1 % de LDS. L'alimentation lectrique, de type
ISCO model 494, fournit un courant constant de 18 mA et le temps de
migration varie entre 5 et 6 h. Toutes les migrations sont effectues
4C.
4.3.2 Electrophorse non dnaturante:
Comme dj mentionn, une lectrophorse non dnaturante ne

contient pas de dtergent du type SDS ou LDS qui pourrait causer une
dnaturation des protines. De plus, les chantillons ne subissent pas
le traitement au mercaptothanol qui briserait les liaisons disulfures
entre les acides amins avant la migration.
La migration des complexes protiques se fait sur un gel 10 %
d'acrylamide, contenant 1.3 M de Tris-HCI pH 9.8, 13,5 % de H20, 1.6
% de persulfate d'ammonium et 0.07 % de TEMED. Tandis que le gel
d'empilement est de 5 % d'acrylamide contenant 100 mM de Tris-HCI
pH 6.1, 63 % de H20, 3.7 % de persulfate d'ammonium et 0.16 % de
TEMED. Le temps de polymrisation du gel est d'environ 1 h 30 min.
50
4.3.3 Analyse des lectrophorses:
i)
Techniques de coloration.
Aprs leur migration sur un gel d'acrylamide, la plupart

des protines (sauf l'exception des complexes protiques sur gels non
dnaturants) peuvent tre dtectes seulement par des techniques de
coloration, ou encore au moyen de marqueurs radioactifs.
A. Coloration au bleu de coomasie:

Le gel est dpos une nuit dans une solution de bleu de
coomasie (0.05 %) contenant 7 % d'acide actique et 50 % de mthanol.
Le gel est ensuite dcolor dans une autre solution forme de 7 %
d'acide actique et 20 % de mthanol jusqu' ce que les bandes des
protines soient bien perceptibles.
B. Coloration l'argent:
Le gel d'acrylamide est d'abord fix dans une solution 50
% en mthanol pour 1 h. Par la suite, le gel est lav l'eau distille
deux ou trois fois. La solution de coloration contient 20 % de nitrate
d'argent et elle est ajoute goutte goutte une solution contenant
0.08 % d'hydroxyde de sodium et 0.2 M d'hydroxide d'ammonium. Le
gel est tremp (avec agitation) dans cette solution pendant 1 min et
dans l'eau distille 5 min. Le gel est ensuite dvelopp par une solution
contenant 0.005 % d'acide citrique et 0.02 % de formaldehyde jusqu'
ce que les bandes apparaissent. Il est alors lav dans l'eau distille
pour finalement tre dpos dans un bain d'arrt (du dveloppement)
contenant une solution de mthanol 50 %.
51
ii) Densitomtrie.
Les gels d'lectrophorse une fois colors sont dposs

dans le densitomtre qui effectue la lecture de chacune des bandes
l'aide d'un laser hlium-non (faisceau monochromatique 633 nm).
La portion de lumire non absorbe par l'chantillon parvient au
dtecteur et produit un photocourant qui est proportionnel la
quantit de lumire dtecte.
Les densitogrammes sont produits au moyen d'un
densitomtre laser LKB 2222-020 de type UltroScan XL. Les donnes
sont traites sur microordinateur par le programme Gelscan
(Pharmacia LKB).
iii) Autoradiographie.
La technique d'autoradiographie est utilise pour dtecter

la radioactivit incorpore dans les protines qui sont spares par
lectrophorse. Premirement le gel est color et ensuite sch entre
deux feuilles de cellophane sous vide. Une premire lecture du gel est
prise au densitomtre avant de dposer celui-ci dans une cassette
d'amplification du signal radioactif qui contient un film
photographique de type X-OMAT pour l'obtention d'une rsolution
des protines radioactives. La dure du contact entre le gel et le film
-BOoe dpend de la quantit de radioactivit dpose sur le gel. Les
films photographiques sont ensuite dvelopps au centre de radiologie
de l'hopital Ste-Marie Trois-Rivires et analyss pour une seconde
fois par densitomtrie.
52
4.4 Techniques biophysiques
4.4.1 Spectrophotomtrie UV-visible et dtermination de la

chlorophylle:
Suite aux extractions des membranes thylacodiennes il est

primordial de dterminer la proportion en chlorophylle que possde
l'extrait. Cette analyse des pigments permettra de rgulariser les
quantits de membranes utilises dans nos tudes. Les mesures
d 'absorbance, pour la dtermination de la chlorophylle, sont prises sur
un spectrophotomtre SPECIRONIC modle 601 simple faisceau
545 et 663 nm selon la mthode de Amon (Amon, 1949).
Lorsque les complexes protiques de la membrane thylacodienne
sont isols et spars par lectrophorse, une tude individuelle est
possible. Chaque bande est alors dcoupe et passe au
spectrophotomtre, pour obtenir sa constitution en Chl a et b. Des
spectres d'absorption par balayage sont effectus de 400 750 nm par
un spectrophotomtre PERKIN-EL11ER modle 553 double
faisceaux.
4.4.2 Electrode oxygne et activit photosynthtique:
Une fois la membrane thylacodienne extraite des plants d'orge

(voir mthode d'extraction), il est possible de la replacer dans des
conditions idales pour obtenir une activit photosynthtique normale
(lorsque les membranes photosynthtiques sont intgres et isoles
parfaitement). L'activit photosynthtique est value par le
dgagement d'oxygne lors de la photolyse de l'eau au niveau du
centre ractionnel du psu. Ce dgagement d 'oxygne est capt par
53
une lectrode de type Clark qui est relie un moniteur YSI modle 53
pour nous donner l'information sur la qualit de nos membranes.
Nous pouvons obtenir des valeurs de dgagement d'oxygne allant
jusqu' 200 J-lmol d'02/mg Chl.h.
Les mesures de dgagement d'oxygne sont prises dans une
cellule thermostate 21C (maintenue constante l'aide d'un bain de
marque Cole Parmer) qui contient un tampon form de Mes-NaOH 20
mM pH 6.5, 1 mM de NaCI et de 500 J-lM de MgCI2. TI est essentiel
d'utiliser un accepteur artificiel d'lectrons comme le 2,5-dichloro-pbenzoquinone 0.18M (DCBQ) pour observer un dgagement
d'oxygne. Le DCBQ est un accepteur au niveau du transfert entre
QB et le bassin de plastoquinones. L'extrait de membrane est utilis
une concentration de Il J-lg de Chl/ml pour un volume total dans la
cellule de 3 ml. La solution est dsoxygne l'aide d'un barbotage
l'azote 1 min. Comme source lumineuse employe un projecteur de
type halogne au quartz qui est utilis une intensit maximale de 150
W.
4.4.3 Microscope optique et intgrit des chloroplastes:
L'intgrit des chloroplastes s'observe l'aide d'un microscope

optique (modle Wild) seulement 1000 X en immersion dans l'huile.
L'utilisation des colorants comme le bleu de coomasie, dans une
solution de chloroplastes, est ncessaire pour permettre une
distinction des organites intgres de ceux clats lors de l'extraction.
Ainsi, il est possible de dterminer si la double membrane du
chloroplaste est brise ou non. Lorsque la membrane a cd, lors de
l'isolation du chloroplaste, le colorant peut s'introduire dans le
cytoplasme de l'organite Une membrane bien conserve cle le
chloroplaste contre l'entre du colorant. Il est alors possible de
dterminer un pourcentage relatif de l'intgrit des chloroplastes.
54
Une autre mthode, plus prcise, permet de faire ce mme calcul.

Il est possible de dterminer l'intgrit des chloroplastes par le
dgagement d'oxygne de ces derniers. Les chloroplastes sont dposs
dans la cellule de dgagement d'oxygne, en prsence de 330 mM de
sorbitol, 2 mM de EDTA, 1 mM de MgCl2 et de 50 mM de HEPESKOH pH 7.6. La solution contient aussi 200 mM de DL-glyceraldhyde
qui prvient le dgagement d'oxygne par le C02 prsent dans
l'chantillon. Le ferricyanure de potassium ( 50 mM ), qui est utilis
comme accepteur d'lectrons, ne traverse pas la double membrane du
chloroplaste. Ainsi une comparaison du dgagement d'oxygne est
possible entre un chantillon de chloroplastes intacts et un autre dont
les chloroplastes ont t volontairement clats. Il est alors possible de
calculer un % d'intgrit des organites dans notre extraction.
4.4.4 Infra-rouge transform de Fourier:
Les tudes sont ralises sur un appareil infra-rouge

transform de Fourier (FTIR) de type Bornem DA3.2 avec dtecteurs
MCT, refroidi l'aide d'un systme de circulation d'eau et d'azote
liquide. La technique employe par le FTIR est la mthode la plus
avance en spectroscopie infra-rouge. Les tudes effectues sur cet
appareil permettent d'accder une chelle plus large de nombres
d'onde soit de 400 4000 cm- 1. La radiation absorbe par une
molcule, cause des vibrations aux diffrentes liaisons de cette
molcule par la transition entre l'tat fondamental et excit.
55
i)
Prparation des chantillons.
Pour obtenir de meilleurs rsolutions des spectres d'infrarouge, les chantillons sont traits dans le but d'liminer la plus
grande quantit d'eau possible. Puisque cette dernire possde des
bandes d'absorption considrables 3400 cm- l et 1640 cm-l, il est
alors prfrable d'liminer toute l'eau possible qui altrerait une
lecture convenable des spectres de nos membranes thylacodiennes.
Ainsi nos membranes sont mises en prsence d'un tampon de
resuspension, prpar avec du D20, pour 2 h, pour ensuite tre
centrifuges 4000 x g et resuspendues de nouveau dans le mme
tampon. Les chantillons de membranes sont prts tre dposs sur
des cellules de BaF2 pour une nuit dans un dessiccateur et l'obscurit.
La lecture des spectres s'effectue lorsque les chantillons sont
compltement asschs.
56
CHAPITRE 5
RSULTATS ET DISCUSSION
PARTIEl
L'exposition de plantes une lvation de temprature entrane

des modifications vrifies sur la composition lipidique et protique de
la membrane photosynthtique. Plusieurs tudes confirment que l'effet
d'un stress thermique appliqu directement sur le thylacode isol
entrane des modifications extrmes qui auront comme consquence
de provoquer l'inactivation de l'appareil photosynthtique. Ainsi cette
membrane thylacodienne ne montre aucun signe de tolrance la
chaleur. La membrane photosynthtique isole de son milieu ne peut
obtenir aucune aide provenant du cytoplasme de la cellule ou mme du
chloroplaste. De plus, dans ces conditions elle ne semble pas tre en
mesure de fournir des modifications structurales comme protection
la chaleur. Les altrations qu'elle subira consisteront en des
dsorganisations lipidiques (dsempillements des grana) ainsi que la
dissociation de protines ou de complexes protiques nuisibles son
intgrit et sa fonction. Est-ce que ces transformations sont aussi
invitables et radicales "in vivo" au niveau de la plante entire? Ainsi,
est-ce que le thylacode (non isol) obtient une aide de son
environnement cellulaire ou chloroplastique pour sauvegarder son
intgrit? Dans ce travail nous ferons subir un stress thermique des
plantules d'orge et en vrifierons l'effet au niveau de la membrane
thylacodienne
57
5.1 Modifications structurales de la membrane

photosynthtique
Une lvation de temprature apporte des changements physiques

et structuraux aux protines de l'appareil photosynthtique. Par
exemple, plusieurs chercheurs ont identifi une dissociation du LHCII
associe au centre ractionnel du PSII (Schreiber et Armond, 1978;
Armond et al 1980; Krause et Weis, 1984) ainsi qu'une modification la
conformation de la protine Dl associe elle au centre ractionnel du
PSII des thylacodes (Wiest, 1986). Notre analyse des altrations
structurales se pratique suite l'application du stress thermique sur la
plante entire. Dans un deuxime temps l'extraction et la prparation
de la membrane sont ralises pour une tude par FTIR
Les analyses en FTIR serviront de contrle sommaire dans la
dtermination d'un changement conformationnel possible de la
membrane apport lors du stress thermique.
5.1.1. Etude des changements conformationnels des

protines de la membrane thylacodienne par FTIR:
Des changements conformationnels au niveau de la

membrane et des protines qui la constitue, peuvent tre observs en
se basant sur un spectre infra-rouge en localisant les bandes amides,
soit amide 1 et amide II (He, 1991; Nabedrik, 1989). Des
transformations telles que des changements de conformation a et 15
des protines sont analyses par l'tude de ces deux bandes: Ainsi, les
frquences de transition des deux bandes amides sont dpendantes de
58
la conformation secondaire des protines (Susi, 1986, Surewicz, 1988;

Jackson, 1989). D la complexit du matriel utilis (soit l'analyse de
la membrane thylacodienne), les bandes amides 1 et II sont en fait des
chevauchements des maxima de plusieurs vibrations. Il serait par
contre possible par des dconvolutions des spectres, d'analyser la
structure secondaire (Kauppinen; 1981; Yang, 1985; Byler, 1986). Les
deux spectres obtenus ne dmontrent aucune transformation
apparente et majeure des thylacodes provenant de plantes
acclimates la chaleur en comparaison avec les tmoins (Figure 14).
Les protines membranaires semblent conserver leur intgrit face
l'augmentation de la temprature, puisque la bande amide 1 (structure
a) se retrouve 1657 cm-1 dans chacun des spectres et la bande amide
II (structure 15) 1547 cm-1 n'est pas dlocalise. Par contre des tudes
sur la membrane thylacodienne isole dmontre que celle-ci subit des
altrations des tempratures leves, en rpondant par une
augmentation en structure 15 (He, 1991). Une soustraction de ces
spectres est ncessaire pour obtenir plus d'information sur les
variations des structures secondaires des protines. Cependant cette
dmarche n'a pu tre effectue.
5.1.2. Etude des complexes pigments-protines:
Dans cette partie du travailles complexes pigment-protine

seront tudis afin de vrifier les modifications apportes par un choc
thermique. Suite aux extractions de ces complexes (voir mthode
d'extraction section 4.3.4), ils sont premirement analyss par
lectrophorse et deuximement, chaque complexe est tudi
individuellement par spectroscopie.
59
amide l
1900
,
1400
900
nombre d'onde (cm-1 )
FIGURE 14
Spectre infra-rouge (FTIR) de la membrane
thylacodienne isole (a) de plants d'orge non acclimats (tmoin 23C)
ou (b) de plants d'orge acclimats 40C. La bande amide 1 est
observe 1657 cm- 1 et la bande amide II 1547 cm- 1.
60
L'extraction des complexes partir de plants d'orge permet

d'isoler quatre groupements de protines et pigments (Figure 15 et 16).
De ces groupements, nous nous intressons trois seulement, soit les
complexes du PSI (CPI) et du PSII (CPII*, CPII). Les CPII* et CPII
constituent respectivement la forme agrge et non agrg de
l'antenne pigmentaire du photosystme II. L'analyse de
l'lectrophorse par densitomtrie nous signale une lgre rduction
de 20% des pigments appartenant au PSI (CPI) ainsi qu'une
diminution de 49% des pigments associs au PSII (CPII) pour les plants
d'orge acclimats la chaleur. Le stress thermique apporte donc une
agrgation de ces complexes, agrgation qui est plus prononce chez
le PSII que chez le PSI. Cette observation n'est pas surprenante tant
donn que plusieurs tudes ont dmontr que le PSII demeure le
photosystme le plus susceptible l'effet de la chaleur. Cette tude
des effets du stress thermique au niveau de la membrane
thylacodienne, nous permet de confirmer la sensibilit du PSII. Suite
l'analyse du densitogramme, nous observons par ailleurs une
augmentation du complexe CPII* suite au stress thermique. Cette
augmentation de la forme agrge du PSII de 48% est en corrlation
avec la diminution de 49% du CPII. Il est possible que cette
augmentation soit relie la susceptibilit du PSII au stress thermique.
L'examen des complexes pigment-protine en spectroscopie

atteste que le complexe CPI associ au PSI n'est pas perturb par le
choc thermique (Figure 17). Aucun changement ou modification dans
la forme des spectres ou dans la position des maxima d'absorption
n'est remarqu. L'absorption de lumire par la chlorophylle se
retrouve des longueurs d'onde de 430 et 670 nm pour les complexes
CPI provenant de membranes acclimates ou non acclimates la
chaleur. La diminution de l'absorption de lumire par la chlorophylle
est explique premirement par la dgradation de la chlorophylle lors
du stress thermique et deuximement par l'inhibition de la synthse
61
cpr
CPII
fP
FIGURE 15 Isolation des complexes pigment-protin sur gel non

dnaturant, la bande (a) reprsenbe les complexes isols de plants
d'orge non acclimats la chaleur et la bande (b) les complexes isols
de plants acclimats 40C.
62
Cpll
migration - - - -->
FIGURE 16 Analyse par densitomtrie des complexes pigmentprotine provenant, (a) de plants non acclimats la chaleur (b) de
plants acclimats 40C.
63
1'.1
:
l
:
bA= 0.030
,
\
:~
-'
\,
'
1l
'
,
1,
,
\
\
"
....
470
" ...,-----_.. ---_.. ----"".'

i
540
.'.
\,
.----_/
,,'
l
"
,1
,
l
.............
'
1
1
400
'
1'
610
680
750
longueur d'onde (nm)
FIGURE 17 Spectre d'absorption du complexe pigment-protine

(CPI) isol de plants non acclimats la chaleur (trait continu) ou isol
de plants acclimats 40C (tiret).
64
des protines membranaires lors de l'lvation de temprature.

Puisqu'il n'y a plus de renouvellement des protines, nous observons
une absence de rgnration des complexes aprs leur dgradation. Le
spectre suivant (Figure 18) reprsente le complexe CPII* associ au
PSII; nous pouvons constater par ce spectre l'augmentation de la
forme agrge du PSII. Aucun changement dans la position des
maxima d'absorption n'a t observ. En particulier les maxima
d'absorption de la Chl-a se retrouvent 430 et 670 nm tandis que les
maxima pour la Chl-b sont nots 465 et 655 nm, chez les deux types
d'extraits membranaires. Le complexe CPII (ainsi que les pigments
libres) comme le CPI a lui aussi subi, par l'effet du stress thermique,
une diminution d'absorption de lumire par les Chl a et b. (Figure 19 et
20). Chez le complexe CPII, comme pour tous les autres complexes,
aucune variation dans les maxima d 'absorption de la chlorophylle n'a
t constate. Les Chl-a des deux extraits membranaires se retrouvent
des longueurs d'onde de 430 et 670 nm et de 465 et 655 nm pour la
Chl-b.
Ces dgradations apportes par le stress thermique
influencent-elles l'activit photosynthtique? Ces variations des
complexes pigment-protine dans la plante entire sont-elles aussi
nfastes sur la fonction du thylacode que portent croire les tudes
ralises sur la membrane isole?
Avant d'tudier l'effet du stress thermique sur la fonction
photosynthtique du thylacode, nous allons d'abord analyser sa
composition polypeptidique plus en dtail. Des variations dans la
constitution
en
protines
peuvent
influencer
l'activit
photosynthtique.
6S
'.,
\
\,
,
,,
,
\
",
,,
,
,,
,
""
\\
\" . . . .
"
"-
#"" "
.. --',
"
400
470
,,-'
,
540
,,: \,,'
,,
a
"
" . # ,
' ....
_..
,..-_
#~
610
680
750

(CPII*) isol de plants non acclimats la chaleur (trait continu) ou
isol de plants acclimats 40C (tiret).
66
\
\
\
,
\
,
\
\,
,,
,,
,
'\
./
l
400
,, '\ ,
: '
---
,' ......
~---""'-_----_ .. __ .-
470
540
1
1
.'
610
680
750

(CPII) isol de plants non acclimats la chaleur (trait continu) ou
isol de plants acclimats 40C (tiret).
67
dA=M"
,t,\,
i \
,.,
,
,
,, ,
400
470
540
610
680
750
longueur d'ende (n.)
FIGURE 20 Spectre d'absorption des pigments libres (FP) obtenus de

plants non acclimats la chaleur (trait continu) ou de plants
acclimats 40C (tiret).
68
PARTIE II
Nous savons qu'une des rponses apportes par la plante lors

d'une lvation de temprature est de changer sa composition en
protines. Plusieurs tudes ont dmontr une diminution de certains
polypeptides lors d'un stress thermique. D'autres tudes indiquent par
contre qu'une srie de protines est synthtise lors du stress. Ce sont
les protines de choc thermique. Certaines de ces protines sont
nouvellement synthtises et d'autres sont simplement synthtises de
faon plus abondante. En fait, la prsence des protines du choc
thermique a t signale depuis longtemps. Par contre, la localisation
de ces protines n'est pas encore arrte, puisque certains groupes de
chercheurs indiquent que les HSP se retrouvent accroches la
membrane thylacodienne tandis que certains autres les qualifient
comme tant des protines solubles retrouves dans le stroma du
chloroplaste (Kloppstech et al., 1985; Chen et al., 1990). Le premier
objectif de cette partie est de vrifier la prsence d'une ou plusieurs
HSP au niveau de la membrane thylacodienne. Nous nous intressons
particulirement cette membrane et ses modifications possibles
lors du stress, puisque premirement, elle est le centre vital de l'espce
vgtale et deuximement, que les travaux effectus antrieurement
ainsi que ceux raliss dans ce prsent travail sont rattachs
directement l'activit photosynthtique.
5.2 Prsence des HSP au niveau de la membrane

photosynthtigue
Plusieurs
extraits
de
membranes
thylacodiennes
ont t prpars et par la suite analyss par des techniques
69
lectrophortiques. Nous retrouvons deux types de membranes, soit

les thylacodes tmoins qui ont t isols d'orge croissant 23C et les
thylacodes isols de plants d'orge acclimats un choc thermique de
40C pour une priode de trois heures. Nos premiers rsultats
d'lectrophorse semblent indiquer l'inexistence de changement dans
la composition en polypeptides des membranes thylacodiennes avant
ou aprs un stress thermique. Si nous observons l'lectrophorse suite
une coloration au bleu de coomasie, nous ne pouvons remarquer
aucune perte ou gain de protines lors d'une lvation de temprature
(Figure 21). Une tude plus complte de ce gel a t effectue par une
analyse en densitomtrie qui dmontre cependant de lgres
variations dans la composition de la membrane (Figure 22). Ces
variations quantitatives des protines sont reprsentes dans le
tableau suivant (Tableau 2). Nous constatons une diminution
d'environ 10% de chaque protine membranaire isole de plants
acclimats. Cependant les protines associes au PSII semblent peu
affectes par le stress thermique, puisqu'aucune diminution n'est
apporte pour les protines du centre ractionnel ainsi que pour les
protines du complexe de dgagement d'oxygne (33, 22 et 17 kDa).
Des tudes ont dmontr qu'il y a 60% des protines de la membrane
qui sont limines par un stress thermique 42C aprs 3 jours, pour
seulement 40% chez les feuilles exposes 22C. Cette baisse de 40%
est l'limination normale en protines suscite par la snescence des
feuilles (Ferguson et al., 1993). Par contre un stress thermique appliqu
pendant seulement 3 h n'apporte qu'une faible diminution des
protines membranaires (5%), suite nos analyses du densitogramme.
Est-ce que cette baisse dans la composition de la membrane influence
l'activit photosynthtique? C'est ce que nous allons valuer
dans les exprimentations suivantes. Par contre, ce qui nous
intresse n'est pas l'limination des protines membranaires
70
b
-92.5kOa
-66.0
-31.0
-21.5
-14.3
FIGU E 21
Composition polypeptidique de la membrane
thylacodienne isole (a) de plants d'orge non acclimats la chaleur
(temoin 23C) (il) de plants d'orges acclimats 40C pendant 3h.
Chaque puit contient 20llg de ChI d'extrait membranaire. Utilisation
de la technique de coloration au bleu de coomasie.
71
migration - - - -->
FIGURE 22
Analyse par densitomtrie de la composition
polypeptidique de la membrane thylacodienne isole (a) de plants
d'orge non acclimats la chaleur (temoin 23C) (b) de plants
d'orges acclimats 40C pendant 3h.
72
TABLEAU 2
Analyse quantitative des protines membranaires
suite au densitogramme, pour les membranes isoles de plants d'orge
acclimats ou non acclimats la chaleur. Le pourcentage de
dissociation reprsente la quantit de protine limine des
membranes isoles des plants acclimates en comparaison avec des
plants non acclimates. L'erreur relative sur les mesures est de 3%.
PROTINES
ASSOCIE
AU
P.M.
(kDa)
POURCENTAGE
DE
DISSOCIATION
PSll
34
PSTI
32
PSTI
23
PSTI
17
73
durant le stress, mais celles qui sont synthtises et qui sont

susceptibles d'tre accroches la membrane pour apporter celle-ci
une adaptation possible.
Cependant les rsultats contradictoires des tudes de Santarius
(1979) dmontrrent l'inexistence de modification dans la composition
polypeptidique des membranes thylacodiennes, soit aucune perte ou
gain en protines. Par contre, ces observations donnrent lieu une
conclusion un peu trop htive en excluant les protines synthtises
lors d'un choc thermique comme responsables de l'acquisition de
l'acclimatation ou de la rsistance des plantes la chaleur (Santarius
1979). Des analyses plus prcises ainsi que des techniques de rvlation
ou de coloration des polypeptides plus efficaces doivent tre
entreprises pour l'identification de protines nouvellement
synthtises (HSP).
Des techniques de coloration plus prcises, telle que la coloration
au nitrate d'argent, ont permis de suspecter la prsence possible d'une
protine d'environ 21 kDa, comme tant une protine de choc
thermique (Figure 23). Cette protine semble fixe sur la membrane
malgr les nombreux lavages de cette dernire. Par cette technique de
coloration nous pouvons aussi apercevoir certaines pertes ou baisses
dans la synthse de protines telles que les protines de 92 et 66 kDa.
Pour plus de certitude face l'intgration de la protine de 21 kDa
la membrane thylacodienne (suite l'lectrophorse par coloration
au nitrate d'argent), une incorporation d'acides amins radioactifs a
t utilise pour permettre l'identification des protines membranaires
qui seront synthtises lors du stress thermique et qui sont retrouves
au niveau de la membrane photosynthtique (voir Matriel et
Mthodes 4.1.3). L'usage de mthionine-S35 a permis d'identifier, par
empreinte photographique des protines marques par la
radioactivit (autoradiogramme), la prsence de la protine 'd'environ
de 21 kDa accole au thylacode (Figure 24). Nous pouvons identifier
74
- 92.5kDa
-66.0
-45.0
-31.0
-21.5
FIGURE 23
thylacodienne isole (a) de plants d'orge non acclimats la chaleur
(temoin 23C) (b) de plants d'orges acclimats 40C pendant 3h.
Chaque puit contient 20~g de Chl d'extrait membranaire. Utilisation
de la technique de coloration au nitrate d'argent.
75
-92.5 kDa
-66.0
-45.0
-31.0
-21.5
-14.3
FIGURE 24 Autoradiogramme par marquage au 35S-methionine des

protines synthtises lors (c) d'une acclimatation des plants 40C
pendant 3 h. (d) d'une incubation des pla.nts 23C (comme tmoin).
La colonne (a) reprsente la partie soluble lors de l'extraction de la
membrane des plants non acclimats la chaleur, (b) la partie soluble
de l'extraction de la membrane des plants acclimats 40C.
76
grce ce gel, la diminution ou l'absence de synthse de certaines
protines normalement retrouves au niveau de la membrane telles
que les protines de 55 et 58 kDa. De plus, nous pouvons constater,
par l'analyse du densitogramme (Figure 25), l'augmentation de 71%
dans la synthse d'une autre protine, un polypeptide d'environ 70
kDa. La prsence de cette protine dans l'extrait membranaire est
beaucoup moins vidente que celle de 21 kDa, si nous considrons
seulement le rsultat de l'autoradiogramme. Par contre l'analyse du
densitogramme ne rvle que 62% d'augmentation de la synthse de la
protine de 21 kDa. La prsence de ce HSP70 au niveau du
chloroplaste t confirme par plusieurs auteurs (Marshall et
Keegstra, 1992; Yalovsky et al., 1992). Selon leurs tudes, nous
prenons conscience du rle possible de la protine de 70 kDa. Cette
dernire est une protine "chaperon" ncessaire entre autre
l'intgration de l'une des protines au niveau du LHC du PSII. Dans
plusieurs recherches effectues in vivo, la HSP70 se retrouve soluble
dans le stroma du chloroplaste (Key et al., 1981; Marshall et al., 1990;
Marshall et Keegstra, 1992). Il est connu qu'une protine chaperon,
une fois son travail accompli est dissocie des complexes protiques
par l'action d'une enzyme. Par nos conditions exprimentales, nous
avons isol la membrane thylacodienne de son milieu en empchant
possiblement ainsi l'action de dissociation de l'enzyme sur le HSP70;
cela explique donc sa prsence inattendue sur le thylacode. L'analyse
de l'autoradiogramme nous dvoile donc la prsence de deux
protines au niveau de la membrane, l'une tant plus abondante que
l'autre. Cette intgration, des protines de 21 kDa et 70 kDa, sur la
membrane, est dmontre puisqu'une srie de lavages et de
centrifugations a t effectue dans l'intention de confirmer leur
assimilation. Cependant la possibilit que ces protines se prsentent
sous formes d'agrgats non solubles de mme densit que les
membranes thylacodiennes est envisage.
A la suite de ces rsultats, nous conviendrons d'effectuer toutes
nos expriences dans ces mmes conditions, c'est dire un stress de
77
"
l',
J ,
~J
/<
'
"
(\ hSP70
, '
'
;; hSP21
1
'\;:\
.,
,, 1,
\F'\
\
migration - - - - - >
FIGURE 25 Analyse par densitomtrie de l'autoradiogramme. (a)

reprsente la membrane extraite de plants d'orge acclimats la
chaleur, (b) reprsente la membrane extrait de plants d'orge non
acclimats (temoin 23C).
78
40C pour une priode de trois heures. Ces conditions permettent la

synthse des protines de 70 et 21 kDa, et de plus il est vident qu'elles
sont suffisantes pour observer ces protines accoles la membrane.
Ce rsultat serait de plus en corrlation avec ceux obtenus par
Glaczinski et Kloppstech (1988) qui identifient la protine de 21 kDa
accroche au thylacode. En contrepartie, cette observation vient
contredire les tudes de Vierling (1989) qui indiquent la prsence de
cette protine dans la partie soluble du chloroplaste. TI est vident que
la HSP21 serait alors une protine extrinsque, son attachement la
membrane de faon superficielle permet d 'expliquer la difficult
l'obtenir encore rattache celle-ci lors d'une extraction.
Les conditions utilises nous permettent d'observer la prsence
vidente des protines HSP21 et HSP70 de choc thermique au niveau
de la membrane thylacodienne. Est-ce que la prsence de ces protines
entrane une modification quelconque de l'activit photosynthtique?
Nous verrons si la fonction de la membrane photosynthtique est
perturbe lorsque les plants d'orge ont support une augmentation de
temprature allant jusqu' 40C. Certaines tudes mentionnes au
chapitre 3 et bases sur l'tude de la fixation du C2 chez les plantes
entires indiquent une intgrit de l'activit photosynthtique, malgr
un stress thermique. Dans le prsent travail, nous voulons confirmer
que la membrane thylacodienne conserve son activit une fois isole
de son milieu et une fois le stress thermique appliqu sur les plants
d'orge.
5.3 Adaptation du PSU au stress thermiqt
Plusieurs recherches ont t effectues sur l'tude du

comportement de la membrane thylacodienne isole et entre autres
du PSU, face une situation de stress thermique (Santarius, 1973;
Bauer et al., 1975; Berry et Bjorkman, 1980; Mohanty, 1987; Bilger et
79
Schreiber, 1990). De telles tudes arrivent la conclusion que dans

certains cas, un choc thermique provoque une inactivation du
transport d'lectrons. Ainsi, il n'y a aucune possibilit d'adaptation de
la membrane isole face une augmentation de la temprature.
D'autres tudes encore indiquent qu'un stress thermique mme sur la
plante entire provoque aussi une diminution de l'activit
photosynthtique suite la trs grande sensibilit du PSU sous l'effet
de la chaleur. Par contre, certaines recherches ont indiqu que la
prsence de lumire lors du stress thermique donnerait la membrane
une certaine rsistance la chaleur (Havaux,1992). Les rsultats de la
section prcdente indiquent que des modifications de la constitution
polypeptidique de la membrane sont possibles suite la synthse de
certaines protines appeles protines du choc thermique ou HSP. La
synthse de ces protines lors d'une lvation de temprature pourrait
constituer l'origine de l'adaptation de l'appareil photosynthtique.
La mthode de travail adopte ici est d'tudier la membrane
thylacodienne isole de chloroplastes ou de plantes entires ayant
subi un stress thermique 40C pendant 3 h. L'analyse de la condition
de l'appareil photosynthtique se fait aprs le stress (suite
l'incubation de nos plants ou de nos chloroplastes temprature
leve) et aprs l'extraction membranaire et non pendant le stress
comme dans les tudes effectues par plusieurs chercheurs. Cette
approche permet de vrifier si le stress thermique apporte des
modifications au niveau de la membrane elle-mme et si ces
modifications sont conserves aprs l'avoir extraite de son milieu. Si
des moyens d'adaptation ont t raliss, il est probable que l'activit
photosynthtique ne soit pas perturbe. L'effet de la temprature sera
tudi par rapport l'activit photosynthtique manifeste par le
dgagement d'oxygne au niveau du PSU.
i) Premirement, des extractions membranaires provenant de
plantes tmoins 23C ainsi que de plantes ayant subi le stress
thermique de trois heures 40C, ont t ralises. On a par la suite
80
valu, en terme d'activit photosynthtique, les deux types de

membranes (Tableau 3). Les mesures de dgagement d'oxygne sont
effectues sur quatre extractions diffrentes et de pousses d'orge
varies ce qui explique certaines variations d'activit.
Le stress thermique ne semble pas affecter l'activit
photosynthtique. Soit que la membrane thylacodienne n'a pas t
perturbe par la chaleur ou bien celle-ci c'est tout simplement adapte.
L'activit photosynthtique moyenne recueillie chez les thylacodes
provenant de plants d'orge non acclimats 40C (donc n'ayant pas
subi de stress thermique) est de 175 ~mol 02/mg ChI.h, 171 ~mol
02/mg ChI.h sont dgages par les membranes extraites de plants
d'orge acclimats 40C. Il est ainsi observ que la membrane
photosynthtique est capable de poursuivre une activit considrable
malgr un stress thermique. Cette rsistance au choc thermique est
probablement due une modification ou adaptation de sa structure,
mais de quel type d'altration? La prsence de la protine de 21 kDa
(et celle de 70 kDa) constitue la modification majeure apporte la
membrane. Il a t mentionn dans un chapitre antrieur que
l'implication de la lumire, lors d'un choc thermique, serait le facteur
qui entranerait la protection au PSII. Nos conditions de stress
thermique s'effectuent en prsence de lumire, ce qui pourrait
confirmer la stabilit de ce photosystme. De plus, selon les travaux de
Havaux (1992) discuts au chapitre 3, un stress hydrique lors d'un choc
thermique serait aussi l'origine d'une protection du psu. Ce
nouveau stress entrane une protection par des modifications
apportes la structure lipidique. Comme dans ce travail, nous ne
sommes pas intresss par la partie lipidique du problme, nos
conditions de stress thermique ont t ralises en prsence de
plusieurs priodes d'arrosage. La rsistance observe par le PSU suite
un stress thermique est-elle due simplement la prsence de la
lumire?
81
TABLEAU 3
Activit photosynthtique des membranes
thylacodiennes extraites de plants d'orges non acclimats (tmoin
23C) et de plants d'orge acclimats 40C pendant 3 h. Srie de 3
mesures effectues sur 4 extractions diffrentes.
ACTIVIT PHOTOSYNTHTIQUE
Ilmoi 02 / mg ChI. h
MEMBRANES
NON ACCLIMATES
MEMBRANES
ACCLIMATES
Extrait 1
172 10
186 10
Extrait 2
179 15
172 10
Extrait 3
186 10
174 10
Extrait 4
164 5
153 10
MOYENNE:
175 15
171 10
82
Une modification dans les conditions exprimentales lors de

l'administration du stress thermique a t apporte par le retrait de la
lumire. L'activit du PSII des membranes extraites de plants
acclimats ou non en absence de lumire ne semble pas tre modifie
par rapport l'activit des membranes obtenues sous des conditions
d'illumination lors du stress thermique (Tableau 4). Ainsi, la protection
du PSII apporte seulement en prsence de lumire dans les travaux
de Havaux en 1992 n'est pas observe dans nos exprimentations. La
lumire n'est pas requise pour l'adaptation aux effets de la chaleur.
Une certaine tolrance de la membrane face la chaleur et en
l'absence de lumire a t observe par d'autres chercheurs (Schuster
et al., 1988). Ils affirmrent que le dgagement d'oxygne n'est pas
inhib de faon significative dans les cellules (Chlamydomonas)
exposes 42C pour 3 h en l'absence de lumire. Cette tude ainsi que
nos observations cartent la possibilit que seule la prsence de
lumire peut entraner une conservation indniable de l'activit
photosynthtique.
La protection de ce photosystme est donc indpendante des
conditions lumineuses et serait par contre dpendante d'une autre
modification apporte par la chaleur.
ii) Est-ce que cette modification est apporte par la plante entire
ou si le fait de traiter la chaleur des chloroplastes isols permet aussi
la membrane d'acqurir cette rsistance? Les analyses suivantes ont
t ralises sur des membranes thylacodiennes extraites de
chloroplastes non acclimats ou acclimats la chaleur par une
exposition 40C pendant 3 h. Premirement il est indispensable
d'analyser notre mthode d'extraction des chloroplastes partir des
plants d'orge. Ainsi une vrification de l'intgrit de ces organites est
ncessaire. Par des mesures en dgagement d'oxygne, il est possible
de vrifier l'tat de nos chloroplastes extraits (voir Matriel et
Mthode 4.4.3) (Tableau 5).
83

thylacodiennes extraites de plants d'orge tmoin 23C, et de plants
d'orge acclimats 40C pendant 3 h. en l'absence de lumire. Srie de
3 mesures effectues sur deux extractions diffrentes.
TABLEAU
MEMBRANES
NON ACCLIMATES
MEMBRANES
ACCLIMATES
Extrait 1
179 10
172 10
Extrait 2
164 10
157 10
MOYENNE:
172 10
165 10
84
Pourcentage de chloroplastes intacts dans l'extrait

calcul par une comparaison des activits photosynthtiques de
chloroplastes (CHL) avant et aprs clatement par choc osmotique.
L'accepteur d'lectrons utilis dans ces mesures est le ferricyanure de
potassium (50 mM). Les mesures sont effectues suite quatre
extractions de chloroplastes. L'erreur sur les pourcentages de
chloroplastes intacts est au maximum de 10 %.
TABLEAU 5
/lmoi 02/ mg ChI. h
AVANT
CLATEMENT
POURCENTAGE DE
CHL.INTAcrs (%)
APRS
CLATEMENT
Extrait 1
47
115
59
Extrait 2
34
100
66
Extrait 3
41
125
67
Extrait 4
30
100
70
85
L'utilisation de chloroplastes intacts 70% d 'intgrit semble tre

convenable selon la littrature (Walker et al., 1987). Une fois que les
chloroplastes ont t extraits des plants d'orge, une portion de cet
extrait est place 23C en prsence de lumire comme tmoin et un
second chantillon est incub 40C aussi sous illumination pour trois
heures. De ces chloroplastes, une extraction de la membrane
thylacodienne est effectue. Avant de constater les consquences du
choc thermique sur l'activit photosynthtique de la membrane, un
examen, par mthode lectrophortique, de la composition
polypeptidique de la membrane isole partir de chloroplastes et de la
membrane isole de plants d'orge est ncessaire. Deux mthodes
d'extraction des thylacodes partir de chloroplastes ont t
employes, soit en utilisant la mme mthode et les mmes tampons
que lors d'une extraction partir des plantes intactes (Goetze et
Carpentier, 1990) ou par la mthode de Walker (Walker et al., 1987)
(voir Matriel et Mthodes 4.2.2). Les rsultats de l'lectrophorse
nous montrent bien que par la mthode de Walker (colonne c), les
membranes thylacodiennes sont susceptibles d'tre compares aux
thylacodes isols de plantes intactes (colonne a) (Figure 26). La
composition en protines de la membrane thylacodienne extraite par
l'autre mthode (colonne b), nous montre l'absence de certaines
protines (telle que la 31 kDa) et la prsence plus marque de certaines
autres (Figures 27 et 28). L'analyse des densitogrammes nous confirme
le tout en dmontrant une similitude entre la composition protique
des thylacodes extraits des chloroplastes par la mthode de Walker et
ceux extraits de plants d'orge.
Suite ces vrifications, l'activit des membranes thylacodiennes
provenant de chloroplastes tmoins et de chloroplastes traits au
stress thermique, a t value (Tableau 6).
L'activit photosynthtique moyenne retrouve par les
membranes isoles de chloroplastes (soit 117 ~mol 02/mg .Chl.h) est
infrieure l'activit des membranes provenant de plantes intactes
86
-92.5kDa
-66.0
-45.0
- -31.0
111_ _ _
-21.5
-14.3
FIGURlE 26
thylacodienne extraite (a) de plants d'orge, (b) de chloroplastes par la
mme mthode de que l'extraction des thylacodes partir de plants
d'orge (c) de chloroplastes par la mthode de Walker. Chaque puit
contient 20~g de ChI. d'extrait membranaire.
~\
migration - - - -->
FIGURE 27 Densitogrammes comparant deux mthodes d'extraction

de la membrane thylacodienne. (a) membranes extraites de plants
d'orge, (b) membranes extraites partir de chloroplastes selon la
mthode d'extraction partir de plants.
88
migration - - - - - >
FIGURE 28
Densitogrammes comparant deux mthodes
d'extraction de la membrane thylacodienne. (a) membranes extraites
de plants d'orge, (b) membranes extraites partir de chloroplaste
selon la mthode de Walker.
89
TABLEAU 6
thylacodiennes extraites de chloroplastes tmoins 23C et de
chloroplastes ayant support un stress thermique 40C pendant 3 h.
Srie de 3 mesures effectues sur trois extractions diffrentes.
MEMBRANES
NON ACCLIMATES
MEMBRANES
ACCLIMATES
Extrait 1
117 10
72 10
Extrait 2
114 5
93 5
Extrait 3
120 5
67 5
MOYENNE:
117 10
77 10
90
(175 Ilmol Dl/ mg ChI h). Cette baisse dans l'activit est probablement
due des manipulations supplmentaires apportes par l'extraction
des chloroplastes suivie de l'extraction des thylacodes. Si nous
comparons l'activit des deux types de thylacodes, nous constatons
qu'elle est diffrente, du fait que l'activit moyenne des membranes
isoles de chloroplastes traits 40C est de 77 Ilmol 02/mg Chl.h est
ainsi plus faible que l'activit des tmoins 117 Ilmol Dl/mg Chl.h. Des
tudes ralises en 1977 par Ageeva, indiquent que la prsence de la
lumire lors du stress thermique sur les chloroplastes est nuisible
l'activit du PSU (Ageeva, 1977). Puisque les conditions de ce stress
thermique sont effectues sous illumination, il est comprhensible
d'obtenir une baisse de l'activit photosynthtique de la membrane
chez les chloroplastes traits la chaleur. Une hypothse serait que la
lumire utilise lors du stress thermique sur les chloroplastes entrane
une photoinhibition ou une dgradation de certains complexes
pigment-protine qui entranerait une inhibition de l'activit
photosynthtique. L'utilisation de la lumire sur la plante entire
serait alors moins nfaste que sur le chloroplaste isol. D'autre tudes,
effectues par Maison, dmontrrent aussi une baisse de l'activit du
PSU (baisse du dgagement d'oxygne) lors d'une exposition des
chloroplastes la chaleur mais cette fois en l'absence de lumire.
(Maison, 1977). Ainsi l'utilisation de la lumire, sur les chloroplastes,
dans nos conditions exprimentales n'est pas nuisible l'activit
photosynthtique des membranes.
La rsistance apporte chez les thylacodes isols de plantes
entires est donc une modification apporte par la cellule. Le
chloroplaste seul ne peut y accder. L'hypothse formule suite ces
observations donnerait la prsence des protines de choc thermique
de 21kDa ainsi que 70 kDa (tous deux d'origine nuclaire) accoles
la membrane un rle principal dans la rsistance du PSII face au stress
thermique.
91
L'analyse de la composition polypeptidique de la membrane

thylacodienne isole de chloroplastes acclimats ou non acclimats,
ne dmontre pas de modifications apparentes. (Figures 29 et 30). Par
contre une analyse du densitogramme rvle que certaines
modifications polypeptidiques seraient probablement l'origine de la
diminution de l'activit photosynthtique observe prcdemment
(Tableau 7). La membrane thylacodienne isole de chloroplastes
acclimats 40C subit une diminution polypeptidique de 5 15%
selon les protines. Par contre on observe une diminution drastique de
53% pour la protine de 33 kDa, ainsi qu'une baisse de 30% pour la
protines de 17 kDa. Ces polypeptides constituent le complexe de
dgagement d'oxygne. Ainsi l'absence ou la dissociation de ces
protines extrinsques inhibe la fonction du PSII en empchant la
photolyse de l'eau de se raliser. Des tudes sur la membrane isole
indiquent que ce complexe est susceptible l'effet de la chaleur (Sabat
et Mohanty, 1989). Par consquent et contrairement ce dont nous
avons observ chez la membrane isole de plants d'orge, le complexe
n'est pas protg sous l'effet de la chaleur.
Suite nos observations prcdentes sur la prsence de protines
de stress thermique au niveau de thylacodes isols de plants d'orge
(Figure 24), nous pouvons suggrer que ces HSP soient l'origine de la
conservation ou de l'intgrit des protines extrinsques du centre
ractionnel.
Ces polypeptides (HSP), d'origine nuclaire, sont
possiblement transports l'intrieur du chloroplaste pour intragir
au niveau du complexe de dgagement d'oxygne. Puisque la synthse
des HSP est impossible lors de l'acclimatation des chloroplastes nous
pouvons affirmer que c'est leur prsence qui permet l'intgrit du
complexe et par le fait mme la conservation de l'activit
photosynthtique dans la plante.
Par contre l'activit photosynthtique de 77 J1mol 02 / mg ChI.h,
que nous pouvons quand mme retrouver dans l'extrait membranaire
de chloroplastes acclimats est due aux complexes de dgagement
92
b
-92.5
-66.0
-45.0
,-_.
-31.0
-21.5
-14.3
FIGURE 29
thylacodienne isole (a) de chloroplastes non acclimats (b) de
chloroplastes acclimats 40C pour 3 h. Chaque puit contient 20 ~.g
d e ChI d'extrait membranaire.
93
33kDa
b
migration - - - -->
FIGURE 30
Densitogrammes reprsentant la composition
polypeptidique de la membrane thylacodienne isole (a) de
chloroplastes non acclimats (tmoin 23C) (b) de chloroplastes
acclimats 40C pendant 3 h. Chaque puit contient 20 J-lg de ChI
d'extrait membranaire.
94
TABLEAU 7 Analyse quantitative des protines membranaires suite

au densitogramme, pour les membranes isoles de chloroplastes
acclimats ou non acclimats la chaleur. Le pourcentage de
dissociation reprsente la quantit de protine limine des
membranes isoles des chloroplastes acclimats en comparaison avec
des chloroplastes non acclimats. L'erreur relative sur les mesures est
de4%.
PROTINES
ASSOQE
AU
P.M.
(kDa)
POURCENTAGE
DE
DISSOCIATION
PSU
34
Il
PSU
32
53
PSU
23
PSU
17
30
95
d'oxygne non encore affects au cours du traitement et peut-tre

aussi la prsence des deux autres protines extrinsques (soit 22 et 17
kDa) qui peuvent probablement maintenir une faible activit de
dgagement d'oxygne malgr l'absence du polypeptide de 33 kDa.
5.4 ThermQtolrance:
La thermotolrance a t observe chez plusieurs espces

vgtales, elle se caractrise par le fait que les organismes qui ont
pralablement subi une acclimatation la chaleur deviennent par
consquent tolrants une temprature habituellement ltale ou
simplement tout autre temprature leve (Pearcy et al. 1977).
Les membranes que nous avons jusqu' maintenant tudies sont
soit rsistantes l'effet d'un stress thermique (celles isoles de
plants d'orge) ou susceptibles cette augmentation de temprature
(celles isoles de chloroplastes). Mais comment celles-ci vont ragir
un second stress thermique?
Suite leur extraction, les membranes sont incubes dans un bain
d'eau thermostate 30C dans le but de vrifier leur stabilit en
terme d'activit photosynthtique en fonction du temps d'incubation.
L'tude de l'acclimatation de notre matriel biologique s'est effectue
non pas une temprature habituellement ltale, mais une
temprature quand mme assez leve ( 30C ) pour observer
l'influence de celle-ci sur l'activit photosynthtique.
Selon plusieurs auteurs, le stress thermique induit une
dcroissance du transport d'lectrons, (suite une dnaturation des
protines, une variation de la fluidit de la membrane etc ... )
(Santarius, 1973, 1975; Al-Khatib, 1990). Nos rsultats sur l'influence
du temps d'incubation 30C de nos thylacodes non acclimats la
96
chaleur dmontrent qu'il y a effectivement dcroissance de l'activit

photosynthtique (Figure 31). Nous constatons ainsi une inhibition du
dgagement d'oxygne en fonction du temps d'incubation des
thylacodes 30C. Il est important, par contre, de remarquer que les
membranes provenant de plants acclimats semblent plutt supporter
cette chaleur impose plus facilement que le tmoin. Aprs cinq heures
d'incubation 30C, on constate seulement prs de 40% d'inhibition
pour les membranes isoles d'orge acclimate 40C par contre 80%
d'inhibition est remarque pour les membranes provenant de plants
d'orge non acclimats ( 23C). La conclusion est donc invitable, il y a
une certaine adaptation ou rsistance de l'appareil photosynthtique
provenant de plantules d'orge qui ont subi pralablement un stress
thermique de trois heures 40C. Nous pouvons ici parler
d'adaptation de la membrane puisque les rsultats sont concluants en
indiquant une rsistance deux fois plus grande pour les membranes
acclimates 40C.
Nous avons vrifi la capacit de cette adaptation de l'appareil
photosynthtique des tempratures suprieures 30C. Les
membranes (soit tmoins et acclimates) sont alors incubes dans un
bain d'eau thermostate 40C (Figure 32). Un stress thermique aussi
fort affecte autant les membranes tmoins que celles dj acclimates
la chaleur. Sous cette temprature leve, les thylacodes sont
surement dstabilises par des modifications au niveau lipidique.
L'adaptation acquise ne semble pas tre suffisante pour empcher
l'inhibition de l'activit photosynthtique.
Une autre analyse fut d'observer le comportement des membranes
thylacodiennes provenant de plantes acclimates ou non acclimates
mais cette fois, en l'absence de lumire. L'attitude de ces thylacodes
vis--vis une incubation 30C est semblable au comportement des
membranes en prsence de lumire (voir figure 31). Ainsi la prsence
de lumire lors du stress thermique n'est pas un facteur influenant
l'adaptation de l'appareil photosynthtique. TI semblerait que les
~ 100
--ww
Z
0
Q
~
zw
:&
80
60
40
"(w
20
o ------~--~~--~~--~~--~~--~
o
TEMPS D'INCUBATION 30 oC (h)
FIGURE 31
Pourcentage de dgagement d'oxygne par la
membrane thylacodienne en fonction du temps d'incubation 30C.
( .) reprsente la membrane isole de plants d'orge acclimats 40C
pendant 3 h ( ) membrane isole de plants d'orge non acclimats.
L'erreur sur les mesures est au maximum de 5 %.
98
~ 100
---wz
w
80
60
w
:&
w
40
...z
"~
20
o ~----~----~------~----~----~----~
o
20
40
60
80
100
120
TEMPS D'INCUBATION 40C (min)
FIGURE 32
membrane thylacodienne en fonction du temps d'incubation 40C
( ) reprsente la membrane isole de plants d'orge acclimats 40C
pendant 3 h ( ) membrane isole de plants d'orge non acclimats.
L'erreur sur les mesures est au maximum de 3%.
99
membranes acclimates 40C en l'absence de lumire sont aussi bien

prpares pour affronter une incubation 30C (Figure 33).
Est-ce que l'adaptation que nous venons de constater sur nos
membranes acclimates partir de plants d'orge est prsente chez
celles isoles de chloroplastes acclimats? Les thylacodes isoles de
chloroplastes, soit tmoins ou ayant subi une acclimatation 40C,
sont alors soumis aux mmes tests de rsistance. L'adaptation des
membranes provenant de chloroplastes acclimats 40C semble
inexistante (Figure 34). Ainsi nous pouvons constater une inhibition de
l'activit photosynthtique des deux types de thylacodes en fonction
du temps d'incubation 30C. Aucune stabilit pour la membrane
acclimate dans le chloroplaste n'est observe contrairement
l'adaptation obtenue partir des plantes entires. Comment expliquer
qu'une membrane dans son milieu naturel (plante intacte) peut se
modifier ou apporter des changements dans sa composition
membranaire, tandis que l'isolation des chloroplastes ne permet pas
aux membranes d'accder ces modifications pour inciter une
tolrance la chaleur? Comme dj mentionn dans le chapitre 3,
l'implication des HSP lors du stress thermique pourrait tre la source
de l'acquisition de la thermotolrance chez la membrane
photosynthtique. La synthse des protines du choc thermique, telles
que HSP21 et HSP70 est d'origine nuclaire. Si l'adaptation la
chaleur est impossible pour la membrane acclimate au niveau du
chloroplaste isol, c'est que la synthse de protines du choc thermique
y est inexistante. Cette thermotolrance ou adaptation de la
membrane la chaleur, pourrait alors tre associe la prsence des
protines du choc thermique. Dans notre cas, la prsence des protines
de 21 kDa et 70 kDa fixes au niveau de la membrane thylacodienne
nous laisse croire en leur rle de protection. De plus les analyses des
densitogrammes (Figures 22 et 30) dmontrrent que le complexe de
dgagement d'oxygne de la membrane isole de chloroplastes est
perturb par la dissociation de 53 % de la protine de 32 kDa sous
l'effet de la chaleur. Par contre la prsence des protines de stress
100
-ffi
~1 00
o
80
CJ
>
><
o
Cl
....
z
w
:i
w
CJ
<C
CJ
60
40
20
234
TEMPS D'INCUBATION 30C (h)
FIGURE 33
( ) reprsente la membrane isole de plants d'orge acclimats 40C
pendant 3 h en absence de lumire ( ) membrane isole de plants
d'orge non acclimats. L'erreur sur les mesures est au maximum de
3%.
101
-z
100
o~
w
w
80
60
1Z
w
:E
40
"
c(
20
&:1
Q
o~----------~----~----~----~--~
FIGURE 34
( ) reprsente la membrane isole de chloroplastes acclimats 40C
pendant 3 h ( ) membrane isole de chloroplastes non acclimats.
102
thermique semble tre responsable de l'intgrit du complexe chez la

plante entire. Ainsi l'absence des HSP explique l'impossibilit de
l'appareil photosynthtique des chloroplastes supporter une
incubation 30C.
L'usage d'antibiotiques spcifiques permet d'inhiber la synthse
de protines soit d'origine chloroplastique comme par l'utilisation du
chloramphnicol ou de l'inhibition des protines nuclaire par l'action
du cycloheximide (ce dernier empchant la synthse des HSP).
L'orientation de notre tude sur l'utilisation d'antibiotiques nous
permet d'tudier l'implication possible des HSP lors de l'acquisition de
la thermotolrance de nos membranes thylacodiennes chez la plante
intacte.
5.4.1 Thermotolrance en prsence d'antibiotiques

spcifiques.
Par ces expriences nous voulons vrifier si la stabilit de

l'activit photosynthtique observe en 5.3 est aussi possible en
prsence d'antibiotiques. L'utilisation du chloramphnicol sera pour
permettre l'inhibition des protines provenant du gnome
chloroplastique (Lindholm et al., 1987; Greer et al., 1986). C'est un
inhibiteur spcifique qui, en se fixant la sous-unit 70s des ribosomes
chloroplastiques, bloque l'activit de l'enzyme peptidyl transfrase
(Vezquetz, 1974). Tandis que l'utilisation du cycloheximide sera pour
accder l'inhibition des protines nuclaires exclusivement. Cet
antibiotique apporte une inhibition de la translation au niveau de la
sous-unit 80s des ribosomes (Schuster et al., 1988).
Les plants d'orge sont traits en prsence d'antibiotiques
selon les mthodes dcrites en 4.1.3. Puisque le mthanol a servi de
solvant pour la mise en solution des deux types d'antibiotiques, il est
103
primordial de vrifier si celui-ci modifie la membrane thylacodienne

tant sur le plan structurel que fonctionnel.
Premirement, nous avons mis directement en contact le
mthanol et les membranes isoles (membranes tmoins et
acclimates) pour par la suite, vrifier l'effet de ce solvant sur
l'activit photosynthtique (Figure 35). Jusqu'en prsence de 20% de
mthanol, les membranes thylacodiennes ne semblent pas tre
affectes par le solvant. Par contre, pour des concentrations
suprieures nous observons une dcroissance proportionnelle la
quantit de mthanol utilise. Ceci est probablement da. une
modification sur le plan lipidique de la membrane. De plus, nous
notons que la membrane acclimate la chaleur est aussi susceptible
la prsence de mthanol que la membrane non acclimate. Ce qui
indique que la prsence des HSP au niveau de l'appareil
photosynthtique (qui semblent tre les resposables de l'adaptation
la chaleur) ne permet pas une rsistance de la membrane un stress au
mthanol puisque ce dernier comme effet de solubiliser les lipides
membranaires. Nous observons donc une dissociation complte de la
membrane.
Deuximement, nous mettons en contact le mthanol et les
plants d'orge coups la racine. Cette incubation des plants pour une
priode de 3 h nous permettra de constater si la prsence de mthanol
perturbe l'activit photosynthtique en solubilisant les lipides
membranaires. Ainsi, dix tiges seront dposes dans chacune des
prouvettes contenant des quantits diffrentes de solvant. Le solvant
pntre par capillarit dans les feuilles d'orge. Une extraction des
membranes thylacodiennes sera ensuite effectue sparment pour
chaque srie d'prouvettes (Tableau 8).
Il semblerait que des volumes absorbs par les plantes allant
jusqu' 500111 de solvant pour environ 10 feuilles d'orge n'altre pas
vraiment la capacit de dgagement d'oxygne compte tenu des carts
104
~100
o
w 80
9
c
60
z~
W 40
:E
"~w
20
o ~------~------~----~~----~~----~
o
10
20
30
40
50
POURCENTAGE DE METHANOL (%)
FIGURE
35
membrane thylacodienne en prsence de diffrents pourcentages en
mthanol ( ) reprsente la membrane isole de plants d'orge
acclimats 40C pendant 3 h ( ) membrane isole de plants d'orge
non acclimats. L'erreur sur les mesures est au maximum de 3%.
105
TABLEAU 8
thylacodiennes provenant de plants d'orge dposs dans des
quantits diffrentes de mthanol pour 3 heures. Tout le volume de
sol vant utilis a t absorb par les feuilles. Ces mesures ont t
effectues sur quatre extractions diffrentes.
VOLUME DE MTHANOL
UTILIS
<ILL)
ACTIVIT PHOTOSYNTHTlQUE
<J.tmol 02/ mg ChI. h)
179 5
100
172 5
250
164 la
500
157 la
106
dans les mesures d'activit. Une analyse par l'lectrophorse de la

membrane permet de constater par contre certaines variations dans la
composition en polypeptides; cependant, celles-ci n'impliquent pas des
polypeptides du complexe de dgagement d'oxygne et ne semblent
pas avoir affect l'activit photosynthtique (Figure 36).
Troisimement, le dernier test effectuer avec le mthanol
est de vrifier si l'acquisition de la thermotolrance de la membrane
photosynthtique face une incubation 30C (observe en 5.3) est
possible lorsque les plants sont acclimats en prsence de mthanol.
Une srie d'prouvettes, contenant chacune dix tiges d'orge
coupes et trempes dans 500 ul de mthanol, sont places dans une
chambre de croissance 40C, tandis qu'une autre srie dpose
23C servira de tmoin (Figure 37). La cintique du pourcentage de
dgagement d'oxygne obtenue en fonction du temps d'incubation des
membranes est similaire la figure 31. Ces deux graphiques
dmontrent une stabilit des membranes thylacodiennes acclimates
40C en fonction d'une incubation 30C. Aprs 4.5 h l'activit
restante de la membrane acclimat est de 77 3 % si nous comparons
la mme exprience mais en absence de mthanol l'activit retrouve
est de 74 5 %. Par ce test, nous pouvons conclure que la prsence de
mthanol n'a eu aucune influence sur le plan fonctionnel de la
membrane et que le mcanisme d'adaptation n'a pas t inhib par le
solvant. Nous pouvons donc passer l'analyse des antibiotiques qui
seront solubiliss dans ce 500 JII de mthanol pour dix tiges d'orge.
i) Influence du chloramphnicol
Dans un premier temps, nous allons considrer
l'influence de cet antibiotique sur l'activit de la membrane (Figure 38).
Les membranes sont mises en contact avec diffrentes concentrations
de chloramphnicol. Nous observons que l'activit photosynthtique
107
FIGURE 36
Densitogrammes reprsentant la composition
polypeptidique de la membrane isole de plants d'orge non acclimats
(a) incube en prsence de mthanol pendant 3 h (b) en absence de
mthanol.
108
120 ~--------------------------------------~
~100
---WZ
0
CJ
80
60
w
:i
w
CJ
<C
CJ
40
20
W
Q
o ~------~------~------~------~------~
o
FIGURE 37
1
234

membrane thylacodienne en fonction du temps d'incubation 30C.
( .) reprsente la membrane isole de plants d'orge acclimats 40C
3 h en prsence de mthanol ( 0 ) membrane isole de plants d'orge non
acclimats aussi en prsence de mthanol pendant 3 h. L'erreur sur les
mesure est au maximum de 2.5 %.
109
-100
-#.
w
w 80
Cl
60
w
:E
w
40
....
z
"
"
ct
w
20
o ~----~----~----~----~----~~--~
10
20
30
40
50
60
CONCENTRATION DE CHLORAMPHENICOL (mM)
FIGURE 38
Pourcentage de dgagement d 'oxygne par la
membrane EhotosY!lthtiq~e p~ovenant de plants d'orge non
acc1imatsen fonction de la concentration d'antibiotique. L'erreur sur

les mesures est au maximum de 5 %.
110
diminue avec la quantit croissante d'antibiotique. L'utilisation de 5

mM seulement nous sera suffisante pour inhiber la synthse des
protines d'origine chloroplastique (Vierling et Mishkind, 1986), et
cette concentration, nous constatons que la prsence de 5 mM
d'antibiotique n'entrane qu'une baisse de 8% de l'activit, ce qui est
peu considrable.
Des tudes effectues en 1991 par Okada et ses
collaborateurs affirmrent que la prsence de chloramphnicol sur des
feuilles de riz servait d'inhibiteur de la photosynthse (Okada et al.,
1991). Selon ces tudes des segments de feuilles de riz incubs dans un
tampon contenant 3 mM de chloramphnicol entrane une inhibition
de plus en plus accentue avec le temps. Aprs 3 h d'incubation,
l'activit photosynthtique de la membrane est inhibe de 50%. Il est
important de mentionner, que le retrait des feuilles de la solution
contenant l'antibiotique permet le recouvrement de l'activit
photosynthtique, puisque l'antibiotique n'affecte pas directement le
PSII. Le chloramphnicol intervient au niveau du cycle de Calvin
(comme accepteur d'lectrons) au site de rduction du C02. De ce fait,
il entre en comptition avec le C2 et est ainsi considr comme un
inhibiteur de la photosynthse. La concentration d'antibiotique utilise
dans nos exprimentations sera de 5 et 15 mM pour une priode
d'incubation de 3 h. Par contre puisque nos observations sont
effectues sur les membranes aprs le stress thermique et non pendant
ce stress, il n'y aura plus d'influence de la part de l'antibiotique (dO.
son absence dans notre extrait) sur l'activit de nos membranes.
Une vrification de l'activit des membranes isoles de
plants incubs en prsence ou en absence de chloramphnicol est
toutefois requise. Il est ainsi important de s'assurer que la prsence de
chloramphnicol lors du stress thermique n'a pas perturb nos
membranes thylacodiennes. Les tiges d'orge sont alors dposes dans
une solution mthanoloque contenant 5 mM de chloramphnicol (voir
111
matriel et mthode section 4.2.3) solubilis dans 500 ul de solvant.

D'autres ne sont incubes que dans le mthanol (Tableau 9). Suite
l'extraction des membranes de nos deux chantillons, l'activit
photosynthtique est obtenue par l'analyse du dgagement d'oxygne.
L'exprimentation a t effectue trois fois et nous dmontre chaque
fois l'uniformit dans la quantit de dgagement d'oxygne obtenue
entre les membranes isoles de plants en prsence ou en absence de
chloramphnicol. Ainsi il n'y a pas eu de perturbation au niveau de la
membrane photosynthtique par la prsence de l'antibiotique.
Maintenant il est indispensable de vrifier si la prsence
du chloramphnicol lors du stress thermique (40C) sur les plants
d'orge permet l'adaptation des membranes la chaleur. Une srie
d'chantillons (d'prouvettes) est place 40C et une autre 23C
(comme tmoin) tous deux en prsence de 5 mM de chloramphnicol
(Figure 39). Les rsultats dmontrent que l'acclimatation ou la
thermotolrance est irralisable pour la membrane en prsence de
chloramphnicol. Le pourcentage d'activit photosynthtique de la
membrane acclimate en prsence de chloramphnicol restant est de
25 % aprs 4.5 h d'incubation 30C. Si nous comparons avec
l'activit retrouv la figure 31 pour la membrane non acclimate
suite une incubation de 4.5h 30C, un lger 20 % d'activit est
possible. Cet antibiotique est l'origine d'une inhibition de la synthse
de protines synthtises par le gnome chloroplastique. Comme dj
mentionn la section 3.1.5, la synthse des protines de choc
thermique, est d'origine nuclaire. Ainsi sa synthse n'est pas
supprime en prsence de chloramphnicol. Certaines tudes ont
justement dtect la protine de 21 kDa prsente dans le stroma du
chloroplaste malgr la prsence de cet inhibiteur (Vierling, 1986). Il
semblerait donc que la protine HSP21 synthtise lors de l'exposition
la chaleur est toujours possible malgr la prsence du
chloramphnicol. Cependant, elle serait incapable de se fixer sur la
membrane thylacodienne. Cet empchement de la protine de
112
TABLEAU 9 Activit photosynthtique des membranes isoles de

plants d'orge incubs 3h dans le mthanol ou de plants d'orge incubs
dans une solution mthanoloque contenant 5 mM de chloramphnicol
pour une priode aussi de 3 h. Ces mesures ont t effectues sur trois
extractions diffrentes.
ACfIVIT PHOTOSYNTHTIQUE
IImoi 02 / mg ChI. h
EN PRSENCE DE
CHLORAMPHNICOL
EN ABSENCE DE
CHLORAMPHNICOL
Extrait 1
143 10
157 10
Extrait 2
164 5
172 10
Extrait 3
157 10
164 5
MOYENNE:
155 10
164 10
113
_100
0~
zw
80
CJ
60
9
Q
1-
Z
w 40
:i
w
CJ
cC
"
20
o
o
12345
Activit photosynthtique de la membrane aprs

diffrentes priodes d'incubation 30C. Les membranes
thylacodiennes sont isoles de plants d'orge non acclimats la
chaleur en prsence ( 0 ) ou absence ( 0 ) de chloramphnicol ou des
membranes isoles de plants d'orge acclimats 40C pendant 3 h en
prsence ( ) ou absence ( ) d'antibiotique. L'erreur sur les mesures
est au maximum de 4 %.
FIGURE 39
114
s'accrocher la membrane peut s'expliquer par l'inhibition de la

synthse d'une autre protine mais d'origine chloroplastique
essentielle l'intgration de la protine du choc thermique de 21 kDa
sur la membrane. L'intgration du HSP21 demanderait l'apport d'une
protine chaperon, telles que des HSP mais synthtises au niveau du
gnome chloroplastique. Ainsi, son absence au niveau du thylacode
observe par d'autres auteurs, nous permet de prtendre en son rle
essentiel l'acquisition de la thermotolrance.
Est-ce l'absence de la protine au niveau de la membrane
qui empche l'acquisition de la thermotolrance ou une perturbation
de la membrane due la prsence de l'antibiotique ? La prsence du
chloramphnicol ne semble pas perturber la membrane puisqu'il existe
une similitude dans les cintique d'inhibition de l'activit
photosynthtique des membranes non acclimates en l'absence de
chloramphnicol et celles en prsence de l'antibiotique. Ainsi la
prsence de chloramphnicol ne perturbe pas la membrane et la
susceptibilit de celle-ci est en relation avec l'absence de la protine.
L'incubation de plants dans 15 mM de chloramphnicol pour une
priode de 3 h permet de tmoigner une fois de plus du fait que
l'antibiotique n'affecte pas la membrane (Figure 40). La cintique
d'inhibition de l'activit photosynthtique en fonction du temps
d'incubation de l'orge en prsence de 5 mM ou 15 mM d'antibiotique
est identique. Si nous comparons les rsultats obtenus la figure 39
(5 mM d'antibiotique) l'activit restante suite 6h d'incubation est de
20% soit indentique l'activit obtenue en prsencce de 15 mM de
chloramphnicol sur les plants d'orge. L'appareil photosynthtique
n'est pas plus susceptible l'incubation 30C, et n'a donc pas t plus
endommage par la prsence d'une forte concentration de
chloramphnicol.
115
-100
tw
ffi
80
o><
60
Ca
1-
~
w
:E
40
CJ
-c 20
CJ
w
C
o o~--------------------~----~----~----~
1
2
3
4
5
7
6

thylacodiennes sont isoles de plants d'orge non acclimats en
prsence ( 0 ) de 5 mM ou ( 0 ) de 15 mM de chloramphnicol.
FIGURE 40
116
Influence du cycloheximide
Une tude semblable la prcdente a t ralise mais

en prsence de 5 mM de cycloheximide comme antibiotique (Figure
41). Lorsqu'on expose les membranes 30C, leur rsistance ne semble
pas possible pour aucune d'entre elles. Il tait prvisible de constater
que la membrane acclimate pralablement 40C est inhibe en
prsence du cycloheximide. Cet antibiotique est un inhibiteur de la
synthse nuclaire et sa prsence a donc prohib la synthse des HSP
de 21 et 70 kDa.
Une incubation de plants d'orge dans 15 mM de
cycloheximide pendant 3 h nous permettra de confirmer que la
prsence de cet antibiotique n'a pas perturb l'appareil
photosynthtique et que celle-ci possde le mme comportement vis-vis d'une incubation 30C que celle tant mise en contact de 5 mM
(Figure 42).
Selon les tudes de Schuster en 1988 l'utilisation de cet
antibiotique sur des cellules (Chlamydomonas), empche d'abord la
synthse des protines de 21 et 70 kDa mais aussi rend le PSII
susceptible la photoinhibition lors du stress thermique (Schuster et
al., 1988). Leurs tudes confirmrent que la prsence de la protine de
21 kDa accole la membrane thylacodienne au niveau des grana,
permettrait une protection du PSU contre une photoinhibition durant
le stress thermique. Cette situation est par contre non observe en
prsence de cycloheximide. Ce qui donnerait la prsence de HSP au
niveau de la membrane une double tche, celle d'entraner une
thermotolrance de l'appareil photosynthtique isol face la chaleur
et celle de contrer la photoinhibition du PSU durant le stress
thermique.
117
-100
~
80
60
"~
Cl
w
:E
w
40
c(
20
"
"
w
o
o
234
FIGURE 41
thylacodiennes sont isoles de plants d'orge non acclimats la
chaleur en prsence ( 6. ) ou absence ( 0 ) de cycloheximide ou des
membranes isoles de plants d'orge acclimats 40C 3 h en prsence
( ) ou absence ( ) d'antibiotique. L'erreur sur les mesures est au
maximum de 3%.
118
~100
o
-ffi
w
80
Cl
>
><
60
1-
ffi
:E
40
Cl
cC 20
Cl
W
o ~----~------~----~------~----~----~
5
6
1
234
o
Activit photosynthtique de la membrane en fonction

de la priode d'incubation 30C. Les membranes thylacodiennes
sont isoles de plants d'orge non acclimats en prsence ( 6 ) de 5 mM
ou ( 0 ) de 15 mM de cycloheximide. L'erreur sur les mesures est au
maximum de 2.5%.
FIGURE 42
119
Selon nos observations, la synthse des protines de 21 et

70 kDa est indispensable la membrane pour la conservation d 'une
bonne activit photosynthtique. De cette faon, une protection du
PSU est assure.
Le site d 'attachement de HSP21 a t confirm par
plusieurs auteurs comme tant au niveau des grana (Kloppstech et al.,
1985), ce qui nous indique qu'elle est associ au PSU, mais quel
niveau? Suite nos tudes, l'association de cette protine la
membrane prvient l'inhibition de l'activit photosynthtique du PSU;
ainsi son affiliation doit tre au niveau du centre ractionnel de ce
photosystme. Plusieurs auteurs ont affirm que le stress thermique
produisait une dissociation soit de la protine DIou du complexe ce
dgagement d'oxygne tous deux retrouvs au niveau du centre
ractionnel du PSI!. Ainsi ce genre de dissociation entrane
inivitablement une inhibition de l'activit photosynthtique. Le
complexe de dgagement d'oxygne, comme dj mentionn
auparavant regroupe trois protines extrinsques de 32, 23 et 17 kDa
qui sont essentielles l'activit photosynthtique par leur fonction
dans la photolyse de l'eau. Des tudes, effectues par Sabat et ses
collaborateurs (1986) dmontrrent que l'effet de la chaleur entranait
justement l'inactivation du complexe de dgagement d'oxygne en
empchant la ralisation de la photolyse de l'eau. Ils affirmrent aussi
que ce complexe est relativement plus faible que les autres
composantes de la chane de transport d 'lectrons. Cependant nos
rsultats dmontrent une conservation de cette activit suite
l'acclimatation ainsi qu'une prservation du complexe de dgagement
d'oxygne. Comment cette activit et cette intgrit du complexe sontelles conserves? Une hypothse serait que la prsence du HSP de 21
est essentielle pour garder l'intgrit du complexe de dgagement
d'oxygne en s'infiltrant ou en s'associant ce complexe. Selon les
tude de Yamamoto (1979) la protine extrinsque de 33 kDa est la
protine "protectrise" du complexe, ainsi le rle du HSP21 durant le
stress thermique serait de prserver cette protine et de ce fait assurer
120
l'intgrit et le bon fonctionnement du complexe de dgagement

d'oxygne.
Des tudes ralises sur l'activit photosynthtique
durant un stress thermique en prsence de sucre (glycrol), indiqurent
qu'il y avait conservation de l'activit de la membrane d la prsence
de sucre qui permettait l'intgrit des lipides membranaires. La
prsence de sucre pourrait aussi bien, suivant notre hypothse,
permettre l'intgrit du complexe de dgagement d'oxygne. De plus,
cette hypothse d'association de la protine de 21 kDa avec le
complexe, permettrait d'expliquer la difficult pour certains auteurs
d'observer ces protines accroches la membrane puisque le
complexe de dgagement d'oxygne est un complexe de protines
extrinsques qui est facilement dissociable. Les travaux raliss par
l'quipe de biologistes molculaires de Vierling ces dernires annes
dmontrrent que la protine HSP21 se retrouvait seulement dans la
partie soluble (Vierling et al., 1985; Chen et al., 1990). Leur intrt se
portait seulement sur la localisation de la protine au niveau de la
membrane et non au niveau de l'activit photosynthtique. Alors, estce que l'extrait membranaire utilis par ces auteurs est pleinement
actif et comporte un complexe de dgagement d'oxygne encore
intgre soit non dissoci.
121
CONCLUSION
Le but de cette tude tait de mettre en relation la prsence des

protines de stress thermique et l'adaptation du photosystme II face
une lvation de temprature. Selon les rsultats obtenus, la prsence
de ces protines au niveau de la membrane, probablement associes au
complexe de dgagement d'oxygne, serait la principale source pour
l'acquisition de la thermotolrance de l'appareil photosynthtique.
Le tout premier objectif impos tait de dterminer les conditions
idales et essentielles pour obtenir de notre matriel biologique, une
rponse face l'augmentation de temprature. Cette rponse tant la
synthse de protines de choc thermique (HSP). L'identification par
autoradiogramme de ces protines de stress associes la membrane
thylacodienne (isole de plants d'orge acclimats 40C) nous a
permis de suspecter un rle fondamental pour ces protines. Leur
synthse ainsi que leur fixation au niveau de la membrane doivent
soutenir la fonction de l'appareil photosynthtique lors de stress.
Les expriences sur l'activit photosynthtique des membranes
incubes 30C ont t concluantes par le fait que l'activit du
dgagement d'oxygne est significativement plus stable chez les
thylacodes isols de plants acclimats 40C, comparativement aux
tmoins (23C). Cependant la littrature dmontre que le PSI est trs
rsistant mais que le PSII est extrmement sensible toutes lvations
de tempratures, ce qui entrane une inactivation du transport
d'lectrons ainsi attribue directement la vulnrabilit du centre
ractionnel de ce photosystme (PSII). Une acclimatation, comme il est
observ dans nos exprimentations, dmontre que le PSII a acquis une
122
tolrance face l'incubation 30C. Par contre, dans le cas des

membranes isoles de plants non acclimats la chaleur, une
incubation de cette membrane 30C, permet d'observer la
susceptibilit du PSll.
Il est cependant impossible d'observer une rsistance du
thylacode isol de chloroplastes acclimats lors de l'incubation
30C. Cette observation nous a dmontr que d l'absence de
synthse des HSP d'origine nuclaire, l'appareil photosynthtique
n'est pas dispos acqurir une thermotolrance. L'hypothse que les
HSP sont la source de l'acquisition de cette rsistance du PSII est
donc plausible.
La comparaison entre la composition polypeptidique des
membranes isoles de plants ou de chloroplastes acclimats attestent
que ces membranes sont distinctes. Le complexe de dgagement
d'oxygne constitu de trois protines extrinsques subi une
dissociation lors d'un choc thermique seulement pour la membrane
provenant de chloroplaste. Ce qui nous amne localiser les HSP au
niveau de ce complexe et leur attribuer le rle de protecteur contre la
dnaturation ou dissociation des protines de 32, 23 et 17 kDa lors
d'une lvation de temprature.
De plus, l'utilisation d'antibiotiques nous dmontre une inhibition
de la synthse de protines codes par le chloroplaste ou le noyau
prvient l'expression de cette acclimatation. L'action du cycloheximide
inhibe l'acquisition de thermotolrance par la membrane en prohibant
la synthse des HSP21 et HSP70. Par contre l'inhibition de la synthse
des protines provenant du gnome chloroplastique, par l'action du
chloramphnicol, amne aussi l'inhibition de l'acquisition de la
thermotolrance. La synthse des HSP d'origine nuclaire n'est pas
inhibe par le chloramphnicol par contre la prsence de cet
antibiotique empcherait l'intgration de HSP21 sur la membrane
thylacodienne. Une autre protine responsable de la fixation du
123
HSP21 et normalement synthtise par le chloroplaste est donc

manquante. Alternativement, nous pouvons suggrer que l'action du
chloramphnicol perturbe ou modifie le site de fixation de la protine
sur la membrane en empchant du mme coup la rsistance de
l'appareil photosynthtique la chaleur.
De rcentes tudes sur des cellules humaines dmontrrent que la
prsence de prostaglandine (protines synthtises lors de fivre, soit
lors d'une augmentation de temprature) entrane l'induction de la
thermotolrance des cellules en permettant la synthse de HSP70 sans
l'augmentation de temprature (Amici et al., 1993). Ainsi, des tudes
sur la possibilit que la synthse des protines de stress thermique
soient synthtises en absence d'une augmentation de temprature
(soit par la prsence de prostaglandine), renforcierait encore
d'avantage l'implication des HSP.
Par ailleurs, le mcanisme d'action des HSP au ruveau de la
membrane photosynthtique n'est pas connu prcisment. Des
travaux futurs impliquant l'utilisation de fragments membranaires
enrichis en PSU pourraient permettre de clarifier les mcanismes qui
soutendent l'acquisition de rsistance au niveau du complexe de
dgagement d'oxygne.
124
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UNIVERSIT DU QUBEC

COMME EXIGENCE PARTIELLE

"EXPRESSION D'UNE THERMOTOLRANCE AU NIVEAU DE LA

Universit du Qubec Trois-Rivires

Lauteur de ce mmoire ou de cette thse a autoris lUniversit du Qubec

A mes parents ...

... et celle ou celui qui grandit en moi

Les biologistes sont depuis longtemps fascins par la croissance

mcanismes de la photosynthse. Nos membranes thylacodiennes

J'aimerais tout d'abord faire part de ma graqtude mon

LISTE DES ABRVIATIONS

Srum albumine bovine

TABLE DES MATIRES

1. INTRODUCTION ....... . ........ . ....................... .1

Evaluer l'implication des HSP dans l'activit

2. APPAREIL PHOTOSYNTHTIQUE .......................... 5

2.2 Composition protique, lipidique et

2.5 Chane de transport d'lectrons .......................... 19

3. STRESS THERMIQUE ..................................... 24

3.1.1 Changements structuraux au niveau

de la membrane thylacodienne .................... 29

3.1.5 Origine des protines de choc thermique ............ 34

3.2 Thermotolrance et protines du choc thermique .......... 37

4. MATRIEL ET MTHODES ............................... 42

Compteur scintillation ........................ 43

4.2 Extractions du matriel biologique ...................... 44

Techniques de coloration ....................... 50

B. Coloration l'argent ........................ 50

4.4.1 Spectrophotomtrie UV-visible et

dtermination de la chlorophylle ................... 52

activit photosynthtique ......................... 52

intgrit des chloroplastes ........................ 53

RSULTATS ET DISCUSSION ......... . .................. 56

5.1 Modifications structurales de la membrane

5.2 Prsence des HSP au niveau de la membrane

6. CONCLUSION .......................................... 121

LISTE DES TABLEAUX

1. Nomemclature et localisation des complexes

photosynthtiques ............... . ....................... 17

thylacodiennes provenant de plantes acclimates

8. Activit photosynthtique des membranes

LISTE DES FIGURES

l'organisation de la membrane thylacodienne ................. 7

5. Transport des protines l'intrieur du

constituent la membrane thylacodienne ...................... 13

thylacodienne d'pinard .................................... 16

10. Reprsentation du complexe collecteur de lumire

Il. Spectre d'absoption des chlorophylles a et b ...................20

12. Transport d'lectrons travers le thylacode ..................22

13. Rorganisation de la membrane thylacodienne

21. Composition polypeptidiques de la membrane

23. Composition polypeptique de la membrane par la

nouvellement synthtiss en prsence

33. Pourcentage d'activit photosynthtique en

40. Activit photosynthtique en fonction du temps

La recherche sur les effets des stress physiologiques au niveau des

Les transformations apportes au monde vgtal par des

1.1 Objectifs du travail

1.1.1 Vrifier les modifications possibles au niveau

premier temps nous voulons observer si le fait de provoquer un stress

1.1.2 Vrifier la prsence de HSP au niveau de la membrane

d'incubation permettant aux protines de gagner leur site respectif.

1.1.3 Evaluer l'implication des HSP dans l'activit