O que PCR?

A tcnica PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reao em Cadeia da Polimerase)

consiste basicamente na amplificao in vitro de uma regio especfica de DNA
com intuito de aumentar o nmero de cpias deste, a fim de produzir material
suficiente para as diversas anlises. Ou seja, o mtodo utilizado para fazer
muitas cpias de uma determinada parte do DNA.
O processo de PCR ocorre em 3 etapas:
1.

Desnaturao em uma temperatura de 95C ocorre a separao da

dupla fita de DNA.

2.

Anelamento ou Hibridizao em uma temperatura de 60 a 64C

os primers se ligam/anelam s suas sequncias complementares de DNA (a
regio que se pretende amplificar) e servem como iniciadores para a enzima
polimerase.

3.

Extenso ou polimerizao com o ponto de partida j identificado, aos

72C, a taq polimeraseliga-se a fita sinalizada pelo primer, complementando-a, e
inicia a sequencia que ser replicada, formando novamente uma fita dupla de
DNA.
So realizados aproximadamente de 40 a 60 ciclos como este, promovendo a
amplificao de determinada regio que se pretende analisar, seja ela um loco
humano especfico ou material gentico de microorganismos.

O que qPCR ou PCR em Tempo Real?

A PCR em Tempo Real (Real Time Quantitative PCR) uma variao da tcnica
de PCR, a qual permite que a amplificao e deteco ocorram
simultaneamente. O resultado visualizado em Tempo Real durante a
amplificao da sequncia de interesse, com capacidade ainda de gerar
resultados quantitativos com maior preciso.
Durante a amplificao, a quantificao determinada pela quantidade de
produto amplificado durante cada ciclo, atravs da fluorescncia emitida. Esta
metodologia utiliza um equipamento com sistema de monitoramento da emisso
da fluorescncia.
Microarray

A hibridizao de amostras de DNA-teste com sequncias gnicas especficas imobilizadas em

superfcies slidas tornou-se uma ferramenta importante no estudo de expresso gnica, na
anlise filogentica e de polimorfismo de nucleotdeos. Um DNA-microarray (microarranjo de
DNA) uma coleo de pontos microscpios formados por sequncias de DNA fixados em uma
superfcie slida constituda de vidro, plstico ou silicone. Estes segmentos microscpicos so
chamados de sondas. Milhares delas so ligadas ao suporte, formando um pequeno chip que
ser utilizado como plataforma para a realizao de reaes de hibridizao que possibilitaro a
deteco da sequncia ou sequncias-alvo no material analisado.
As sequncias de DNA (ou cDNA) a serem analisadas so marcadas com corantes
fluorescentes e colocadas para reagir com as sequncias fixadas na superfcie do microarranjo.
Ao final, o sistema lavado, as amostras no hibridizadas so removidas e a concentrao de
DNA medida pela intensidade da emisso de fluorescncia. Um ou dois fluorforos so
utilizados, dependendo da plataforma utilizada, sendo geralmente o Cy3 e Cy5 usados para
marcar DNA. Os DNAs marcados so analisados num microarray scanner para a visualizao
da fluorescncia aps excitao com um raio laser de comprimento de onda definido.
A tecnologia de hibridizao em microarranjos tem o potencial para permitir a deteco
simultnea de mltiplas infeces causadas por diversos patgenos, viral ou no-viral. A
primeira aplicao do mtodo para diagnstico na virologia foi para o sequenciamento do HIV,
buscando mutaes associadas resistncia s drogas antirretrovirais. Este ensaio foi muito til
tambm na caracterizao do vrus da SARS (severe acute respiratory syndrome) como um
novo coronavrus.

Duplo hibrido
O sistema de duplo-hbrido em levedura uma tcnica que possibilita o estudo
de possveis interaes entre protenas (YOUNG et al., 1998) e/ou protena-DNA
(JOUNG et al., 2000; HURT et al., 2003) in vivo. Este sistema, inicialmente
descrito por Fields e Song (1989), foi criado a partir de estudos da funcionalidade
de fatores de transcrio em organismos eucariticos (KEEGAN et al., 1986),
utilizando principalmente o fator de transcrio Gal4 na levedura Saccharomyces
cerevisae. Este ativador de transcrio possui dois domnios: (i) o domnio de
ligao de DNA, localizado na poro N-terminal (aminocidos 1 a 147) (KEEGAN
et al., 1986) e (ii) o domnio de ativao transcricional na extremidade C-terminal
da protena (aminocidos 768 a 881) (MA; PTASHNE, 1987) (Figura 1).
O principal fator que possibilita a utilizao do sistema de duplo-hbrido em
levedura para estudar interaes entre protenas a capacidade dos domnios N
e C terminais da protena Gal4 ativarem a transcrio gnica quando esto
prximos sem necessariamente precisarem estar ligados. Dessa forma,
possvel testar a interao entre duas protenas clonando cada uma em cada um
dos domnios mencionados acima. A primeira gera um hbrido entre o domnio da

protena Gal4 de ligao ao DNA e a protena conhecida. A segunda gera um

hbrido entre o domnio de ativao transcricional da protena Gal4 e uma
segunda protena, da qual se quer testar a interao. Estas duas construes
recombinantes so inseridas na levedura modificada para tal fim e, caso exista
interao entre as duas protenas, a transcrio de um gene reprter presente
na prpria levedura ativado (FIELDS; SONG, 1989). Um dos genes reprter
codifica a enzima -galactosidase (lacZ) produzindo uma levedura de colorao
azul (JOUNG et al., 2000). Um segundo gene reprter um da via metablica da
histidina e permite levedura crescer na presena do inibidor 3-aminiotriazole
3-AT da enzima imidazole glicerol fosfate [IGP] desidratase dessa via (KISHORE;
SLAH, 1988). O uso de dois genes reprteres na mesma levedura ajuda a
diminuir o nmero de falsos positivos.
Rna de interferncia
Apesar de existirem diferenas nos mecanismos de silenciamento gnico por
RNAi e microRNA nos organismos pertencentes a diferentes reinos ou mesmo
espcies, no geral, tais processos so muito semelhantes. Molculas de RNA
dupla-fita so processadas pela enzima Dicer, uma endonuclease, ganhando
uma conformao linear e reduzindo seu tamanho. Os pequenos RNAs gerados
so englobados por um complexo denominado RISC (RNA Interference Specificity
Complex), no qual devido presena de uma helicase sua dupla-fita aberta e a
fita antisense do duplex guia o complexo at o mRNA alvo. Ocorre ento a
inibio traducional ou a degradao do mRNA, de acordo com o tipo de
molcula e especificidade do pareamento.

Tcnicas de BioMol:

RNAds sintticos podem ser introduzidos em culturas celulares podendo

suprimir genes especficos de interesse.

Efetivo em baixas cpias e altamente especfico.

IRNA DE INTERFERNCIA: Mutagnese direcionada baseada na observao de

que em muitos sistemas a expresso de um RNA dupla fita causa a degradao
do mRNA correspondente. Fcil sntese e manipulao. Simples aplicao.
Resistente ao de nucleases.Baixo custo. Resposta rpida. Permite estudar
ao de genes em organismos de difcil manipulao em laboratrio.
Necessidade de conhecimento prvio da seqncia alvo. Optimizao da
aplicao e do dsRNA (fita dupla de RNA).DICER: picota a fita de RNA, uma
RNase 3. Esses fragmentos vo se ligar a complexos proticos formando os RISC
(ver desenho).

apesar de existirem diferenas nos mecanismos de silenciamento gnico por

RNAi e microRNA nos organismos pertencentes a diferentes reinos ou mesmo
espcies, no geral, tais processos so muito semelhantes. Molculas de RNA
dupla-fita so processadas pela enzima Dicer, uma endonuclease, ganhando
uma conformao linear e reduzindo seu tamanho. Os pequenos RNAs gerados
so englobados por um complexo denominado RISC (RNA Interference Specificity
Complex), no qual devido presena de uma helicase sua dupla-fita aberta e a
fita antisense do duplex guia o complexo at o mRNA alvo. Ocorre ento a
inibio traducional ou a degradao do mRNA, de acordo com o tipo de
molcula e especificidade do pareamento.

ED BIOMOL
1. A E. coli uma bacteria (procarionte) e no possui a maquinaria
necessria para a retirada dos introns do Mrna. Logo, a sntese da protena
a partir de cDNA, que o DNA sintetizado a patir usando transcriptase
reversa e cujos introns j foram removidos pelo processo de splicing, seria
o melhor mtodo. J no caso de DNA genomico, a presena dos introns
no permitiria sntese da protena.
2. Amplificar o DNA de forma randmica, usando tcnica de randomic primer
so usados vrios primers e diferentes trechos so amplificados, depois
eles so enviados para o banco de dados e analisados aps o
sequenciamento. O uso de primers aleatrios e curtos permitem que eles
se liguem a vrios stios, assim vrios trechos so amplificados e depois
sequenciados. As sequencias devem estar mais prximas
filogeneticamente a aves e repteis.
A gente concordou em que para se ter a certeza de que de dinossauro, ele tem que saber
a sequncia, porque se no souber nem tem como fazer o primer. Alm disso, para confirmar
se o DNA amplificado mesmo de um dinossauro, ele teria que comparar isso com um
banco de dados

3. Extringencia baixar a temperatura de anelamento

Ao aumentar a temperatura as ligaes de H que ligam as fitas iro se
desestabilizar e se tornaro mais fracas em altas temperaturas, a ligao
do primer ao DNA molde ser dificultada e somente os que forem bastante
estticos .... se ligaro. Ao usar extringencia menor, os primers se
anelarao mesmo que haja alteraes entre o DNA da levedura e o humano
pela presena de homologias, pois o DNA degenerado.
4. Usar uma enzima de restrio que no corte a regio conhecida, usando
primers ....... que se ligaro a .... regio do DNA cada um em uma fita e
amplificando ela
Eu tinha perguntado isso pra um amigo e ele disse se pode usar vrios primers inespecificos
A voc acaba amplificando vrios trechos, esses trechos voc pode mandar pro sequenciamento

Existe uma tcnica de deleo, onde voc pode ampliar a sequncia que no est entre os primers,
porm ela no aconselhada pra sequncias muitos grandes e mais usada em plasmdeos

5. A protena apresenta 4 dominios iguais, no qual o primer pode se ligar ao

primeiro domnio e amplificar a sequncia inteira e poder fazer isso com
cada domnio apresentando 4 bandas na eletroforese.
6. Tanto os primers forward e reverse, se anelarao com a mesma eficincia
nas suas regies complementares ao template.
** DNA molde- template
** Estringencia determina a especificidade no .... de DNA a ser amplificada.
T anelamento o fator mais significante que afeta o anelamento do primer
T mais baixa menor estringencia e o primer pareia em qualquer lugar
T mais alta Maior estringencia e o primer no ....
Tm- temperatura a qual metade da sequncia de bases de uma molcula de
DNA, esta desnaturada

7. No seiiiiii
PLASMDEOS
Os plasmdeos so pequenas molculas de DNA de cadeia dupla, que contm
os elementos necessrios sua replicao e um gene que confere resistncia
a um antibitico. Podem estar presentes em duas ou mais cpias na clula e
podem variar entre 5 e 400 kb (kilobases). Este plasmdeos, sendo capazes
de amplificar o segmento de DNA neles inserido, so utilizados
como vectores de clonagem. Para isso, tm que possuir certas propriedades:
ter uma origem de replicao, que consiste numa sequncia de DNA que
permite
a
replicao
do vector na
clula
hospedeira;
possuir Mltiplos Stios de Clonagem (MSC), ou seja, vrios locais nicos de
clivagem para endonucleases de restrio, os quais constituem o stio de
insero
no vector de
clonagem;
conter um gene que codifique uma substncia que possa distinguir uma
clula transformada de uma no transformada. Muitas vezes, so utilizados
genes que conferem resistncia a um antibitico, destacando-se, devido sua
grande utilizao, o gene que confere resistncia ampicilina. Assim, as
clulas que possuem este gene so capazes de crescer em meios com
ampicilina, enquanto que as restantes no sobrevivem.

8.
Z+ = habilidade de produzir b-galactosidase
Z- = falta de habilidade de produzir b-galactosidase

I+ = indutivel- produz repressor normal que tem afinidade pelo operador e

indutor
I- (also I c) = constitutivo O repressor tem a afinidade alterada pelo operador,
entao eles no se ligam
O+ = tipo normal, se liga ao repressor
O- = constitutivo- mudana no sitio de ligao do repressor, ele no pode se
ligar.
P+ = promotor normal
P- = promotor no pode se ligar a RNA polimerase
If the organism in question is a partial diploid, the two chromosomes are
written side by side, separated by a slash. Good copies of genes are indicated
by a + sign.
Look at the promoter first- do you have a good copy of the promoter (p+)? If not,
RNA polymerase cannot get transcription started and that chromosome is a bust.
If you do have p+, next look at how the repressor and the operator interact. Here
are a few scenarios:
a. No produz, pois esse genotipo no produz a habilidade de produzir Z(Z-).
Constitutivo, pois o repressor no tem afinidade de se ligar ao operador I-.
b. No produz, pois esse genotipo no produz a habilidade de produzir Z(Z-).
No indutivel
c. Indutivel. Pois, o primeiro cromossomo apresenta I-, indutor constitutivo
que significa que ele no liga ao operador, mas no segundo cromossomo
ele est presente.
d. No primeiro cromossomo, no h ligao do operador ao repressor, pois o
sitio de ligao do operador foi modificado. Constitutivo. Porm, o gene Z
tambm no tem habilidade de produzir a b-galactosidase
e. Constitutivo. O repressor no vai se ligar ao operador
f. O RNA polimerase no vai se ligar ao promotor. No indutivel

9.O que PCR?

A tcnica PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reao em Cadeia da Polimerase)
consiste basicamente na amplificao in vitro de uma regio especfica de DNA
com intuito de aumentar o nmero de cpias deste, a fim de produzir material
suficiente para as diversas anlises. Ou seja, o mtodo utilizado para fazer
muitas cpias de uma determinada parte do DNA.
O processo de PCR ocorre em 3 etapas:
4.

Desnaturao em uma temperatura de 95C ocorre a separao da

dupla fita de DNA.

5.

Anelamento ou Hibridizao em uma temperatura de 60 a 64C

os primers se ligam/anelam s suas sequncias complementares de DNA (a
regio que se pretende amplificar) e servem como iniciadores para a enzima
polimerase.

6.

Extenso ou polimerizao com o ponto de partida j identificado, aos

72C, a taq polimeraseliga-se a fita sinalizada pelo primer, complementando-a, e
inicia a sequencia que ser replicada, formando novamente uma fita dupla de
DNA.
So realizados aproximadamente de 40 a 60 ciclos como este, promovendo a
amplificao de determinada regio que se pretende analisar, seja ela um loco
humano especfico ou material gentico de microorganismos.

O que qPCR ou PCR em Tempo Real?

A PCR em Tempo Real (Real Time Quantitative PCR) uma variao da tcnica
de PCR, a qual permite que a amplificao e deteco ocorram
simultaneamente. O resultado visualizado em Tempo Real durante a
amplificao da sequncia de interesse, com capacidade ainda de gerar
resultados quantitativos com maior preciso.
Durante a amplificao, a quantificao determinada pela quantidade de
produto amplificado durante cada ciclo, atravs da fluorescncia emitida. Esta
metodologia utiliza um equipamento com sistema de monitoramento da emisso
da fluorescncia.
Aplicaes da PCR em tempo real
Perfilamento gentico ou microarray
No campo da pesquisa bsica, a PCR em tempo real tem sido utilizada
tambm para a validao de resultados de microarray. O microarray
uma tcnica de hibridizao que permite a investigao da anlise da
expresso de milhares de genes ao mesmo tempo. Para tal, utiliza
matrizes contendo sondas complementares a diversos genes e permite,
por tcnicas de hibridizao com o cDNA-alvo marcado com fluorforo,
avaliar a expresso gnica. Alguns arrays possuem todo o genoma de
um organismo e podem ser utilizados para avaliar alteraes da expresso
gnica (transcriptoma). O problema que o mtodo basicamente
qualitativo e no permite uma anlise estatisticamente confivel e de fcil
correlao. Por tal motivo a PCR em tempo real utilizada como uma
tcnica de apoio para validar e quantificar os genes escolhidos nas
anlises de microarray

10.
Both terms refer to the alteration in the transcription from a gene, the
difference being the level of transcription. In a knockout, the gene is not
transcribed at all, whereas in a knockdown there is some transcription,
usually well below the normal level
Good question. When we talk about a gene knockout, we are talking about
a modification of DNA that usually removes all or part of a gene. We do
this deliberately and can control which gene we are targeting. We usually
do this in mouse cells or cells that grow in culture. Gene silencing is a
natural process that we are beginning to understand, but really cannot
control very well. If you think about it you should not express digestive
enzymes anywhere except in the stomach or intestines. In blood or brain
cells, these genes are silenced. Likewise the hemoglobin genes are
expressed only in red blood cells are are silent on other cells. There is also
gene knockdowns. This too is an experimental tool, where we can target a
specific RNA for destruction, lowering the level of the protein in cells. This
allows us to study the effects of a specific gene without going to all the
work in doing a complete knockout

11.
O estudo genmico de tantas espcies ao longo do tempo, levou necessidade
da construo de bibliotecas de DNA. Estas so coleces de fragmentos de DNA
de um organismo, clonados em vectores, geralmente vrus ou plasmdeos, e
armazenadas em clulas hospedeiras (E. coli). A denominao destas bibliotecas
varia conforme a natureza do DNA, biblioteca de DNA genmico ou biblioteca
de cDNA. Em ambos os casos o DNA bastante complexo surgindo a
necessidade de produzir um nmero elevado de clones para assegurar que se
obtm todas as partes do genoma.
A organizao do DNA em bibliotecas facilita o trabalho da Engenharia Gentica
pois por vezes o nico modo de se obter um gene, a fim de se efetuar um certo
estudo.
Biblioteca de DNA genmico
A biblioteca que inclui fragmentos representativos da totalidade do genoma de
uma clula ou organismo designada por biblioteca genmica. Nesta biblioteca
esto presentes no s as regies codificantes mas tambm as regies no
codificantes. Desta forma, quando se pretende estudar uma zona no codificante
mas importante para a regulao da transcrio, por exemplo, recorre-se a este
tipo de biblioteca.
De uma forma geral, os passos necessrios construo de uma biblioteca
genmica so:

Isolamento de DNA de alto peso molecular;

Digesto do DNA isolado com enzimas de restrio de modo a produzir

fragmentos de tamanho compatvel com o vector de clonagem;

ligao desses fragmentos ao vector, geralmente baseado no fago l;

Introduo do DNA recombinante nas clulas hospedeiras de E. coli.

Quando se pretende obter um certo fragmento da biblioteca necessrio fazer o

screening, ou seja, utilizando sondas de DNA, identifica-se e selecciona-se os
clones que contm o fragmento de interesse
Bibliotecas de DNA complementar (cDNA)
A enzima transcriptase reversa capaz de sintetizar DNA a partir de mRNA.
Desta reaco, surge o cDNA que constitudo apenas pela parte codificante,
uma vez que o mRNA s contm os exes. Assim, a sua utilizao na rea da
biotecnologia trouxe muitas vantagens como a possibilidade de cDNAs de clulas
eucariticas superiores serem directamente transcritos e traduzidos em
microorganismos, permitindo assim a produo em grande escala de
polipeptdios ou a determinao directa da sequncia de RNA e subsequente
deduo da sequncia de aminocidos da protena por ele codificada, importante
para a sequenciao. Com a utilizao crescente deste tipo de DNA surgiu a
necessidade de organizar esta informao em bibliotecas, da mesma forma que
se fez para o DNA genmico.
A construo de bibliotecas de cDNA passa pelas seguintes etapas:

Extraco do RNAm total da clula de interesse;

Sntese in vitro de cDNA a partir do RNAm pela transcriptase reversa e

converso das molculas de cadeia simples de cDNA em cadeia dupla pela
polimerase;

Introduo dos cDNA recombinantes nos vectores e estes nas clulas

hospedeiras;

Identificao dos clones de interesse atravs de um processo de triagem

dos clones recombinantes.

Tal como nas bibliotecas de DNA genmico, quando se pretende obter um

certo fragmento da biblioteca necessrio fazer o screening. Neste caso, se a
sequncia for conhecida utiliza-se sondas de DNA, se no utiliza-se anticorpos
(se cDNA estiver num vector de expresso). Depois identifica-se e seleccionase os clones que contm o fragmento de interesse
Uma biblioteca de cDNA , muitas vezes, preferencialmente utilizada para se
iniciar a clonagem de um gene. Isto, deve-se ao facto de, sendo o cDNA (DNA
complementar) derivado do mRNA (RNA mensageiro), para uma protena
expressa na clula, obtm-se bibliotecas em que a sua representao
significativamente maior do que em bibliotecas genmicas, o que auxilia o
seu isolamento. Outra vantagem poder deduzir-se facilmente a sequncia
da protena pois o cDNA de eucariotas uma cpia do mRNA processado.
Finalmente, bastante importante, para vrios trabalhos de investigao,
possuir um clone de DNA completo (com todas as sequncias codificantes da
protena).

O cDNA uma cpia da mensagem, no possuindo assim intres e apresentando

poucas sequncias que no codificam protenas. Esta ausncia de intres
permite a directa transcrio e traduo dos cDNA de clulas eucariticas
superiores, em bactrias e outros microorganismos, o que permite a produo
em massa de polipeptdeos importantes. A inexistncia de intres facilita
igualmente a determinao direta da sequncia da mensagem codificada e
deduo subsequente da sequncia de aminocidos da protena por ela
codificada, o que se tem demonstrado extremamente til na identificao de
inmeras protenas que ainda no o tinham sido gentica ou bioquimicamente.

No sei de que questo

*Em bactrias, comum o uso de um mesmo promotor e regio regulatria para
codificao de mais de uma protena como so 2 subunidades de 2 proteinas
diferentes no necessrio desenhar sequencias codificadoras repetidas. Pode
se usar 2 genes em operon, dando origem aos dois tipos de protena que iro
codificar em um tetrmero. Alm disso, a sequncia em humanos, se apresentar
introns importante que se use o Mrna para criar o cDNA pois a bactria no
possui mecanismo de ~splicing~e o mRNA s possui exons.

**O DNA do microrganismo protegido por modificaes covalentes que

impediro que as enzimas de restrio destruam o DNA, como o mecanismo de
metilao.
*** O chip microarray rene vrias sequencias de DNA ligadas a um
suporte de membrana que ao entrarem em contato com o contedo de
RNA, vao hibridizar com o contedo aquelas sequencias correspondentes
as proteinas expressas. Proteinas GFP ligadas aos arranjos de DNA que
geram hbridos sero lidos por um aparelho.