ndice General

Pg.
ndice

Introduccin

CAPITULO I: Marco Conceptual

1.1 Objetivo General

1.2 Objetivos Especficos

1.3 Filosofa de la empresa.
1.3.1 Misin
1.3.2 Visin.

1.3.3. Estructura organizativa

CAPITULO II Estudio de la Necesidad
2.1 Anlisis de patrones de necesidades actuales

2.2 Determinacin de las necesidades

2.3 Otros ofertantes

2.4 Precios manejados por los competidores

2.5 Porcentaje de la demanda que atender la empresa mixta

10

2.6 Cadena de Comercializacin y Distribucin

2.6.1 De los Competidores
2.6.2 De la Empresa de Produccin

11

2.6.3 Principales Distribuidores de la Empresa

CAPITULO III Estudio de la Cadena
3.1 Diagrama de la Cadena

12

3.2 Cadena dinamizada para el sector en estudio

3.3 Identificacin de Insumos

13

3.3.1 Insumos Nacionales

3.3.2 Insumos Importados
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CAPITULO IV Definicin, Caracterizacin de Productos y

Capacidad a Instalar
4.1 Cuadro: Definicin, Caracterizacin de Productos y Capacidad a Instalar

14

CAPITULO V Ingeniera
5.1 Cronograma

15

CAPITULO VI Ubicacin de la Planta

6.1 Requerimientos tcnicos para la localizacin geogrfica

16

6.2 Variables Socio-Econmicas del Proyecto

18

6.3 Requisitos Tcnicos

6.4 Variables Econmicas del Proyecto

19

6.5 Normas, permisologa y estndares de calidad

Referencias

21

INTRODUCCIN

Anteproyecto

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Captulo I
Marco Conceptual

SISTEMA ABO
El sistema ABO se conoci cuando Karl Landsteiner public su descubrimiento de
la aglutinacin de glbulos rojos humanos por sueros de otros individuos en
1900(51) y al ao siguiente clasific los tipos de sangre en tres grupos,
denominados A, B y O (20-21). Tambin descubri que el suero de individuos del
grupo A aglutinaba los glbulos rojos de individuos de grupo B y a la inversa, que
el suero de individuos del grupo B aglutinaba los glbulos rojos de individuos A.
Los glbulos rojos que no se aglutinaban con el suero de individuos del grupo A o
B se determinaron como pertenecientes a un tercer grupo, el grupo O y se
determin que el suero de los individuos pertenecientes a este grupo aglutinaba
los glbulos rojos tanto de los individuos del grupo A como del grupo B. En 1902,
dos discpulos de Landsteiner, von Descatello y Strli, identificaron el cuarto grupo,
el grupo AB.(22)
El sistema de grupo sanguneo ABO sigue siendo el ms significativo en medicina
transfusional.(23) Es el nico en el cual el suero de la mayora de las personas no
expuestas a eritrocitos humanos posee anticuerpos recprocos constantes y de
posible identificacin. A causa de estos anticuerpos, la transfusin de sangre ABO
incompatible puede provocar hemlisis intravascular grave, as

como otras

manifestaciones de las reacciones hemolticas transfusionales agudas. Por tanto

las

pruebas de deteccin de la incompatibilidad ABO entre los receptores y

donantes de sangre constituyen la base de los estudios pretransfusionales.

Antgenos

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Las pruebas de aglutinacin son usadas para detectar los antgenos A y B en los
glbulos rojos. Con frecuencia los anticuerpos reaccionan menos con los
eritrocitos de los recin nacidos que con los del adulto. Aunque pueden encontrase
en los glbulos rojos de embriones de 5-6 semanas, en el momento del nacimiento
los antgenos A y B no estn desarrollados por completo, quizs porque las
estructuras oligosacridas ramificadas surgen de manera gradual. Entre los 2-4
aos, la expresin de los antgenos A y B es completa y permanece ms o menos
constante durante toda la vida.
Subgrupos
Los subgrupos de ABO son fenotipos que difieren en la concentracin de estos
antgenos en los glbulos rojos y la saliva de aquellos que son secretores. Los
subgrupos A son ms comunes que los B. Los dos principales subgrupos A son los
A1 y A2. Los glbulos rojos de las personas de ambos subgrupos reaccionan
fuertemente con los reactivos anti-A en la prueba de aglutinacin directa. La
distincin serolgica de glbulos A1 y A2 se logra mediante pruebas que utilizan la
lectina anti A1. Existen diferencias cualitativas y cuantitativas entre A1 y A2.(24) La
transfersa A1 es ms eficiente en la conversin del sustancia H en antgeno A y
puede crear estructuras Tipo 3 A repetitivas. Existen alrededor de 10,5 x 105 sitios
de antgenos A en los glbulos rojos de adultos A1 y alrededor de 2,21 x 105 sitios
de antgenos A en los glbulos rojos de adultos A2.(25) El 80% de los individuos
del grupo A o AB posee glbulos rojos que se aglutinan en presencia de la lectina
anti-A1 y por lo tanto se clasifican como A1 o A1B. El 20% restante cuyos
eritrocitos son fuertemente aglutinados en presencia de anticuerpos anti-A, pero
no de la lectina anti-A1 se clasifican como A2 o A2B. En los donantes y receptores
no es necesario efectuar evaluaciones de rutina con anti-A1.
Los subgrupos ms dbiles de A2 son infrecuentes y en general se caracterizan
por el menor nmero de sitios antignicos A eritrocitarios y el incremento
proporcional de la actividad de los antgenos H. A menudo se reconocen los
subgrupos cuando existe una discrepancia entre la agrupacin de los glbulos
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rojos (directa) y el suero (inversa). La clasificacin de los subgrupos A dbiles (A3,

Ax, Am, Acl) suele basarse en:

El grado de aglutinacin de los glbulos rojos con anti-A y anti-A1.

El grado de aglutinacin de los glbulos rojos con sueros anti-A, B

humanos o monoclonales.

El grado de aglutinacin de los glbulos rojos con anti-H (Ulex europaeus).

La presencia o ausencia de anti-A1 en el suero.

La presencia de sustancias A y H en la saliva de los receptores.

Estudios de adsorcin/elucin.

Estudio de linajes familiares.

No se efecta la identificacin de rutina de los diferentes subgrupos A. La

clasificacin serolgica de los subgrupos A y B se desarroll con reactivos

policlonales humanos anti-A, anti-B y anti-AB. Estos reactivos han sido
reemplazados por reactivos monoclonales murinos y la reactividad depende del
clon o clones seleccionados por el fabricante. Sin embargo, es importante
considerar algunas caractersticas. Cuando se analizan los glbulos rojos A3 con
anti-A de donantes de grupo B o O muestran un patrn caracterstico de campo
mixto. Los glbulos rojos Ax no aglutinan en presencia de anti-A de personas del
grupo B, pero s con los anti-A,B del grupo O. Los eritrocitos Ax podran reaccionar
con algunos anticuerpos anti-A monoclonales. Los glbulos rojos Acl no aglutinan
conn anti-a o anti-b de ningn origen y la presencia de antgenos A slo se
demuestra mediante tcnicas de adsorcin y elusin. Los subgrupos B son an
menos comunes que los A.
Se confirm por estudios moleculares que los subgrupos A y B son
heterogneos y que la clasificacin serolgica no siempre correlaciona con el
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anlisis genmico; muchos alelos dan el mismo fenotipo debilitado y a veces, ms

de un fenotipo posee el mismo alelo.(26)
Anticuerpos anti-A y anti-B
En general, las personas poseen anticuerpos dirigidos contra los antgenos
A o B ausentes en sus glbulos rojos. Esta relacin complementaria previsible
permite efectuar la tipificacin ABO en el suero o en los glbulos rojos. Una de las
hiptesis que explica el desarrollo de estos anticuerpos se basa en que las
configuraciones responsables de los determinantes antignicos A y B de la
membrana eritrocitaria tambin existen en otras entidades biolgicas, en particular
las membranas celulares bacterianas. La distribucin de las bacterias es muy
amplia y su presencia en la flora intestinal, el polvo, los alimentos y otros sustratos
asegura la exposicin constante de todas las personas a antgenos del tipo A o B.
Los individuos inmunocompetentes reaccionan contra los antgenos ambientales
produciendo anticuerpos contra aquellos ausentes en el organismo. As, las
personas de los grupos O y B sintetizan anticuerpos anti-A y las de los grupos O y
A, anti-B. Las del grupo AB que exhiben ambos antgenos, no generan
anticuerpos. Esta explicacin ambiental de la emergencia de los anticuerpos antiA y anti-B sigue siendo presuntiva.
Momento de aparicin
En general, los anticuerpos anti-A y anti-B se detectan en el suero despus
de los primeros 3 a 6 meses de vida. La deteccin de anti-A y anti B en el suero de
los recin nacidos y lactantes menores de 4-6 meses no es vlida, porque algunos
o todos los anticuerpos derivan de la transferencia placentaria de IgG anti-A y antiB maternas. En ocasiones, algunos lactantes producen estos anticuerpos desde el
momento del nacimiento.(27)
La sntesis de los anticuerpos aumenta progresivamente, alcanzando los
niveles del adulto entre los 5-10 aos y en las etapas tarda de la vida declina. Las

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personas de edad avanzada poseen concentraciones de anti-A y anti-B ms bajas

que los adultos jvenes.
Reactividad de los anticuerpos anti-A y anti-B
Las inmunoglobulinas anti-A predominantes en los individuos del grupo B y
anti-B en los del grupo A, son IgM, aunque tambin se advierten pequeas
cantidades de IgG. Las IgG son las anti-A y anti B predominantes en el suero del
grupo O.(28) Como la IgG atraviesa la placenta con facilidad y la IgM no, en los
hijos de grupo A o B de madres del grupo O el riesgo de enfermedad hemoltica
del recin nacido (EHRN) es mayor que en los hijos de madres del grupo A o B.
La IgM y las IgG anti A y anti-B aglutinan los glbulos rojos en forma
preferencial a temperatura ambiente (20-24C) o menor y activan el complemento
a 37C.
La capacidad ltica mediada por complemento de estos anticuerpos se pone
de manifiesto cuando las pruebas incluyen una fase de incubacin a 37C. Los
sueros de algunas personas hemolisan los eritrocitos ABO incompatibles a
temperaturas inferiores a 37C. Cuando el sobrenadante del suero es rosado o
rojo y/o el botn celular es escaso o nulo, cabe pensar en hemlisis por
anticuerpos

ABO.

La

hemlisis

debe

interpretarse

como

mediada

por

complemento cuando al suspender los glbulos rojos en plasma o en agentes

inactivadores como el EDTA, esta no ocurre.
Reactividad anti-A,B (suero del grupo O)
El suero delos individuos del grupo O contiene anticuerpos denominados
anti-A,B porque reaccionan con glbulos rojos A y B y esos anti-A y anti-B no
pueden separarse por adsorcin diferencial. Cuando se incuba suero del grupo o
con clulas del grupo A o B, los eluatos exhiben reactividad contra los eritrocitos A
y B. La saliva de los secretores de sustancia A o B inhibe la actividad de estos
anticuerpos contra glbulos rojos A o B.
Anticuerpos anti-A1
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Los anticuerpos anti-A1 aparecen como alo anticuerpos en el suero del 1%

al 2% de los individuos A2 y del 25% en los individuos A2B.(24) En ocasiones
Tambin se encuentra anti-A1 en el suero de individuos con otros subgrupos
dbiles de A. El anti-A1 puede generar discrepancias en la tipificacin ABO e
incompatibilidad en pruebas cruzadas con glbulos rojos A1 o A1B. Los anti-A1
generalmente reaccionan mejor, o solamente, a temperatura ms bajas que 37C
y no se considera significativo si no muestra reactividad a 37C. Cuando reacciona
a 37C, solamente se deben usar los eritrocitos A2 o O para la transfusin.
En los estudios de adsorcin simple, los anticuerpos anti-A del grupo-B
parecen contener anti-A y anti-A1 separables. El suero del grupo B aglutina los
glbulos rojos A1 y A2, slo reacciona con los A1. No obstante, si se efectan
pruebas adicionales, las diferencias en la expresin de los antgenos A entre las
clulas A1 y A2, parecen ser ms cuantitativas que cualitativas.(25)
Existen reactivos anti-A confiables, derivados de la lectina de Dolichos
biflorus que pueden adquirirse en el mercado o prepararse. El extracto vegetal
reacciona con eritrocitos A1y A2 pero el diluido en forma apropiada no aglutina las
clulas A2 y por lo tanto, constiyuye un anti-A1.

El mismo objetivo pude

alcanzarse si se utiliza una dilucin apropiada de un AcMo anti sustancia H.(29)

SISTEMA RH
El sistema Rh fue descrito hace ms de 60 aos por Levine y Stetson en
1939. Estos autores reportaron como una madre que terminaba de dar a luz un
feto muerto y macerado, haba desarrollado una reaccin hemoltica severa a
causa de una transfusin de sangre proveniente de su esposo. Ellos encontraron
que el suero de esta mujer aglutinaba los eritrocitos de su esposo y el 80 % de los
donantes caucsicos ABO compatibles. Un segundo hallazgo, esta vez
experimental, se produce en 1940, como resultado de los experimentos realizados
en animales por Landsteiner y Wiener (30-31). Ellos inmunizaron conejos y
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cobayos con glbulos rojos de monos Macacus rhesus y de esa forma obtuvieron
un suero que aglutinaba los glbulos rojos de los monos rhesus y el 85 % de la
poblacin blanca de Nueva York.
Al inicio se pens que los anticuerpos identificados en los animales de
experimentacin (anti-Rh) y los encontrados en el suero de algunas personas
sensibilizadas, estaban dirigidos contra la misma sustancia antignica. Hasta ese
momento todo sugera que el antgeno presente en el glbulo del Macacus rhesus
y el hallado en el humano era el mismo (factor Rh) y

por consiguiente, los

correspondientes anticuerpos deberan poseer igual especificidad. Ms tarde se

pudo demostrar que esto no era cierto, pero se mantuvo el trmino factor Rh
acuado por Landsteiner y Wiener. El heteroanticuerpo fue denominado LW y el
anticuerpo humano se denomin anti Rh.
El sistema Rh es despus del ABO el ms importante de los sistemas de
grupos sanguneos, por sus implicaciones clnicas en la transfusin sangunea y
en la etiopatogenia de la enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN). Este
sistema es el ms polimrfico y complejo de los sistemas de grupo sanguneo. Su
importancia desde el punto de vista clnico radica en que de los 46 antgenos
relacionados con el sistema, cinco (D,C,c,E,e) son altamente inmunognicos
especialmente el Rh (D).(32-33)
Las protenas de sistema Rh son codificadas por genes denominados RH30
RHDCE y RH50. Tales nmeros (30 y 50) estn relacionadas con la masa
molecular de las protenas generadas respectivamente al migrar en gel de
poliacrilamida.
Se usa el trmino genrico RHD y RHCE para los genes que codifican a la
protena RhD y a la protena RHCE respectivamente y el trmino RHAG para el
gen que codifica a la glicoproteina asociada al Rh RhAG. Los antgenos
comunes del sistema son: D, C, c, E e, los cuales eran escrito originalmente en
orden alfabtico (CDE). Posteriormente, cuando se descubri que los antgenos C
y E se heredaban en bloque, el orden fue cambiado a DCE.(33) Aunque el
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antgeno d no existe, esta letra se usa para indicar un fenotipo D negativo. Las
formas ms frecuentemente encontradas del RHCE y RHD son las siguientes:(34)
Dce, dce, Dce, dCe, DcE, dcE, DCE y dCE (nomenclatura de Fisher y Race(35))
conocidos tambin respectivamente como Ro, r, R1, r, R2, r, Rz y ry
(nomenclatura de Wiener(34)). La R mayscula se usa cuando el antgeno D se
expresa y la r minscula cundo no existe (Tabla I). Los fenotipos que expresan
raras delecciones utilizan guiones para indicar la carencia de un determinado
antgeno (Dc-, para los que carecen de E e, D--, para los que carecen de C, c, E,
e). Los eritrocitos con el llamado fenotipo Rh nulo, no expresan ningn antgeno.
Muchas nomenclaturas han sido utilizadas para describir antgenos, protenas y
genes del sistema Rh. El Comit de Terminologa de la Sociedad Internacional de
Transfusin Sangunea, utiliza una nomenclatura numrica basada en la descrita
por Rosenfield,(36) en la cual a cada antgeno se le asigna un nmero segn la
cronologa de su descubrimiento.
En la (Tabla.- II) se representan los fenotipos ms frecuentes (expresados
en las tres nomenclaturas) al utilizar los cinco principales anticuerpos dirigidos
contra este sistema.
Las protenas RhD y RhCE tienen un alto porcentaje de homologa (92%)
entre si y comparten homologa en un 38,5% y 39.2% respectivamente con la
glicoproteina Rh50, sugiriendo que forman parte de una misma familia proteica.
(37-38)
La protena Rh transporta los antgenos del sistema Rh, pero slo se
expresa sobre la superficie del eritrocito si el RhAG est presente.
Existen protenas accesorias que estn asociadas a la familia de las
protenas Rh, las cuales estn deficientes o ausentes en el Rh nulo.
Este conjunto de protenas es denominado complejo Rh.(33) Las
protenas RhD expresan el antgeno D, mientras que las RhCcEe, transportan
antgenos C c junto al E e en la misma molcula. Los anlisis de las
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secuencias de aminocidos (aa) demuestran que los primeros 41 aa N-terminales

del RhD y del RhCE son idnticos y que las diferencias con las formas comunes
del RHCE son slo 30-35 aa a lo largo de la protena total, de los cuales diez de
ellos estn ubicados en las lazadas extracelulares de la protena, formando
eptopes inmunognicos. A pesar del

alto grado de homologa, las protenas

RhCcEe no expresan ningn eptope D y los Rh D no expresan eptopes C E.

(39-40)
El RhAG (tambin denominado Rh50, Rh50A glicoproteina, D50, protena
MB-2D10,GP50, GP50A) se caracteriza por tener glicosilado uno de los dos sitios
accesibles (N-glicano). Por lo general los sitios N-glicanos transportan antgenos
ABO, pero en este caso no se ha demostrado que posea tal funcin.
Sistema Rh y su importancia clnica
El antgeno D es altamente inmunognico e induce una respuesta inmune
en el 80 % de las personas Rh negativo que se transfunden con 200 ml de sangre
D positivo. Por esta razn es obligatorio tipificar rutinariamente a los donantes de
sangre y a los receptores, a fin de que los Rh negativos reciban productos Rh
negativo. De esta manera las complicaciones clnicas debidas a incompatibilidad
sangunea Rh son muy raras.
Otra forma de sensibilizacin es a travs del embarazo. Existe
aproximadamente un 16 % de sensibilizacin en mujeres D negativo que paren
hijos ABO compatibles D positivo cuando no reciben la inmunoglobulina anti-D
como profilaxis a la sensibilizacin.(41) Cuando existe incompatibilidad maternofetal para el antgeno D, se produce la EHRN. A pesar del uso de la
inmunoglobulina anti D en forma profilctica, la aloinmunizacin por embarazo
ocurre(33).
Criterios para la seleccin de un reactivo anti D (AcMo) para ser utilizado en
donantes y pacientes

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En vista de la importancia clnica y transfusional del antgeno D, su

determinacin debe ser hecha rutinariamente a cada donante y receptor de sangre
y a las mujeres embarazadas. En estas ltimas sera de utilidad conocer el
genotipo del feto para su apropiado manejo.(42)
Por lo tanto es necesario que el fenotipaje del antgeno D se realice e
interprete correctamente. Tambin es importante conocer la capacidad de los
diferentes reactivos en detectar las variaciones fenotpicas y considerar su
relevancia clnica.
Tipificacin del Rh D. Reactivos y tcnicas
Los primeros reactivos utilizados, provenan de donantes sensibilizados y
eran de tipo IgM (reaccin en salina). Eran buenos pero poco prcticos, porque
requeran largo tiempo de incubacin.
Posteriormente en 1945 Diamon y Denton (43) desarrollaron antisueros de
tipo IgG potenciados con protenas y otras sustancias, de manera que se acortara
el tiempo de incubacin y se generaban reacciones fuertes. Adems

podan

detectar los D dbiles ya que por ser IgG, la prueba se llevaba hasta la fase de
antigloulina humana (AGH).
El problema que presentaron estos reactivos fueron las falsas reacciones
positivas en pacientes con disproteinemias o con la prueba de Coombs positiva.
Por ello se tuvo que adicionar un control paralelo a la prueba del Rh.
En 1977, Romans(44) describi un proceso qumico mediante el cual se
rompan los puentes disulfuros que mantenan rgida la molcula de IgG,
comunicndole propiedades que la asemejan a la IgM, incrementndose

la

posibilidad de reaccionar en salina y reducindose la potenciacin con protenas.

En los ltimos aos, los reactivos policlonales han sido sustituidos por los
monoclonales humanos, debido a las ventajas que ellos presentan. Son potentes,
vidos y especficos; de fcil uso en el laboratorio, no tienen contaminantes,
pueden ser cuantificables en forma precisa, pueden ser obtenidos en grandes
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volmenes, sin variaciones en sus propiedades y no son dependientes de

donantes. Estos anticuerpos tambin representan un valioso instrumento para la
sustitucin de los reactivos policlonales en la profilaxis de la EHRN.(21)
Sin embargo, los AcMos estn dirigidos a eptopes especficos del antgeno
D, los cuales pueden estar expresados normalmente, en forma reducida o estar
ausente segn el fenotipo. Ningn AcMo detecta todas las variantes de D. Para
solventar esta situacin, algunos investigadores recurrieron a la mezcla de los
AcMos IgM en alto ttulo, con anti D policlonal (IgG), de manera de poder utilizar la
prueba de la anti-globulina humana AGH para la fase Du. Este tipo de
combinacin ha sido utilizada ampliamente por los laboratorios comerciales. En
Venezuela es obligatorio llevar hasta la fase de AGH todo tipiaje D negativo, por lo
tanto este tipo de reactivo es conveniente para nosotros. Pero es muy importante
realizar las combinaciones en las proporciones adecuadas, ya que la IgG puede
causar bloqueo de la IgM reducindose la capacidad de reaccin sobretodo en
fenotipos R1r. Esto retarda la tipificacin en estos casos, por requerirse
prolongacin en la ejecucin de la prueba, al tenerse que incrementar el tiempo de
incubacin e incluso tener que llevarse a la fase de AGH (experiencia personal
Dra. G. Len).
Otra alternativa que existe es hacer una mezcla de AcMos IgM e IgG. Esto
tiene la ventaja de que se elimina el lavado de las clulas previa a la adicin de la
AGH (paso requerido con los policlonales).
Igual que en el caso anterior, la mezcla debe hacerse con mucho cuidado para
evitar bloqueos.
Con los reactivos mezclados (mezclas oligoclonales) se reduce la
posibilidad de deteccin directa de los D dbil o variantes dbiles de D. Algunos
anti D IgM pueden ser potenciados para detectar D muy dbiles en salina. Pero su
patrn de reactividad con diferentes clulas es heterogneo.

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Scott M L et al,(45-46) reportaron un AcMo anti-D (IgM) que detecta D

dbiles en salina, en la misma forma como lo hace un anticuerpo anti-D (IgG) por
AGH. Con ste tipo de reactivo slo muy pocos D (muy dbiles) pueden ser
tipificados como negativos y recibir erradamente transfusiones negativas.

ANTICUERPOS MONOCLONALES
La

posibilidad

de

obtener preparaciones especficas, repetibles e

inagotables de anticuerpos con funciones predeterminadas, se hizo realidad entre

1974 y 1975, como resultado de los experimentos realizados en Cambridge, Reino
Unido, por George Khler y Csar Milstein.(47) La tecnologa de generacin de
clulas secretoras de anticuerpos monoclonales (AcMo) desarrollada a partir del
descubrimiento realizado por los citados autores y el posterior perfeccionamiento
del mtodo por otros investigadores, sobre todo en lo referente a la obtencin de
lneas

de

mielomas

con

caractersticas

ptimas(48,49)

revolucion

las

posibilidades del uso de las inmunoglobulinas en la investigacin bsica, en

tcnicas diagnsticas, seroterapia y procesos industriales.
En la actualidad los AcMos, producidos por hibridomas (hbridos obtenidos
por fusin celular entre linfocitos B y clulas de mieloma), se emplean en la
purificacin y caracterizacin de molculas diversas, la manipulacin de la
fisiologa y la bioqumica celular, la definicin de fenotipos y subpoblaciones
celulares, el tipiaje de antgenos de tejido y de grupos sanguneos, la deteccin de
los niveles circulantes de hormonas y otros factores sricos, la demostracin de
dao tisular, la de txicos, mutgenos y drogas, en el estudio de las
enfermedades infecciosas, parasitarias y de tumores malignos, en el diagnstico
agrcola y veterinario y en la purificacin de frmacos y vacunas. Los AcMos
tambin se aplican en la terapia antitumoral y en procesos spticos e inflamatorios
y se evalan como catalizadores de reacciones qumicas y bioqumicas. Por todo
lo antes expuesto se infiere que los AcMos se han convertido en uno de los

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elementos bsicos de la biomedicina moderna, as como de otras ramas de la

ciencia y la tecnologa (50).
La generacin de hibridomas de ratn y rata (origen mrido) productores de
AcMos es una tecnologa noble que funciona en laboratorios con muy diverso
equipamiento, condiciones y experiencia, siempre que los operadores se ajusten a
un rigor experimental elemental. (51-52)
Poco tiempo despus del

reporte de Khler y Milstein se comenz la

adaptacin de la tcnica a clulas humanas.(53) La cual es mucho mas compleja

en relacin a lo que sucede en ratn y rata. Ello hace que existan muy pocas
aplicaciones comerciales de AcMos humanos.
La produccin de AcMos contra los antgenos del sistema ABO y otros
antgenos eritrocitarios, es posible obtenerla a travs de la formacin de hbridos
mridos (51,52,54,55) y la produccin de AcMos contra los antgenos del sistema
Rh es posible a travs de la formacin del heterohibridomas (Produccin de
heterohibridomas utilizando como clulas productoras de anticuerpos linfocitos B
transformados por el VEB y como pareja de fusin clulas de mieloma de ratn
deficientes de la enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasa (HGTPRT)),
debido a que el ratn tiende a responder contra el complejo Rh en su totalidad y
no contra los antgenos especficos del sistema.(56-57)

PRODUCCIN A GRAN ESCALA

MEDIOS DE CULTIVO
Tradicionalmente se ha utilizado suero de origen animal (suero fetal bovino,
suero bovino adulto, suero equino) como suplemento del medio de cultivo
empleado para el crecimiento de las clulas de mamferos cultivadas in vitro. Entre
las dificultades asociadas al uso de suero animal en los cultivos de clulas
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utilizadas en la produccin de anticuerpos de uso teraputico o como reactivos se

encuentran:
Su alto costo
Su composicin indefinida.
La variabilidad lote a lote.
El potencial riesgo de la presencia de micoplasmas, virus y otros agente
adversos.
El desarrollo de medios de cultivo de composicin definida, es decir libres
de suero, hidrolizados proteicos u otras mezclas de origen animal o vegetal cuya
composicin exacta no pueda ser determinada ni reproducida, y de medios libres
de cualquier protena, ha sido objeto de numerosos estudios (59-62). Entre las
ventajas que ofrecen estos medios de cultivo se encuentran las siguientes:
Reproducibilidad de los cultivos.
Menor riesgo de aparicin de patgenos oportunistas (virus, micoplasmas,
priones).
Simplificacin y reduccin de costos del proceso.
No obstante, debe tenerse en cuenta que la formulacin ptima de un
medio de cultivo libre de suero o de un medio de cultivo libre de protenas
depende fuertemente de la lnea celular empleada, del clon particular, de las
condiciones de cultivo y de las variables del proceso, por lo que debe ser objeto de
un estudio cuidadoso y especfico para cada caso (63-65).

SISTEMAS DE CULTIVO CELULAR

En el cultivo de clulas animales se emplean diferentes sistemas para el
crecimiento celular, en funcin de la capacidad de las clulas de crecer en forma
dependiente o independiente de una superficie (denominada sustrato), es decir,
adheridas o en suspensin.
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Sistemas adherentes
Para el crecimiento de las clulas adherentes se emplean numerosos soportes,
entre los que se encuentran:
Placas de cultivo: placas de poliestireno con un nmero variable de pozos, de
diferente superficie, para el cultivo celular en microescala (volumen mximo de
cultivo = 5 ml).
Frascos T: frascos de poliestireno que proveen una muy alta relacin
superficie:volumen. Los ms utilizados poseen una superficie til de crecimiento
de 25 cm2, 75 cm2 y 150 cm2 (volumen mximo de cultivo = 60 ml).
Frascos roller: Son frascos cilndricos sobre cuya superficie interna crecen las
clulas. Requieren de una cmara de cultivo especial en la cual son posicionados
horizontalmente, sobre una base rotatoria, que permite que giren a velocidades
variables con el fin de baar completamente las clulas con medio de cultivo
(volumen mximo de cultivo = 250 ml).
Microcarriers: son soportes polimricos relativamente cilndricos, lisos o
porosos, que permiten el desarrollo de clulas adheridas a su superficie. Se
utilizan principalmente en biorreactores agitados, que los mantienen en
suspensin (volumen mximo de cultivo = 10.000 l).

Sistemas en suspensin
Los sistemas de cultivo en suspensin requieren que las clulas sean
previamente adaptadas al crecimiento en estas condiciones; es decir, stas deben
perder su adhesin al sustrato y replicarse en un cultivo en agitacin continua.
Anteproyecto

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 Frascos agitados tipo spinner: Estos frascos de vidrio borosilicato son agitados
magnticamente, ya sea mediante un pndulo o una pequea hlice con una
pequea pieza metlica en su interior, sujetos a la tapa. Estos frascos se
posicionan en una placa agitadora que posee un imn que gira a una velocidad
definida, variable, y que permite as una agitacin suave y homognea del cultivo,
tanto vertical como horizontalmente, minimizando las fuerzas de corte.
Biorreactores: En general, los biorreactores se clasifican en dos grandes
categoras (63): los biorreactores para clulas en suspensin (tipo tanque agitado
y tipo airlift) y los biorreactores para clulas inmovilizadas (microcarriers, de fibra
hueca, de membrana, de entrampamiento en perlas de agarosa o alginato, de
espuma de poliuretano, de matriz cermica, etc.).
Modos de cultivo
La viabilidad de un proceso de produccin a escala industrial mediante el
cultivo de clulas animales en biorreactores exige que se cumplan una serie de
requisitos operacionales. Estos procesos deben, idealmente:
Ser altamente eficientes desde el punto de vista econmico.
Presentar operabilidad, simplicidad y confiabilidad ptimas.
Permitir fcilmente un aumento de escala de produccin.
Demandar un nmero reducido de unidades operacionales.
Garantizar la obtencin de un producto de alta calidad.
Una variable muy importante que debe ser considerada en el momento de
definir un proceso productivo es el modo de operacin del biorreactor; es decir, la
produccin en cultivos por lote (cultivos batch), por lote alimentado (fed-batch),
cultivos continuos tradicionales (tipo quimiostato), o cultivos continuos con
retencin de clulas (con perfusin de medio de cultivo fresco). La eleccin
depende de distintas variables, especialmente econmicas (66). Las principales
caractersticas de cada sistema se describen a continuacin (63).
Anteproyecto

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Modo de cultivo por lote (batch)

En estos sistemas se agrega todo el medio de cultivo en el biorreactor al

comienzo
del proceso, para luego inocular las clulas y dejar transcurrir el crecimiento sin
que se adicionen medio fresco o suplementos al cultivo, y sin que se retire
suspensin celular en momento alguno. nicamente se permite el intercambio
gaseoso con el exterior. El volumen del cultivo se mantiene constante a lo largo de
todo el proceso.

Modo de cultivo por lote alimentado (fed-batch)

Este sistema es similar al anterior, ya que se coloca el medio de cultivo

en el biorreactor y se inoculan las clulas, sin que se retire suspensin celular

durante el proceso. La diferencia consiste en que durante el cultivo se va
agregando medio de cultivo fresco o nutrientes especficos, en forma continua o
intermitente a lo largo del proceso. Los nutrientes y el densidad de oxgeno (DO)
pueden ser ajustados de manera de optimizar el crecimiento. Comparado con el
sistema por lote, el modo por lote alimentado permite extender la vida del cultivo y
obtener concentraciones celulares ms altas al impedir la deplecin de nutrientes.
Sin embargo, la concentracin y la calidad del producto resultan variables, ya que
el incremento de su acumulacin debido a la mayor densidad celular resulta
contrarrestado por el efecto de la dilucin realizada al agregar medio de cultivo
fresco. (67)

Modo de cultivo continuo en quimiostato

En un sistema de cultivo continuo en quimiostato se agrega medio de

cultivo fresco en forma continua al biorreactor, a la vez que se retira el mismo

volumen, con el mismo flujo, de suspensin celular, permitiendo mantener as el
volumen del cultivo constante. La velocidad de alimentacin del medio fresco est
determinada por la velocidad de crecimiento de las clulas, por lo que la cantidad
Anteproyecto

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de clulas producidas por unidad de tiempo es igual a la cantidad de clulas que

sale del reactor, por unidad de tiempo, lo que hace que el sistema se mantenga en
un estado estacionario. (67)

Modo de cultivo continuo con perfusin

En estos procesos se agrega medio de cultivo fresco en forma continua, en

tanto se retira la misma cantidad de sobrenadante de cultivo libre de clulas del

interior del reactor. De esta manera todas las clulas permanecen en el interior del
biorreactor, siendo alimentadas con nutrientes y removindose los productos del
catabolismo en forma continua. Estos sistemas permiten obtener densidades
celulares muy altas (0,1-1 x 108 cl-1ml-1) as como una productividad
incrementada del producto de inters, durante un perodo de tiempo prolongado
(de varios meses, inclusive), si pueden mantenerse condiciones ambientales
apropiadas, ya que las clulas continan creciendo mientras se encuentren en el
reactor. Los puntos crticos de este sistema radican en la necesidad de mantener
un control ptimo de las condiciones de cultivo y de disponer de un sistema
adecuado de retencin de clulas (generalmente de alto costo), lo que los
convierte en sistemas ms complejos que los anteriores. (67)

1.1 Objetivo General

Contar con una Planta Nacional para la Produccin de Reactivos
Hemoclasificadores.

1.2 Objetivos Especficos

-

Descongelar, cultivar y expandir en Sistemas Roller, las diferentes clonas

productoras de anticuerpos monoclonales dirigidas contra los antgenos

Anteproyecto

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eritrocitarios, indispensables para una clasificacin sangunea que permita una

transfusin segura desde el punto de vista de su compatibilidad.

Producir y envasar los reactivos hemoclasificadores siguientes:

1. Anti-A
2. Anti-B
3. Anti-D
4. Anti-C3b
5. Anti-C3d
6. Anti-IgG (policlonal)
7. Reactivo de Coombs

1.3 Filosofa de la empresa

1.3.1

Misin
La Planta de Produccin de Reactivos Hemoclasificadores tiene como

finalidad el desarrollo de reactivos hemoclasificadores de alta calidad, que

permitan una correcta tipificacin sangunea, mediante la aplicacin de la
tecnologa de produccin de anticuerpos monoclonales (AcMo), lo que
conllevara a reducir los costos asociados a este rubro en Venezuela, cuyo
consumo actual depende de la importacin.
1.3.2 Visin
Constituirnos en una Plata Productora de Reactivos Hemoclasificadores
de excelencia dentro del pas, capaces de competir con los producidos por las
empresas transnacionales. Distribuir a nivel nacional estos reactivos para su
uso en los bancos de sangres adscritos al Ministerio del Poder Popular para la
Salud y a futuro para su comercializacin dentro la red de Bancos Nacionales
privados.
Anteproyecto

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1.3.3 Estructura organizativa

Desde el punto de vista

organizativo

la Planta Productora se

estructurar de la siguiente manera: Un Director o Jefe de Departamento y

cinco reas subordinadas directamente a l.

LICENCIADO(A)
EN
LICENCIADO(A)
EN
FARMACIA
FARMACIA
LICENCIADO(A)
EN
LICENCIADO(A)
EN
BIOANALISIS
BIOANALISIS
Produccin,
Produccin,
congelacin,
congelacin,
descongelacin
y y
descongelacin
expansin
de
clones
expansin de clones
productores
productoresdede
anticuerpos
anticuerpos
monoclonales.
monoclonales.

Encargado
dede
lala
Encargado
produccin
produccin
AUXILIAR
DE
AUXILIAR
DE
LABORATORIO
LABORATORIO

JEFE
JEFE
DEPARTAMENTO
DEPARTAMENTO

Soporte
tcnico
enen
Soporte
tcnico
los
laboratorios
los
laboratorios

Bilogo
Jefe
Bilogo
Jefe
LICENCIADO(A)
EN
LICENCIADO(A)
EN
ENFERMERA
ENFERMERA

Supervisin,
Supervisin,
coordinacin
y toma
coordinacin
y toma
dede
decisiones.
decisiones.

ESP.
ESP.EN
EN
HEMOTERAPIA
HEMOTERAPIA
Pruebas
dede
campo
yy
Pruebas
campo
control
dede
calidad
control
calidad

CRISTALERA
CRISTALERA
Entrenada
enen
Entrenada
materiales
materiales
especiales
especiales

SECRETARIA
SECRETARIA
Asuntos
Generales
Asuntos
Generales

Anteproyecto

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Captulo II
Estudio de la Necesidad
2.1 Anlisis de patrones de necesidad actuales

2.2 Determinacin de las necesidades en reactivos, materiales y

equipos para la Produccin de reactivos Hemoclasificadores.

Anteproyecto

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Anteproyecto

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CUADRO RESUMEN DEL CONSUMO ANUAL

Anteproyecto

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Nro. DESCRIPCION

Presentacin

Concentracin

Total Fcos
al Ao

% a Producir
en la Planta
(Aproximado)

1
2
3
4
5
6
7

Total

xx.xxx.xxx

xx.xxx.xxx

2.3 Otros Ofertantes

2.4 Precios manejados por los competidores
Lista de Precios en Venezuela (con entrega en cada estado).
Nro. DESCRIPCION ( D.C.I)

PRESENTACION

CONCENTRACION

PRECIO (BsF)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Anteproyecto

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2.5 Porcentaje de la demanda que atender la empresa

Dentro de los principales consumidores de estas producciones, tenemos:

2.6 Cadena de comercializacin y distribucin

2.6.1 De los competidores
2.6.2 De la empresa productora de Fluidoterpicos
2.6.3 Principales distribuidores de la empresa

Captulo III
Estudio de la Cadena
3.1 Diagrama de la cadena
3.2 Cadena dinamizada para el sector en estudio
3.3 Identificacin de insumos
3.3.1 Insumos nacionales
3.3.2 Insumos importados

Anteproyecto

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Captulo IV
Definicin, Caracterizacin de Productos y Capacidad a Instalar

Aqu se debe colocar un cuadro: definiendo las lneas de

manufactura, con los productos que all se realizaran, principios
activos, presentaciones, cantidades, derivado del cuadro de
necesidades presentado en el punto 2.2

A continuacin, se describen los procedimientos a seguir en los diferentes

laboratorios de la Planta Productora de reactivos hemoclasificadores, para lograr
la produccin a gran escala de los mismos.

CLONACIN
Objetivo: Clonacin de Hibridomas con el fin de asegurar la monoclonalidad del
clon productor de anticuerpo.
Responsables: Coordinador (Bilogo Jefe) y Licenciado en Bioanlisis.
Definiciones, Abreviaciones y/o Traducciones: Medio de cultivo (MC)
Materiales: Placas de 96 pozos fondo plano (GREINER)
Reactivos: sobrenadante de cultivo de la lnea celular J744.2 al 10%,
Equipo: Campana de flujo laminar vertical. Laminaire
Procedimiento:
Anteproyecto

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1- Las clulas contenidas en los pozos con seal positiva, se expanden y se

clonan en cuatro ocasiones con el fin de asegurar la monoclonalidad del
clon que se seleccione.
2- El procedimiento que se emplea es el de dilucin lmite.
3- El MC que se utiliza en este procedimiento adems de contener los
componentes presentes en el medio de expansin, se enriquece con el
sobrenadante de cultivo de la lnea celular J744.2 al 10% (lnea tumoral
macrofgica de ratn, productora de quimiosinas que favorecen el
crecimiento celular).
4- Las clulas contenidas en el medio de clonacin se cuentan y luego se
realizan

diluciones en tubos de 15 ml con tapa (CELLSTAR) hasta

alcanzar concentraciones de 10, 5 y 2.5 clulas/ml de forma tal que al

sembrar 100 ul de estas suspensiones en los pozos de una placa de 96
pozos (GREINER) la mayor probabilidad sea la de estar depositando en
cada pozo 1, 0,5 y 0,25 clulas respectivamente.
5- En cada clonacin el clon escogido debe pertenecer a la dilucin ms baja
sembrada (0,25 clulas /pozo). (68-69)

CONGELACIN CELULAR
Objetivo: Congelar Clulas en Nitrgeno Lquido (-163C) con el fin de almacenar
las clonas por tiempo indefinido.
Responsables: Coordinador (Bilogo Jefe),

Licenciado en Bioanlisis y

Licenciado en Farmacia
Definiciones, Abreviaciones y/o Traducciones: Medio de cultivo (MC)
Materiales:

Centrfuga refrigerada (Beckman S/GYB95605)

Equipo: Campana de flujo laminar vertical. Laminaire

Reactivos: MC RPMI 1640 1X, medio de congelacin (30% de RPMI 1640, 50%
de SFB y 20% DMSO (Sigma D-2650).
Anteproyecto

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Procedimiento:
1- Las clulas a congelar se ajustan a una concentracin de entre 0.5-1 x 107
clulas/ml en MC RPMI 1640 1X.
2- Se centrifugan a 200g por 10 min, se decanta el sobrenadante y se aade
gota a gota igual volumen de medio de congelacin (30% de RPMI 1640,
50% de SFB y 20% DMSO (Sigma D-2650).
3- En cada vial de congelacin (Sigma V-2881) se dispensan bajo estrictas
condiciones de esterilidad entre 0,3 y 0,5 ml de la suspensin.
4- Luego se colocan los viales en un el congelador de entre 75 a -80 o C pou
18 a 48 horas y pasado este tiempo se llevan al tanque de Nitrgeno
lquido a 163 C. (70)

DESCONGELACIN CELULAR
Objetivo: Descongelar clonas, productoras de anticuerpos monoclonales, con el
fin de expandir para sembrar en frascos Roller.
Responsables: Coordinador (Bilogo Jefe), Licenciado en Bioanlisis, y
Licenciado en Farmacia.
Definiciones, Abreviaciones y/o Traducciones: Medio de cultivo (MC)
Materiales:

bao

de

Mara

(a

37C),

Centrfuga

refrigerada

(Beckman

S/GYB95605)
Equipo: Campana de flujo laminar vertical. Laminaire
Reactivos: MC RPMI 1640 1 X o MC libre de suero segn el caso o
procedimiento.

Procedimiento:
Anteproyecto

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1- La descongelacin se realiza de forma rpida, los viales se trasladan del N

lquido a un bao de Mara (a 37C).
2- En un periodo de tiempo no mayor de 20 segundos, donde se agitan
suavemente para favorecer la descongelacin.
3- Una vez alcanzada la descongelacin total las clulas se diluyen en MC
RPMI 1640 1 X o MC libre de suero, a razn de 10 ml de MC por cada vial
descongelado. (71)

PRODUCCIN DE LOS REACTIVOS HEMOCLASIFICADORES A GRAN

ESCALA, A PARTIR DE CLONAS DE ANTICUERPOS MONOCLONALES.

Objetivo: Producir reactivos hemoclasificadores a gran escala, a partir de clonas

de anticuerpos monoclonales.
Responsables: Coordinador (Bilogo Jefe), Licenciado en Bioanlisis, y
Licenciado en Farmacia.
Materiales: Frascos Roller de Poliestireno (Easy Grip Vent, Corning CellBIND
Surface)
Equipo: Unidad de rodillos (The Stovall Low Profile Roller, Incubadora de 37C y
5% de CO2 (NAPCO)
Reactivos: Medio de cultivo libre de suero (EX-CELL 610-HSF Medio Libre de
Suero
Procedimiento:
El sistema de cultivo a utilizar, ser el de Lote Alimentado con reposicin
celular. Las clulas se sembrarn en Frascos Roller de Poliestireno (Easy Grip
Vent, Corning CellBIND Surface) con tapas con membrana de intercambio
gaseoso, a una concentracin de 3 x 10 5 celulas/ml en 250 ml de medio de cultivo
Anteproyecto

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libre de suero (EX-CELL 610-HSF Medio Libre de Suero para Clulas de

Hibridoma con L- Glutamina, con Bicarbonato de sodio) acostumbradas a vivir en
este medio. El cultivo se realizar a 37C a 4 r.p.m. en una unidad de rodillos ( The
Stovall Low Profile Roller), a 95% de O2 y 5% de CO2 y se realizarn
sustituciones diarias o intermitentes, del 40% del medio metabolizado por medio
fresco con reposicin celular. Hemos elegido este sistema debido a que es el que
mejores ventajas econmicas nos brinda el hecho de poder extender el cultivo en
el tiempo, nos ahorrara insumos y dado que los ttulos en la produccin de
anticuerpos a partir de las clonas que poseemos son altos, la sustitucin de medio
de cultivo y la consecuente dilucin del producto final no sera un inconveniente.
No obstante ser necesario realizar un estudio previo del comportamiento de cada
una de las clonas de anticuerpos monoclonales especficos contra los diferentes
grupos sanguneos en Frascos Roller a gran escala utilizando el mtodo de lote
alimentado ya que no tenemos estudios previos de este procedimiento en nuestro
laboratorio. (67, 72-73)
.
NOTA: Todos los procedimientos descritos, sern realizados bajo condiciones
estrictas de esterilidad en Campana de flujo Laminar Vertical, guantes y tapaboca.
CONTROL DE CALIDAD
Para cada lote producido de cada anticuerpo monoclonal se realizar, con todo el
rigor requerido, el correspondiente Control de Calidad.

Evaluacin inmunohematolgica (74)

Objetivo: Evaluar cada lote producido en la Planta.
Responsables: Coordinador (Bilogo Jefe), Especialista en Hemoterapia y
Licenciado en bioanlisis.
Definiciones, Abreviaciones y/o Traducciones: Sobrenadante de cultivo (SNC)
Anteproyecto

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Materiales: Centrfuga de 12 posiciones para tubo de 75x25mm

Desarrollo del Procedimiento:

Se realizara la evaluacin tanto en el SNC como en el producto de las cosechas
obtenidas en los Frascos Roller.
1- Especificidad: Con relacin a los AcMo anti-B se comprobar la
especificidad haciendo reaccionar el sobrenadante de cultivo una
suspensin de glbulos B y al menos tres de A1B, as como con glbulos A
y O.
1.1 De forma similar se proceder con los AcMo anti-A en este caso se
utilizaran glbulos A1 y A2B y como control negativo se usarn glbulos B y O.
1.2 En el caso de los AcMo anti-D, para su evaluacin se utilizar un panel de
clulas comerciales (Resolve RA 445 Ortho R) que incluye glbulos Ror, R 1R1,
R2R2, rr, rr, rr, as como con glbulos A1 y B, D-negativos con el fin de evaluar
la presencia de anticuerpos contaminantes.
1.3 En todas las determinaciones se utilizan eritrocitos de menos de 7 das de
haber sido extrados y se lavarn al menos 2 veces con SSF al 0.9% y se
ajustarn a una concentracin del 5%. Todas las clulas que se utilicen deben
presentar la prueba de antiglobulina humana negativa. Se deben incluir clulas
de fenotipos raros: Variantes D-dbiles y D-parciales.
2- Potencia: Se realizan

diluciones dobles del producto de las cosechas

obtenidas en los frascos Roller.

2.1 Se utiliza como diluyente solucin salina isotnica con 1-2% de albmina
bovina.
2.2 Se realiza en tubos de vidrio de 12 x 75 mm. El volumen dispensado en
cada tubo es de 100 ul.

Anteproyecto

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2.3 Se incluye un tubo que slo contiene 100 ul de la solucin diluyente como
control negativo. La lectura se realiza hasta llegar al tubo que resulte
negativo.
2.4 Dicho procedimiento se realizar de la misma manera con los reactivos
comerciales que se encuentre en uso en ese momento en el servicio de
Inmunohematologa del Banco Metropolitano de Sangre (B.M.S.) del D.C.
2.5 Se utilizan eritrocitos frescos previamente evaluados con antiglobulina
humana, para asegurarse no existen fracciones de complemento o
Inmunoglobulinas fijadas a sus membranas y se lavan previamente con
SSF al 0,9%
2.6 A continuacin se prepara una suspensin entre el 3-5% en la misma
solucin con albmina bovina al 2%.
2.7 Los glbulos a utilizar en el caso de los anticuerpos anti-A deben cumplir
con el requisito de tener un fenotipo, A1, A2 y A2B.
2.8 Tambin deben utilizarse glbulos A provenientes de recin nacidos. Con
relacin a los anticuerpos anti-B, se utilizarn glbulos B y A 1B. En el caso
de los anticuerpos anti-D se requieren glbulos cuyo fenotipo sea Dce
(Ror).
Las lecturas de titulacin se realizarn a centrifugacin inmediata (3400 rpm X
15 segundos, en centrfuga de 12 posiciones para tubo de 75x25mm) y luego
de incubarse por 15 minutos a TA y a 37C.

La potencia ser el recproco de la mayor dilucin del anticuerpo que se

evala, en la que la reaccin resulte con positividad de 1+. El resultado debe
mostrar que el siguiente tubo al de lectura final resulte negativo al igual que el
tubo que slo contena diluyente.
2.9 La lectura de la aglutinacin producida se realiza de la siguiente manera:
2.9.1

4+: Botn nico en fondo claro

2.9.2

3+: Botones grandes en fondo claro

Anteproyecto

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2.9.3

2+: Botones pequeos en fondo turbio

2.9.4

1+: Botones muy pequeos en fondo turbio

2.10

A estas reacciones se les da un valor score: 4+ =12, 3+ =10, 2+ =8,

1+ =5

3 Avidez: Se evala en lminas portaobjetos utilizando el Sobrenadante de

cultivo (SNC) no diluido de los anticuerpos, anti-A y anti-B, con glbulos A 1 y
A2B y anti-B glbulos B1 y A1B, respectivamente.
3.1 Con relacin al anti-D se realizar en el SNC se emplearn glbulos R 1r.
3.2 Las suspensiones celulares se utilizan al 50% y se mezclan 50 ul de esta
con

50 ul del SNC, la lectura se realiza en un visor de aglutinacin,

manteniendo la preparacin en movimiento constante.

3.3 La avidez ser cronometrada como menores y mayores a 1 mm desde el
momento en que comienza la aglutinacin hasta la estabilizacin de los
aglutinados.

4- Aglutinacin espontnea: Con relacin al anti-D, se utilizan eritrocitos O rr,

fuertemente sensibilizados con reactivo anti-c, los cuales aglutinan

en

medio con alta concentracin de protena.

5- Evaluacin del efecto prozona: En el caso de los anticuerpos anti-D, se

emplean eritrocitos de tres individuos diferentes con fenotipo R 1r, cada uno
se incuba a TA por 15, 30, 60 minutos respectivamente.

5.1 En cada tubo se aade una gota del SNC y una gota de la suspensin de
los eritrocitos entre el 3-5% en solucin salina, se centrifuga a 3500 rpm
durante 15 segundos y se lee por aglutinacin.

Anteproyecto

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5.2 Cuando el grado de aglutinacin permanece igual o se incrementa en los

diferentes tiempos de incubacin, no existe fenmeno de prozona. Si decrece
con la incubacin si hay prozona. Debe obtenerse al menos 2+ de aglutinacin
en todos los tiempos

Determinacin Del Ttulo De Anti-IgG Humana En Un Antisuero Policlonal De

Conejo (74)
Objetivo: Determinacin del titulo de Anti-IgG humana en un antisuero policlonal
de conejo, con el fin de posteriormente preparar un reactivo de Coombs
Alcance: Obtencin de clulas sensibilizadas con IgG, Titulacin del antisuero
Responsables:

Coordinador del

laboratorio, Licenciado

en Bioanlisis y

Especialista en hemoterapia.
Desarrollo del Procedimiento
Reactivos: SSF al 0,85 %, pipeta Pasteur
Actividades:
1- Sensibilizacin de glbulos rojos humanos O positivo con IgG humana antiD.
1.1 previamente realizar el titulo de anti-D des suero que se va a utilizar.
1.2 Utilizar el suero en la dilucin en la que se obtuvo una cruz al realizar el
titulo del mismo. ( esta dilucin no deber ser meno a 1:16 ni mayor a 1:64)
1.3 Realizar una suspensin al 5 % de glbulos rojos O positivo ( R 1 r ).
1.4 Colocar a partes iguales el suero diluido y la suspensin al 5 % de Glbulos
rojos.
1.5 Incubar a 37C durante 30 min.
1.6 Lavar los glbulos rojos 4 veces con SSF al 0,85 %, centrifugar a 3400
RPM durante 3 min.
1.7 Preparar una suspensin de glbulos rojos al 5 %.
Anteproyecto

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2- Titilacin de antisuero de conejo anti-IgG.

2.1 Marcar una serie de tubos como sigue: 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32...... 1:1024.
2.2 Aadir 4 gotas de solucin salina a cada tubo.
2.3 Colocar 4 gotas del suero a titular al primer tubo solamente.
2.4 Mezclar bien lo realizado en el punto 2.3 y trasegar con pipeta Pasteur 4
gotas del primer tubo al segundo. Mezclar bien y continuar trasegando del
segundo al tercero. Del tercero al cuarto y as sucesivamente.
2.5 colocar una gota de suspensin de GR al 5 % previamente sensibilizados a
cada tubo.
2.6 Centrifugar a 3400 RPM durante 15 segundos. Se establecer como titulo
la dilucin anterior a aquella donde no se observe aglutinacin a simple vista.

Determinacin del ttulo de anti-c3d humana (74)

Propsito: Determinacin del titulo de Anti-C3d, con el fin de posteriormente
preparar un reactivo de Coombs.
Alcance: Obtencin de clulas sensibilizadas con IgG, Titulacin del antisuero
Responsables:

Coordinador del

laboratorio, Licenciado

en Bioanlisis y

Especialista en hemoterapia.

Desarrollo del Procedimiento

Materiales: SSF al 0,85 %
Reactivos: SSF al 0,85 %, pipeta Pasteur
Actividades:
Anteproyecto

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1- Sensibilizacin de glbulos rojos humanos O positivo ( R 1 r ), para ello es

necesario realizar una activacin in vivo del complemento a traves de la via
alterna y llevarlo hasta C3d.
1.1 Procedimiento para la obtencin de glbulos rojos sensibilizados con C3b.
1.1.1 Para este procedimiento es necesario la solucin J y la solucin H.
1.1.2 Colocar 19.8 ml de solucin J a 0C en bao de hielo y

mezclar

suavemente con una agitador magntico.

1.1.3 Agregar 0.5 ml de glbulos rojos lavados y empaquetados.
1.1.4 Agregar 0.5 ml de plasma fresco del mismo donante diluido 1:50 con
solucin salina 0.85 %.
1.1.5 Agregar 1 ml de solucin H.
1.1.6 Incubar a una temperatura constante de 0C agitando suavemente
durante 30 min.
1.1.7 Lavar los glbulos rojos 4 veces con SSF al 0,85 %, centrifugar a 3400
RPM durante 5 min.
1.1.8 Preparar una suspensin de glbulos rojos al 5 %.
1.2 Procedimiento para la obtencin de glbulos rojos sensibilizados con C3d.
1.2.1 Para este procedimiento es necesario la solucin S.
1.2.2 Colocar 0.5 ml de glbulos rojos sensibilizados con C3b en un tubo.
1.2.3 Colocar 1 ml de la solucin S.
1.2.4 Mezclar e incubar a 37C durante 30 min. Mezclndolo ocasionalmente
con un agitador magntico.
1.2.5 Lavar los glbulos rojos 6 veces con SSF al 0,85 %, centrifugar a 3400
RPM durante 5 min.
1.2.6 Preparar una suspensin de glbulos rojos al 5 %.
1.2.7 Guardar los glbulos rojos a 4C.

2- Titulacin del antisuero Anti- C3d

Anteproyecto

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2.1 Marcar una serie de tubos como sigue: 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32...... 1:1024.
2.2 Aadir 4 gotas de solucin salina a cada tubo.
2.3 Colocar 4 gotas del suero a titular al primer tubo solamente.
2.4 Mezclar bien lo realizado en el punto 2.3 y trasegar con pipeta Pasteur 4
gotas del primer tubo al segundo. Mezclar bien y continuar trasegando del
segundo al tercero. Del tercero al cuarto y as sucesivamente.
2.5 colocar una gota de suspensin de GR al 5 % previamente sensibilizados a
cada tubo.
2.6 Centrifugar a 3400 RPM durante 15 segundos. Se establecer como titulo
la dilucin anterior a aquella donde no se observe aglutinacin a simple vista.

Metodologa para determinar la dilucin ptima a la cual se deben preparar

los reactivos monoclonales anti-A, anti-B y reactivo de Coombs (anti-Cd3 y
anti-IgG humana) as como el tipo de colorante y cantidad que se debe
utilizar en cada uno de ellos. (74)
Objetivo: Determinacin de la dilucin ptima a la cual se deben preparar los
reactivos monoclonales anti-A, anti-B y reactivo de Coombs, as como colorante
para cada uno de ellos
Alcance:

Preparacin

de

reactivos

monoclonales

necesarios

para

la

hemoclasificacin.
Responsables:

Coordinador del

laboratorio, Licenciado

en Bioanlisis y

Especialista en hemoterapia.
Definiciones, Abreviaciones y/o Traducciones:
Desarrollo del Procedimiento
Materiales: SSF al 0,85 %
Anteproyecto

Pgina 39 de 12

Actividades:
1- Una vez obtenidas las ascitis producidas en ratones balb/c, como se
expuso anteriormente, correspondientes a los clonos productores de antiA, anti-B y anti-C3d. Se procede con cada una de ellas de igual forma.
2- Se realizan diluciones dobles de las mismas en la solucin diluyente para
reactivos monoclonales y se hacen reaccionar v/v con los glbulos lavados
correspondientes en una dilucin del 5% en SSF.
3- Como dilucin ptima se toma aquella dilucin por encima de la cual se
obtienen cuatro diluciones con resultados = 4+

4- Colorantes a utilizar:
4.1Reactivo :
4.2Anti-A: Azul brillante cresil 0,01 g C. S. P. 1000 ml
4.3 Anti-B: Acriflvina 0.015 C. S. P. 1000 ml
4.4 Reactivo de Coombs: Naphtol green B 0,15 g C. S. P. 1000ml

Mtodo para estimar el tiempo de expiracin o tiempo til de los reactivos

monoclonales (74)
Objetivo: Estimacin del tiempo de expiracin de los reactivos monoclonales.
Alcance: Preparacin de reactivos monoclonales..
Responsables:

Coordinador

(Bilogo

Jefe),

Licenciado

en

Bioanlisis,

Especialista en hemoterapia y Licenciado en Farmacia

Desarrollo del Procedimiento
Actividades:

Anteproyecto

Pgina 40 de 12

1- El tiempo de expiracin de los reactivos monoclonales preparados en

nuestro laboratorio (Anti-A, anti B, anti C3d y reactivo de Coombs) se ha
estimado de la siguiente manera:

1.1 Una vez preparado un lote de cualquiera de los reactivos monoclonales

antes mencionado se separan cuatro (4) frascos del mismo.
1.2 Tres de esos frascos se almacenan a Temp. de entre 2-8C, para realizar
los correspondientes estudios de control de calidad a lo largo del tiempo til
del reactivo.
1.3 El cuarto frasco se incuba a 37C y se realizan determinaciones diarias
mediante la prueba de aglutinacin en tubos con glbulos portadores del
antgeno especfico hacia el cual esta dirigido el AcMo contenido en el
reactivo.
1.4 Cada resultado igual a 4+ se corresponder con un mes de vida til del
reactivo en prueba.
1.5 Una vez que el resultado es inferior se toma como resultado final el anterior
al ltimo de 4+.

Informacin contenida en la etiqueta

Las etiquetas en cada envase deben contener la siguiente informacin:

Nombre del producto

Nombre y domicilio del fabricante y distribuidor.

Nmero de lote

Nmero de registro

Fecha de expiracin

Temperatura de almacenaje

Volumen

Logo

Anteproyecto

Pgina 41 de 12

Medidas: 4cm x 6.5cm

Capitulo V

Ingeniera
Se prev la ejecucin de las actividades de Construccin y Montaje en un perodo
de xxxxxxxxx (xx) meses y existe la intencin poltica de que stas concluyan en
el x trimestre del ao 201n a partir del cual se iniciara la puesta en marcha
tecnolgica y de ingeniera de las instalaciones de acuerdo al cronograma anexo:

Anexar Cronograma

Captulo VI
Ubicacin de la planta.
6.1 Requerimientos tcnicos para la localizacin geogrfica
Factores a tomar en consideracin en la escogencia y localizacin de la fbrica de
Fluidoterpicos.

Factores Primarios:
1. Proveedores de materia prima
a) Proximidad y disponibilidad de proveedores.
2. Mercados.
a) Proveedores nacionales e Internacionales y su ubicacin.
b) Requisitos de stock de insumos para su almacenamiento.
c) Competitividad en el tiempo.
3. Energa (electricidad, gas)
Anteproyecto

Pgina 42 de 12

a) Disponibilidad de potencia elctrica y de varios tipos de combustibles.

b) Costo del corte de energa.
c) Reserva para futuras expansiones.
4. Agua
a) Cualitativa (caracterstica fsico-qumica y microbiolgica)
b) Cuantitativo (minerales entre otros)
c) Costo de la ausencia de agua por corte
Factores Especficos
1.- Transporte
a) Disponibilidad de varios servicios (terrestre, areo, martimo)
2.- Geogrficos
a) Costo de la inversin requerida para la construccin del rea.
b) Costo de los terrenos
c) Espacio para futura expansin
3.- Laborales
a) Disponibilidad de mano de obra calificada y no calificada
4.- Comunitarios
a) Proximidad de hospitales y zonas medicas
5.- Inundacin y Control de Incendios
a) Peligro de incendio en rea circunvecinas
b) Verificar los controles histricos de inundaciones
6.- Ambiente
a) Tratamiento de residuo y/o facilidades de embaularlo
7.- En complemento de las definiciones de variables socio-econmicas y de los
requisitos tcnicos al tener en consideracin en el momento de la localizacin de
la fbrica se propone que las claves de las decisiones deben ser racional y
ponderadas en cada una de las variables.
Anteproyecto

Pgina 43 de 12

Variables Socio-econmicas:
Variable

Racional

Ponderados

Accesibilidad / Distancia a la

Las largas distancias y las dificultades de

puertas de entrada al Pas

transporte pudiesen implicar mayor costo de

produccin y necesidades de stock
(existencia). Plazos de entrega ms largos.

Accesibilidad / Distancia a los

Las distancias largas conjuntamente con la

principales centros de

dificultad de transporte pueden implicar

consumo

mayor costo de distribucin

Disponibilidad de mano de

Deber existir disponibilidad de mano de

obra no calificada

obra con las caractersticas definidas y la

distancia accesibilidad al transporte
deberan asegurar un tiempo no superior a
30 min de la localidad

Disponibilidad de mano de

Deber existir disponibilidad de mano de

obra Calificada

obra con las caractersticas definidas y la

accesibilidad al transporte deberan
asegurar un tiempo no superior a 30 min de
la localidad

Requisitos Tcnicos
REQUISITO

RACIONAL

PONDERADO

Agua

xxxx

Xxxxx

Energa

Xxxx

Xxx

Agua

xxxxxxxx

xxxx

Anteproyecto

Pgina 44 de 12

VALORACIN ECONMICA DEL PROYECTO

Cuadro con el Plan de inversin, en fases, totalizado y separado
por: terrenos, estructura, equipos para proceso, equipo de
soporte, equipo de produccin de energa, proyecto de
construccin, diseo conceptual, ingeniera bsica, ingeniera de
detalle, procura,
sistemas de informacin y software,
reclutamiento capacitacin y entrenamiento, supervisin
recepcin y puesta en marcha de los equipos, acompaamiento
en el arranque, y otros que tengan a bien sealar
Propuesta de transferencia tecnolgica.
6.5 Normas, permisologa y estndares de calidad:
Para llevar a cabo cada uno de los procesos en las diferentes plantas o reas se
deben regir por las siguientes normativas:
Buenas Prcticas de Manufactura, Gaceta Oficial Nro 38.009
Laboratory Practice GDL ( Directive 2.004/9/EC and Directive 2.004 /10/
EC )
Decreto- Ley N 176/2006 del 30 de Agosto Estatuto do Medicamento
ISO 9001 Sistema Gestin de la Calidad
ISO 14001 Sistema de Gestin Ambiental
OHSAS 18001 Sistema de Gestin de Seguridad y Seguridad en el
trabajo.
Informe 32 (Validacin de Procesos en General)
Informe 37 (Aseguramiento de la Calidad y Calificacin de Personal y
Proveedores)
Informe 39 (Sistemas de Agua)
Informe 40 (Calificacin de Equipos)

Anteproyecto

Pgina 45 de 12

 Informe 43 (Estabilidad del Producto)

Informe 44 (BPL) con Anexo de Estriles
Normas COVENIN
Normas ISO 9001, 17000, 17025.
Guas de Verificacin de BPM de la OMS.
Formatos de Requisitos para Registro Sanitario de Laboratorios Fabricantes
del MPPS.

Referencias
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Venezuela. Gaceta Oficial N. 32.860 de fecha 30 / 12 / 99.
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Comit de Expertos de la OMS Especificaciones para las

Preparaciones Farmacuticas, Ginebra, Ao 1999; Informe N 35.
2.

Comit de Expertos de la OMS para el Aseguramiento de la

calidad y calificacin del personal y proveedores, Informe N 37.
3.

Decreto sobre Normas para el Registro, Elaboracin,

Importacin, Exportacin, Almacenamiento y Expendio de
Productos Cosmticos. Decreto N. 1.477 del 18/ 02/ 87. Gaceta
Oficial. N 33.669 del 27 / 02 / 87
4.

Empresas de Produccin Social: Instrumento para el

Socialismo del Siglo XXI. Haiman El Troudi y Juan Carlos Monedero.
5.

Encuesta Nacional de Medicamentos. Ministerio del Poder

Popular para la Salud. Ao 2010.
6.

Anteproyecto

Pgina 46 de 12

Gua de Verificacin de Buenas Prcticas de Manufactura de

la OMS.
7.

Gaceta Oficial de la Repblica Bolivariana de Venezuela N

333.725 de fecha 23 de junio del 2004 Normas de Buenas Prcticas
de Distribucin para la Industria Farmacutica.
8.

Gaceta Oficial de la Repblica Bolivariana de Venezuela N

38.009 de fecha 26 de agosto del 2004 Normas de Buenas
Prcticas de Fabricacin para la Industria Farmacutica.
9.

Gaceta Oficial de la Repblica Bolivariana de Venezuela N

34.212 de fecha 06 de octubre del 2005 Regulacin de
Medicamentos.
10.

Informe 32 Organizacin Mundial de la Salud, Ginebra, Ao

1992. Comit de Expertos de la OMS en especificaciones para las
preparaciones farmacuticas.
11.

Ley Orgnica de Salud. Gaceta Oficial N. 5.263 extr. de fecha

17/ 09 / 98; Titulo III. de los servicios para la salud. Captulo IV de la
Contralora Sanitaria. art. 32 y 33; Titulo VIII. del Rgimen Cautelar de
Salud. art. 65, 66 y 67.
12.

Ley de Medicamentos. Gaceta Oficial N. 37.006 del 03 / 08 /

00; Titulo IV. Establecimientos Farmacuticos. Captulos I, II, III. art.
desde el 47 al 65; Ttulo VIII. del Rgimen Sancionador. Captulo I. art.
74, 75 y 76.
13.

Ley de Ejercicio de Farmacia. Gaceta Oficial N. 16.551 del 07/

07 / 28.
14.

Anteproyecto

Pgina 47 de 12

Licitacin de mayo del 2010 sobre Medicamentos contenidos

en el Formulario Teraputico Nacional, Ministerio del Poder
Popular para la Salud. Ao 2010.
15.

Lista Bsica de Medicamentos Esenciales. Ministerio del

Poder Popular para la Salud. Ao 2007.
16.

Manual de Buenas Prcticas de Fabricacin para la Industria

Farmacutica. Repblica de Venezuela, Ministerio de Sanidad y
Asistencia Social, Divisin de Drogas y Cosmticos.
17.

Plan Estratgico de la Nacin 2007-2013, Primer Plan

Socialista: Simn Bolvar.
18.

Reglamento Vigente de la Ley de Ejercicio de la Farmacia;

Decreto N. 2.932 del 20/ 05/ 93. Gaceta Oficial N. 4.582 extr. del 21/
05/ 93 al 01/06/05.
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con especificidad anti B, para ser utilizado como reactivo hemoclasificador.
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Anteproyecto

Pgina 54 de 12