TECNOLOGA DE DNA

RECOMBINANTE
Ignacio Zarante, MD, MSc.

Manipulacin del DNA

Rotura

de DNA en sitios especficos

(Enzimas de restriccin)
Hibridacin del DNA con sondas
especficas
Clonacin del DNA
Secuenciacin de DNA
Aplicaciones clnicas

Rotura del DNA

Enzimas

de restriccin =
Endonucleasas de restriccin =
Restrictasas
VER FIGURA GENETIC IT

RESTRICTION FRAGMENTS
LENGTH POLYMORPHISM
RFLP
Tcnica

que evalua los diferentes

patrones de restriccin que se
obtienen con diferentes
endonucleasas
VER GENETIC IT
Usos en forense: Identificacin de
individuos o paternidades

CLONACIN DEL DNA

VECTORES
Plsmido
Fago
Csmido
YAC

REACCIN

EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)

VECTOR
VECTOR
Vector

DNA o RNA
Cpsula y
Protenas
virales

Genes
estructurales,
de replicacin,
etc.

INSERCIN
INSERCIN

Gen de resistencia
a ATB

Gen a clonar

Corte con enzimas

de restriccin
Material Gentico
Material Gentico
del vector
Transformado

TRANSFECCIN
TRANSFECCIN
Gen a clonar
Infeccin de
clula blanco

TRANSFECCIN
TRANSFECCIN
Gen a clonar
Infeccin de
clula blanco

TRANSFECCIN
TRANSFECCIN
Gen a clonar
Infeccin de
clula blanco

TRANSFECCIN
TRANSFECCIN
Gen a clonar
Infeccin de
clula blanco

TRANSFECCIN
TRANSFECCIN
Gen a clonar
Infeccin de
clula blanco

TRANSFECCIN
TRANSFECCIN
Gen a clonar
Infeccin de
clula blanco

TRANSFECCIN
TRANSFECCIN
Gen a clonar
Infeccin de
clula blanco

TRANSFECCIN
TRANSFECCIN
Gen a clonar
Infeccin de
clula blanco

CLONACIN
CLONACIN

Clulas en cultivo
Ejemplo: E. Coli

VECTORES
Plsmido
DNA

circular que se replica en la bacteria.

Inicio de replicacin y sitio de restriccin
(<10 kB)

Fago
Virus

que infecta clulas (16 kB)

Csmido
Plsmido

+ Fago (45 kB)

YAC
Cromosomas

(>100 kB)

artificiales de levaduras

BIBLIOTECAS GENMICAS
Coleccin

de fragmentos clonados
ligados a vectores y almacenados en
clulas hesped
Pueden ser de DNA complementario
(cDNA) = DNA producido por
trancriptasas reversas proveniente
de RNA (No contiene INTRONES)

REACCIN EN CADENA DE
LA POLIMERASA (PCR)

dnTPs (A, C, G y T)
TAQ polimerasa
Primers
DNA completo

REACCIN EN CADENA DE
LA POLIMERASA (PCR)
Denaturacin

95 C
Anillamiento 60.5 C
Polimerizacin 72 C
VER GENETIC IT

ANLISIS DE DNA
HIBRIDACIN con Southern blotting
Mst II
B globina
Normal
2 fragmentos
B globina
Anormal
1 fragmento

ANLISIS DE DNA
HIBRIDACIN con Southern blotting

Marcador de
Peso molecular
Portador

Anemia
Falciforme

Sano

DNA digerido con Mst II

ANLISIS DE DNA
HIBRIDACIN con Southern blotting

Electroforesis de DNA

ANLISIS DE DNA
HIBRIDACIN con Southern blotting

Se transfiere a Nitrocelulosa

ANLISIS DE DNA
HIBRIDACIN con Southern blotting

Se adiciona sonda de B globina

Marcada radioactivamente

ANLISIS DE DNA
HIBRIDACIN con Southern blotting

Hibridacin con la sonda

Radio marcada

ANLISIS DE DNA
HIBRIDACIN con Southern blotting

REVELADO

SECUENCIACIN
Tcnica

que demuestra la
secuencia de pares de bases
de un segmento de DNA
determinado
Mtodo

qumico (Maxam

Gilbert)
Mtodo enzimtico (Sanger)

SECUENCIACIN

SECUENCIACIN

APLICACIONES CLNICAS
Diagnstico
Enfermedades

unignicas
Patologas infecciosas
Suceptibilidad a enfermedades
Identificacin
Paternidades
Individuos

Terapia

NN

gnica

TERAPIA
TERAPIA GNICA
GNICA
SNC: Cancer
Sistema Respiratorio:
Fibrosis qustica, cancer,
alfa 1 antitripsina
Organos Slidos: Hgado.
Ejem: Hipercolesterolema
Tejido hematopoytico:
Cancer y defectos inmunolgicos
Musculo: Distrofia muscular
Sistema circulatorio: Aterosclerosis

TERAPIA
TERAPIA GNICA
GNICA
TRANSFERENCIA GENICA

In vivo

VECTORES
VIRALES
Adenovirus, Herpes,
Poxvirus, Retrovirus

Ex vivo

METODOS
NO VIRALES
Liposomas, DNA desnudo,
Electroporacin, bombardeo

FIN