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Qu es?
Es un mtodo de laboratorio en el que se
utiliza una corriente elctrica controlada
con la finalidad de separar las protenas y
otras biomolculas segn su tamao y
carga elctrica a travs de una matriz
gelatinosa.
Fundamento de la tcnica
Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico,
experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta.
El movimiento se ve afectado por:
- La friccin con el solvente.
- La energa cintica de difusin.
Mayor temperatura = mayor movimiento = menor homogeneidad
Para reducir el movimiento aleatorio de las protenas se usa un gel:
Un polmero soluble de alto peso molecular que atrapa molculas de agua y forma un tamiz que
dificulta el movimiento.
Consecuentemente, la migracin ser ms lenta, pero el desorden se ver reducido tambin.
Fundamento de la tcnica
La carga de las protenas, por su naturaleza anfotrica, depende del pH del medio:
- Cuando en un campo elctrico el pH del medio es igual al punto isoelctrico (PI)
de la protena, no hay migracin.
- Para pH por debajo del PI, predominan las cargas positivas y las protenas migran
hacia el ctodo (polo negativo).
- Para pH superiores al PI, las protenas estn cargadas negativamente y migran hacia
nodo (polo positivo).
el
Procedimientos: bidimensional
Es una sucesin de 2 electroforesis distintas, o de un
mismo proceso bajo diferentes condiciones sobre una
misma muestra.
Primera dimensin:
Se separan los componentes de la muestra segn
tamao, carga o punto isoelctrico. Generalmente se
usa el isoelectroenfoque.
Segunda dimensin:
La misma muestra se somete a una prueba diferente o
con parmetro distinto del anterior. Puede ser por SDSPAGE.
La aparicin de una sola mancha indica una muestra
homognea.
Procedimientos: Isolectroenfoque
Se emplea parar separar molculas cargadas.
Debido a que una protena tiene grupos cargados de ambas polaridades, tiene un
punto isoelctrico (PI), donde su carga neta es cero.
- Se establece un gradiente de pH en el gel de poliacrilamida por adicin de
anfolitos.
- Las protenas se distribuyen a lo largo del gel de acuerdo con sus valores de PI.
Procedimientos: Isolectroenfoque
VENTAJAS:
- Un anfolito siempre se detiene en la
zona en la que el pH coincide con su
punto isoelctrico.
- Los resultados no estn sujetos a
variaciones debidas a las condiciones
experimentales.
- La muestra se puede colocar en
cualquier zona del medio de soporte.
Visualizacin
Se tien si no son estudios especficos.
De caso contrario primero deben fijarse
con anticuerpos y luego teirse
(inmunofijacin).
Para muestras procesadas con
poliacrilamida (depende del objetivo de
estudio):
Tincin con plata.
Tincin con Azul de Coomassie.
Tincin Blue Silver o
Coomassie G250.
Tincin fluorescente.
Desventajas
La electroforesis es una tcnica muy sensible por
su gran resolucin, pero fcilmente se ve afectada
por:
Aplicaciones
- Estructura y funcin de las protenas:
Con muestras de sangre y orina se
comparan los parmetros establecidos y se
detectan enfermedades.
Aplicaciones
Anlisis de antibiticos: No slo es posible
sintetizar nuevos antibiticos, sino que tambin
se puede analizar qu tipos de bacterias son
resistentes a los antibiticos.