CINTICA ENZIMTICA

1. CONCEITO
As enzimas so protenas especializadas em catalisar
reaes biolgicas, ou seja, aumentam a velocidade de uma
reao qumica sem interferir no processo.
Elas esto associadas a biomolculas, devido as suas
extraordinria especificidade e poder cataltico.
1.1 Importncia
Participa

das

reaes

qumica

de

processos

biotecnolgicos:
Exs:
1.FERMENTAO ALCOLICA

2. Obteno de Enantimeros

2. Histria
O nome enzima provm de "in yeasts", no qual
suspeitava-se que as catlises biolgicas estavam envolvidas
com a fermentao do acar em lcool.
A primeira descoberta foi feita por Payen e Persoz em
1833, quando encontraram uma substncia termolbil que
convertia amido em acar, denominada amilase.
Pasteur em 1860 postulou que as enzimas esto
associadas estrutura e a vida da clula.

Em 1877 Buchener obteve sucesso na extrao de

enzimas

de

clulas

de

leveduras

que

catalisavam

fermentao alcolica.
A enzima foi primeiramente isolada na forma cristalina,
mas isto foi compreendido melhor quando Summer em 1926
isolou urease de feijo e evidenciou que estes cristais
consistem em protenas.
Hoje 2000 diferentes enzimas so conhecidas, nas quais
muitas so isoladas na forma pura homogeneizada e 200 na
forma cristalizada.
3. NATUREZA E ESTRUTURA ENZIMTICA
Todas as enzimas so protenas, mas nem todas as protenas
so enzimas.
As protenas, como um todo, ocupam um papel de
destaque na dinmica e estruturao dos organismos vivos.
As enzimas, parte deste grupo de protenas, funcionam
como catalisadores, permitindo que uma reao qumica venha
a ocorrer dentro dos limites das temperaturas biolgicas.

Para um perfeito entendimento sobre a estrutura de uma

enzima e como esta funciona, devemos consider-la tanto
como uma protena quanto um catalisador biolgico.
Como uma protena a enzima apresenta blocos de
construo denominados aminocidos.
Algumas

protenas

so

constitudas

apenas

de

aminocidos. Outras protenas, alm de aminocidos, contm

outros componentes e so as protenas conjugadas.
A peroxidase e a catalase so exemplos de enzimas com
estrutura conjugada e que apresentam porfirina frrica como
cofator.
Muitas

enzimas

so

compostas

de

uma

cadeia

polipeptdica simples. Este caso de enzimas como a

ribonuclease, tripsina, pepsina e algumas alfa amilases.
Porm, existe um grande nmero de enzimas que so
compostas por mais de uma cadeia peptdica. Ex.: lactatodesidrogenase composta por quatro cadeias polipeptdicas.

A repetio das cadeias polipeptdicas na construo de

uma macromolcula de protena caracteriza a estruturao
quaternria que esta pode assumir.
4. NOMENCLATURA E CLASSIFICAO DAS ENZIMAS:
A nomenclatura mais utilizada feita pela adio do sufixo
ase ao nome do substrato (chamada de Nome Recomendado),
ou seja, a molcula na qual a enzima exerce sua ao.
Neste caso:
- A enzima urease catalisa a hidrlise da uria
em amnia e CO2;
- A arginase catalisa a hidrlise da arginina em
ornitina e uria, e:
- A fosfatase catalisa a hidrlise de steres de
fosfato.
Entretanto, esta nomenclatura simples no tem se
mostrado prtica uma vez que muitas enzimas recebem
denominaes que so muito pouco informativos.
Por esta razo, e tambm devido descoberta de novas
enzimas,

foi

proposta

uma

classificao

sistemtica

recomendada por uma comisso internacional de especialistas.

O novo sistema de classificao divide as enzimas em

Seis Classes Principais, nas quais esto inclusas subclasses
de acordo com o tipo de reao catalisada.
De acordo com esta sistemtica, cada enzima
designada por:
- Um Nome Recomendado, usualmente pequeno e
apropriado para o uso dirio;
- Um Nome Sistemtico, o qual identifica a reao
catalisada e;
- Um Nmero de Classificao, o qual usado
quando uma identificao precisa necessria.
Como exemplo do novo sistema de classificao,
considere a reao abaixo catalisada por uma enzima:
ATP + creatina ADP + fosfocreatina
O Nome Recomendado para esta enzima, que o
normalmente usado, creatininaquinase e;
O Nome Sistemtico, baseado na reao catalisada,
ATP:creatina fosfotransferase. Seu nmero de classificao
EC 2.7.3.2, onde:

- EC

representa

International

Enzyme
Union

Commission

of

of

Biochemistry

the
and

Molecular Biology IUBMB;

- O primeiro dgito, 2, a Classe (transferase);
- O segundo dgito, 7, a Subclasse (fosfotransferase);
- O terceiro dgito, 3, a Sub subclasse em que a
fosfotransferase apresenta um grupo nitrogenado
como aceptor, e;
- O quarto dgito, 2, designa uma creatina quinase.
O quadro abaixo relaciona os cdigos utilizados para a
aplicao do nmero de identificao das enzimas.
Classificao das Enzimas Segundo a Comisso de Enzimas
1.

Oxido-redutases

(reaes

de

oxidao-reduo

ou

transferncia de eltrons Desidrogenases e Oxidases)

1.1.atuando em CH-OH
1.2.atuando em C=O
1.3.atuando em C=O1.4.atuando em CH-NH2
1.5.atuando em CH-NH1.6.atuando em NADH, NADPH

2. Transferases (transferem grupos funcionais como amina,

fosfato, acil, carboxil Quinases e Transaminases)
2.1.grupos com um carbono
2.2.grupos aldedo ou cetona
2.3.grupos acil
2.4.grupos glicosil
2.7.grupos fosfatos
2.8.grupos contendo enxfre
3.Hidrolases (reaes de hidrlise de ligao covalente Peptidases)
3.1.steres
3.2.ligaes glicosdicas
3.4.ligaes peptdicas
3.5.outras ligaes C-N
3.6.anidridos cidos
4.Liases (catalisam a quebra de ligaes covalentes e a
remoo de molculas de gua, amnia e gs carbnico
Dehidratases e Descarboxilases)
4.1. =C=C=
4.2. =C=O
4.3. =C=N-

5.Isomerases (reaes de interconverso entre ismeros ticos

ou geomtricos - Epimerases)
5.1.racemases
6.Ligases (catalisam reaes de formao de novas molculas
a partir da ligao entre duas pr-existentes, sempre s custas
de energia - Sintetases)
6.1. C-O
6.2. C-S
6.3. C-N
6.4. C-C
5. CINTICA DA CATLISE ENZIMTICA
A cintica enzimtica a parte da Enzimologia que estuda
a velocidade das reaes enzimticas bem como os fatores
que a influenciam.
Os princpios gerais da cintica das reaes qumicas
aplicam-se s reaes catalisadas enzimaticamente.
Embora estas tambm mostrem um padro distinto que
no usualmente encontrado nas reaes no enzimticas:
Saturao com o Substrato.

No grfico abaixo podemos observar o efeito da

concentrao do substrato na taxa de uma reao catalisada
por uma enzima.

Forma tpica de uma curva de cintica enzimtica

Em baixas concentraes de substrato, a velocidade da
reao aumenta medida que aumenta a concentrao de
substrato, pois h muita enzima livre para ligar o substrato.
Em concentraes elevadas de substrato, a velocidade da
reao atinge um patamar, pois os stios ativos da enzima
comeam a ficar saturados com molculas de substrato
(complexo ES).
10

Todas as enzimas apresentam o efeito da saturao,

porm variando consideravelmente no que diz respeito
concentrao requerida para produzi-lo.
Esse efeito de saturao levou alguns pesquisadores a
estabelecerem a hiptese de que enzima e substrato reagem
reversivelmente para formar um complexo.
Em 1913 a teoria da ao e cintica enzimtica foi
desenvolvida por dois cientistas chamados L. Michaelis e M.
L. Menten, na qual uma reao enzimtica pode ser expressa
pela seguinte equao:

11

As molculas do substrato passam por uma srie de

formas

geomtrica

eletricamente

alteradas

antes

de

formarem produtos da reao.

As enzimas tm muito maior afinidade por estes estados
de transio do substrato do que tm por formas mais estveis.
A partir deste modelo de reao proposto desenvolveu-se
uma equao que permite demonstrar como a velocidade de
reao varia em funo da concentrao do substrato:

vo a velocidade inicial para cada concentrao de substrato

Vmax a velocidade mxima
[S] a concentrao de substrato
KM a constante de Michaelis-Menten
Vmax o valor para o qual tende a velocidade medida
que se aumenta a concentrao de substrato.
Corresponde situao experimental em que todos os
centros ativos das molculas de enzima esto saturados de
substrato.
12

KM o valor de [S] para o qual v o=Vmax/2 e uma medida

da afinidade da enzima por um determinado substrato. um
valor especfico de cada par de enzima-substrato.
O quadro abaixo relaciona algumas enzimas e seus
respectivos Km.
Enzima
Catalase
Hoxoquinase

Substrato
H2O2
Glicose

Km (mM)
25
0,15

Quimiotripsina

Frutose
N-benzoltirosinamida

1,5
2,5

N-formiltirosinamida

12,0

N-acetiltirosianamida

32

Anidrase carbnica
Glutamato

Gliciltirosinamida
HCO3Glutamato

122
9,0
0,12

desidrogenase

a-cetoglutarato

2,0

NH4+

57

NADox

0,025

Aspartato

NADred
Aspartato

0,018
0,9

amininotransferase

a-cetoglutarato

0,1

Oxalacetato

0,04

Glutamato

4,0

13

Pode-se observar pelo quadro apresentado que os valores

de KM no so fixos e podem variar com a estrutura do
substrato, com o pH e com a temperatura.
Para enzimas que atuam em mais de um substrato, cada
substrato tem um KM caracterstico.
A constante de Michaelis-Menten de uma enzima ,
portanto, uma caracterstica muito importante e fundamental,
no apenas matematicamente como tambm na avaliao da
atividade e na purificao das enzimas.
5. MECANISMO DA AO ENZIMTICA
5.1. Enzima como catalisador
O princpio de catalisador diminuir a energia de
ativao. A enzima se liga a uma molcula de substrato em
uma regio especfica denominada stio de ligao.

14

Esta regio um encaixe que apresenta um lado

envolvido por cadeias de aminocidos que ajudam a ligar o
substrato, e o outro lado desta cadeia age na catlise.
Em 1894 Emil Fischer props o modelo chave
fechadura para explicar a ao enzimtica.
A enzima se encaixa com o substrato especfico no stio
ativo, como uma chave e fechadura.

15

Tanto a enzima quanto o substrato sofrem conformao

para o encaixe.
A enzima no aceita simplesmente o substrato, o
substrato distorcido para conformao exata do estado de
transio, o encaixe por induo, proposto por Koshland
(1958).

Ao completar a reao cataltica a enzima libera o

produto e retorna a forma original. O processo ocorre em duas
etapas:
(1) S + E

ES*

(etapa reversvel)

(2) ES

E + P (etapa irreversvel)

* complexo enzima-substrato
16

5.2 Fatores que Influenciam na Velocidade da Reao

Enzimtica:
1. Temperatura : Quanto maior a temperatura, maior a
velocidade da reao, at se atingir a TEMPERATURA
TIMA; a partir dela, a atividade volta a diminuir, por
desnaturao da molcula.

2. pH : Idem temperatura; existe um pH TIMO, onde a

distribuio de cargas eltricas da molcula da enzima e,
em especial do stio cataltico, ideal para a catlise.

17

3. Concentrao de enzima: a velocidade de transferncia

de substrato em produto proporcional quantidade de
enzima.

18

5.3. Inibio Enzimtica

Muitos tipos de molculas inibem as enzimas e podem
agir de vrias formas. A principal distino entre inibio
reversvel e inibio irreversvel.
A forma que envolve ligaes no-covalentes reversvel,
atravs da remoo do inibidor.
J a inibio irreversvel, a ligao molecular covalente.
So geralmente encontrados em reaes que apresentam
toxinas especficas.
5.3.1. Inibio Reversvel
Existem vrios modos que esto envolvidos com ligao
no covalente, eles diferenciam quanto ao mecanismo pelo
qual diminuem a atividade enzimtica e como eles afetam na
cintica da reao.
A) Inibio Reversvel Competitiva
Uma molcula apresenta estrutura semelhante ao
substrato da enzima que se liga para realizar a catlise, ela
poder aceitar esta molcula no seu local de ligao.

19

Mas no haver o processo cataltico, pois ocupando o

stio ativo do substrato correto. Portanto o inibidor compete
pelo mesmo local do substrato.
O efeito da reao modifica o KM, mas no altera a
velocidade.

20

B) Inibidor Reversvel no Competitivo

Ocorre quando um molcula ou on pode se ligar em um
segundo local na superfcie enzimtica (no no stio ativo).
Isto pode distorcer a enzima tornando o processo
cataltico ineficiente.
O inibidor no competitivo pode ser uma molcula que
no se assemelha com o substrato, mas apresenta uma grande
afinidade com a enzima.

o mecanismo inverso do inibidor competitivo, porque

inibe a ligao do complexo ES e no da enzima livre.

21

O efeito da reao modifica a velocidade e o K M

permanece constante.

5.3.2. Inibio Irreversvel

Algumas substncias se ligam covalentemente s
enzimas deixando-as inativas.

Sntese de prostaglandinas inibida.

22

Na maioria dos casos a substncia reage com o grupo

funcional no stio ativo bloqueando o local do substrato,
deixando a enzima catalticamente inativa.
Inibidores

irreversveis

podem

ser

extremamente

seletivos, pois so semelhantes ao substrato.

5.4. Cofatores
Para alguns tipos de processos biolgicos, apenas a
cadeia protica no suficiente, por isso a protena requer uma
molcula denominada cofator.
O Cofator pode ser uma pequena molcula orgnica,
denominada coenzima ou um on metlico.
A

catlise

ativa

enzima-cofator

denominada

holoenzima, quando o cofator removido, fica a protena, a

qual catabolicamente inativa e denominada apoenzima.

23

5.4.1. Coenzimas
A molcula orgnica que se liga s enzimas para ativar
uma reao, denominada coenzima, cada tipo apresenta uma
funo qumica particular, algumas so agentes oxi-redutoras,
outras transferidoras, etc.

24

6. TCNICAS EMPREGADAS NO ESTUDO DAS ENZIMAS

6.1. Anlise de Velocidade de reao cataltica
Existem duas formas essenciais para o estudo da
cintica de uma enzima.
- Primeiramente

deve

ser

feito

medies

sob

condies na qual mantenha o estado de equilbrio;

- Depois observar a aplicabilidade da equao de
Michaelis-Menten, e determinar a velocidade de
reao pela concentrao do substrato e da enzima.
6.1.1 Anlise do Equilbrio de Reao
O equilbrio de uma reao enzimtica estabelecido em
segundos ou poucos minutos. Algumas tcnicas de avaliao:
A) Espectrofotometria
um mtodo simples e apurado. medido pela
absoro de luz na regio espectral do substrato ou produto
formado na reao.

25

B) Fluorescncia
similar a metodologia de espectrofotometria. O
substrato ou o produto deve emitir fluorescncia neste
espectro.
A tcnica vantajosa por ser altamente sensvel, a
soluo a ser empregada deve estar extremamente diluda.
C) Titulao automtica
utilizada quando a reao produz ou consome cido ou
base. Titula-se na soluo cido ou base para que o pH
continue constante. A quantidade de cido ou base consumido
o valor da reao cataltica enzimtica.
D).Anlise Radioativa
avaliado quando o substrato marcado com istopo
radioativo, o qual ser perdido ou transferido durante a reao
a ser estudada. um mtodo extremamente sensvel para
anlise cintica enzimtica.

26

6.2. Anlises de reaes com alta velocidade

6.2.1 "Stopped Flow"
A enzima e o substrato so inicialmente separados em
seringas, que rapidamente libera seu contedo at uma
cmara misturadora e em seguida passa para a seringa que
para a reao.
Neste instante um detector mede a absorbncia de luz ou
fluorimetria.

6.2.2 "Temperature Jump"

O processo ocorre quando a mistura de reao, que est
em equilbrio numa Temperatura 1, rapidamente passada
uma temperatura 2.

27

O ponto de equilbrio mudar e a reao deve ocorrer

para que a reao alcance um novo equilbrio.
A mudana rpida de temperatura obtida por uma
exploso de corrente eltrica nos eletrodos imergidos na
mistura de reao.
O

tempo

de

relaxamento

entre

mudana

de

temperatura medido por absorbncia ou fluorescncia.

6.3. Anlise quantitativa da atividade enzimtica

Para obteno de uma anlise quantitativa necessrio
saber:
- Toda estequiometria de uma reao cataltica;
- Se a enzima requer adio de cofatores como um on
ou coenzima;
- A dependncia da enzima sob a concentrao do
cofator ou substrato;
- O pH timo;
- A temperatura pela qual a enzima est estvel e
apresenta alta atividade.

28

- O procedimento para determinao do aparecimento e

desaparecimento do substrato de um produto de
reao.
A anlise quantitativa confirmada quando o substrato
ou o produto colorido ou absorvido em luz ultravioleta.
O valor de aparecimento ou desaparecimento do produto
ou substrato absorvido por luz pode ser analisado pelo
espectrofotmetro.
Alm do produto ou substrato pode - se analisar o
intermedirio

(aquele

que

serve

como

ponte

para

desencadeamento de outra reao).

6.3.1. Purificao enzimtica
As enzimas so encontradas na natureza em misturas
complexas, geralmente as clulas apresentam centenas ou
mais diferentes enzimas, para um estudo aprofundado deve-se
purificar a enzima a ser estudada.
Em alguns casos possvel atravs da aplicao de
mtodos especficos utilizar enzimas nos estado impuro, mas

29

na maioria dos casos, a presena de outras enzimas interfere

nos substratos desviando as reaes especficas.
6.3.2. Mtodos de purificao
1) Teste primeiramente faz-se uma anlise quantitativa
da atividade da enzima a ser estudada. A enzima deve
ser isolada utilizando - se o teste de atividade em
diferentes fraes, sendo mais importante que a
exatido do mtodo.
2) Procedimento

Geral

definio

da

unidade

enzimtica, concentrao e atividade especfica.

3) Origem enzimtica determinao do local (tecido) de
maior quantidade, geralmente a rpida centrifugao
adquire enzimas mitocondrial.
4) Extrao necessrio ter a enzima em soluo e,
portanto, a ruptura de membranas. Deve se utilizar
um tampo, pois ao romper o tecido pode ocorrer
liberao de substncias cidas que degradam a
enzima. Os mtodos utilizados so o mecnico com
partculas de areia, nitrognio lquido, "shaker" em alta
velocidade, ondas de ultrassom e solventes como
acetona.

30

6.3.3 Unidade de atividade enzimtica

definida pela quantidade que causa transformao de
1 mmol de substrato por minuto a 25C sob condies timas.
A atividade especfica o nmero de unidade de enzimas
por miligrama de protena, mede a pureza da enzima.
A atividade molar ou molecular ou nmero de "turnover",
o nmero de molculas do substrato transformado por uma
nica molcula de enzima ou nico stio de ligao em um
minuto, quando a enzima est no valor de limite.
A atividade molar pode ser calculada pela velocidade
mxima.
A nova unidade internacional da atividade enzimtica
determinada pela "Comisso da Enzima" o "katal", o qual
definido como a transformao do substrato em 1 mol por
segundo.
6.3.4. Mtodos de Fracionamento
O extrato de enzimas apresenta inmeras substncias
com diferentes pesos moleculares e de acordo com seu
interesse de estudo utilizam-se diferentes mtodos:

31

1) Precipitao por diferena de pH

2) Desnaturao por aquecimento
3) Precipitao

com

solventes

orgnicos

(etanol,

acetona)
4) Precipitao por sais (sulfato de amnia)
5) Adsoro
6) Cromatografia - o mecanismo de separao depende
da adsoro, troca inica, afinidade especfica para
imobilizar

ligantes

especficos

ou

efeitos

de

peneiramento molecular.
7) Eletroforese - a mobilidade das protenas causada
por campo eltrico
8) Cristalizao
9) Concentrao reduo de volume atravs de
evaporao do solvente ou congelamento.

32