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UNESP

FACULDADE DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA Unesp


FCT – Campus de Presidente Prudente

Relatório de Bioquímica
FOTOCOLORIMETRIA E ESPECTROCOLORIMETRIA:
FRACIONAMENTO DAS PROTEÍNAS DO LEITE
E SUA DOSAGEM PELO MÉTODO DO BIURETO

Discentes: Gabriela Bitto de Oliveira


José Carlos de Oliveira Junior
Tamara Murisugi de Oliveira
Docente: Profa. Dra. Maria de Lourdes Corradi C. Da Silva
Disciplina: Bioquímica
Curso: Engenharia Ambiental
2° ano

Presidente Prudente, 31 de março de 2010


Índice

1. Introdução ..........................................................................................................................2
1.1. Métodos Fotocolorímetros ................................................................................................2
1.2.Curva padrão ......................................................................................................................4
1.3. Procedimento para montagem de uma curva padrão ........................................................4
1.4. Métodos para quantificação de proteínas totais ................................................................4
1.5.Método do Biureto para determinação de proteínas ..........................................................5
1.6. Proteínas presente no leite ................................................................................................5

2. Objetivos .............................................................................................................................6

3. Matérias Utilizados ............................................................................................................7


3.1.Precipitação Isoelétrica da
Caseína ...................................................................................7
3.2. Diluição do leite para a dosagem de proteínas .................................................................7

4. Metodologias ......................................................................................................................7
4.1. Precipitação Isoelétrica da Caseína ..................................................................................7
4.2. Diluição do leite para a dosagem das proteínas totais ......................................................8
4.3. Curva de calibração e dosagem de proteína .....................................................................8

5. Resultados e Discussões ...................................................................................................11

6. Conclusão ..........................................................................................................................12

7. Bibliografia ......................................................................................................................13

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Métodos Fotocolorímetros

A fotocolorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento


analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a absorção de
energia radiante (luz).
A fotocolorimetria é um método biofísico de análise de substâncias largamente utilizado em
laboratórios de análises clínicas e em laboratórios de pesquisa, tendo como principal objetivo a
determinação da concentração de soluções. Esse método baseia-se na relação existente entre a
absorção de radiações eletromagnéticas e a concentração da substância em questão. O equipamento
utilizado para a realização da prática de fotocolorimetria, o fotocolorímetro, é composto pelos
seguintes itens: fonte de luz, filtro, cubeta, fotocélula e miliamperímetro. O aspecto externo do
fotocolorímetro é bastante característico e composto por: seletor de filtro, que serve para a escolha
do comprimento de onda do feixe de luz que incidirá sobre a cubeta, sendo o aparelho dotado de
cinco filtros (410nm, 480nm,520nm,580nm e 660nm); porta-cubetas, que é o local onde se coloca a
cubeta;botões de calibração; mostrador de leitura, que apresenta as duas grandezas que podem ser
medidas pelo fotocolorímetro: a absorbância e a transmitância.
Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação
electromagnética por muitas moléculas, quando os seus electrões se movimentam entre níveis
energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda
entre o ultravioleta e o infravermelho. Um espectrofotômetro é um aparelho que faz passar um feixe
de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por
essa solução. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de
onda (tal como acontece no arco-íris com a separação das cores da luz branca). Pode-se assim fazer
passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um único comprimento de onda, ou
quase). O espectrofotômetro permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida a cada
comprimento de onda.
Fotometria é uma técnica de análise quantitativa que envolve a medida de intensidade de
absorção de luz monocromática de um composto químico em solução. Ou seja, analisa a
absorvância (capacidade que tem uma solução de absorver uma certa quantidade de energia do feixe
de luz incidente)
Serve para identificar o comprimento de onda característico para cada composto e para
quantificação do composto através de 1) absorção direta e 2) através de método colorimétrico. Essa

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intensidade de absorção depende:
1) do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o λ máx - onde o composto
absorve mais luz),
2) do percurso que o feixe de luz percorrerá na solução e
3) da concentração do composto nessa solução.
A lei de Lambert-Beer estabelece que a absorbância é diretamente proporcional á
concentração da espécie absorvente. A fração de luz que passa por uma amostra (a transmitância =
It/I0) está relacionada logaritmicamente, e não linearmente, com a concentração da amostra.
A lei de Lambert-Beer relaciona esses três fatores e estabelece que:

A = ε.l.c

onde:
A = absorbância é definida pela reação seguinte: A = - log It/I0, que por ser uma razão, não
possui unidade (Io é intensidade de luz incidente; It é intensidade de luz transmitida);
ε = absortividade molar (característico de cada substância), em L.(mol.cm)-1;
l = caminho óptico (percurso da luz monocromática na solução), em cm;
c = concentração da substância em mol/L.

Onde:
T= tranmissão ou transmitância;
Io= intensiadade do feixe luminoso incidente;
It= intensidade de feixe luminoso transmitido ou emergente;
a= coeficiente decádico de absorção ou extinção;
c= concentração da solução;
I= espessuara da solução.

Desta forma, mantendo-se o caminho óptico constante, a absorbância torna-se diretamente


proporcional à concentração da substância no respectivo λmáx.
Nestas condições, podemos utilizar uma solução de concentração conhecida do composto a
ser analisado (ou outra substância de características químicas semelhantes) para construir um
diagrama de absorbância em função da concentração da substância em questão. Com este diagrama,

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denominada curva padrão, podemos medir a quantidade do composto em amostras de concentração
desconhecida, pela simples medida de suas absorbâncias desde que, estas estejam nas mesmas
condições utilizadas para a construção da curva padrão (mesmos reagentes, mesma temperatura,
etc).

1.2. Curva padrão

Devido à existência de uma proporcionalidade direta entre a concentração das soluções e a


quantidade de luz absorvida em comprimentos de onda específicos, a espectrofotometria e a
fotocolorimetria podem ser usadas como um método quantitativo de identificação de substâncias.
Contudo, faz se necessário, a obtenção de uma relação entre absorbâncias registradas em
experimentos para diferentes concentrações de soluções, elaborando-se retas de calibração, ou seja,
curvas padrões .
Experimentalmente é possível conhecer os valores de absorbância de soluções conhecidas e
assim, utilizando-se as curvas padrões, podem-se determinar matematicamente as concentrações
destas.

1.3. Procedimento para montagem de uma curva padrão (Lehninger, 1984).

Quando escolhido um método de dosagem, prepara-se uma solução padrão de concentração


rigorosamente conhecida. Mede-se então com pipetas de precisão, diferentes volumes desta solução,
completando-se com solvente a um volume final determinado. É calculado e anotado a
concentração de cada uma das amostras e então são feitas duplicatas destas amostras e estas são
então processadas pelo método de dosagem. Um volume igual de solvente é processado pelo
mesmo método, para servir de branco nesta dosagem (eliminado da leitura o erro causado pela
absorção de luz pela cuba, solvente, reagente e impurezas).

1.4. Métodos para quantificação de proteínas totais

As proteínas desempenham papéis extremamente importantes, na maioria dos processos


biológicos, por isso, o desenvolvimento de metodologias para determinar esses compostos tem,
cada vez mais, se tornado de fundamental relevância em várias áreas do conhecimento (Zaia, 1998).
São encontrados na literatura, diferentes métodos para a quantificação de proteínas. A
maioria desses métodos tem como base: a) na propriedade intrínseca das proteínas para absorver
luz no UV, b) na formação de derivados químicos, e c) na capacidade que as proteínas têm de se

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unir a certos corantes.
Os métodos para a determinação da concentração de proteínas totais são muito variados, no
entanto, as metodologias mais utilizadas são as espectrofotométricas no ultravioleta e no visível. Ao
longo dos anos, muitos métodos espectrofotométricos, têm sido propostos para a determinação de
proteínas totais, porém não existe uma metodologia considerada de uso universal para todos os
meios. Os métodos geralmente mais utilizados são o do Biureto, de Lowry, de Bradford, de Smith e
de absorção de proteínas no ultravioleta (Zaia, 1998):

1.5. Método do Biureto para determinação de proteínas

Um dos métodos utilizados para dosagem de proteína é chamado de método do Biureto.


Esse método faz uso da propriedade de íons Cu2+ em meio alcalino de formar ligações com o
nitrogênio das ligações peptídicas., que reage de modo quantitativo com as proteínas. Desta reação
(reação de biureto) resulta uma coloração púrpura intensa, que absorve fortemente a radiação a 540
nm. Este fato pode ser explorado para se determinar por colorimetria a quantidade de proteína de
uma solução. A cor desenvolvida numa reação de íons de Cu2+ em meio alcalino com estas
proteínas deve-se exclusivamente às ligações peptídicas e a sua intensidade é proporcional a
quantidade de tais ligações. A absorbância é detectada no espectrofotômetro ou fotocolorímeto.

1.6. Proteínas presente no leite

O leite é essencial numa dieta bem balanceada e composto de diversos nutrientes e


substâncias fisiologicamente ativas. O leite é composto por 87,5% de água, 3,6% de gordura, 4,5%
de lactose, 0,8% de sais minerais e 3,6% de proteínas, há três tipos de proteínas diferentes: 7-12%
de α-Lactoalbumina, 2-5% de β- Lactoglobulina e o restante de caseína.
O ponto isoelétrico da caseina é 4.6. É o ponto de pH em que ela precipita (coagulação
ácida). A proteína purificada é insolúvel em água. Enquanto é insolúvel em soluções salinas neutras,
prontamente se dispersa em meio alcalino diluído e em soluções salinas tais como oxalato de sódio
e acetato de sódio. Além disso, a caseína faz muito bem à saúde.

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2. OBJETIVOS

• Elaborar curvas de calibração e estabelecer a sensibilidade de um método fotocolorimétrico.

• Relacionar os métodos fotocolorimétricos às situações onde poderão ser aplicados, tendo como
exemplo a dosagem de proteínas do leite pelo método da reação do biureto.

• Resolver problemas específicos: cálculos das diluições e de concentrações.

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3. MATERIAIS

3.1. Precipitação Isoelétrica da Caseína

a) Solução padrão de proteína a 5,0mg/mL;


b)HCl a 2% v/v;
c) reagente do biureto: sulfato de cobre cristalizado (pentaidratado) 1,5g; tartarato duplo de sódio e
potássio 6,0g; 500mL de água destilada. Adicionar 300 mL de NaOH a 10g% (p/v) com constante
agitação e completar para 1 litro com água destilada;
d) papel indicador de pH;
e) leite desnatado longa vida (0% gordura).

3.2. Diluição do leite para a dosagem de proteínas

a) leite desnatado;
b) água destilada.

4. METODOLOGIA

4.1. Precipitação Isoelétrica da Caseína

a) Colocou-se 10mL de leite com 10mL de água destilada morna em um béquer de 50mL;
b) foram acrescentados 2mL de solução de ácido clorídrico a 2%, gota a gota, com constante
agitação até atingir o ponto isoelétrico da caseína, que corresponde ao pH 4.6, no qual o leite
coagula;
c) o pH foi medido com o auxílio de um papel indicador universal;
d) anotou-se o volume de HCl 2% gasto;
e) após sedimentação do precipitado, filtrou-se o material por papel;
f) o filtrado foi utilizado para a dosagem de proteína que não precipitaram nas condições acima
descritas.

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4.2. Diluição do leite para a dosagem das proteínas totais

a) Diluiu-se 0,5mL de leite em 9,5mL de água destilada à temperatura ambiente (proporção 1:20);

OBS.: Neste trabalho PF refere-se a proteínas do filtrado; PT, proteínas totais e (PT-PF) à
quantidade de caseína.

4.3. Curva de calibração e dosagem de proteína


a)
Curva de calibração PF PT
Tubos n° 1 2 3 4 5 6 7 8
Padrão de proteína 0 0,2 (1mg) 0,4 (2mg) 0,6 (3mg) 0,8 (4mg) 1,0 (5mg) -- --
5 m/ml (ml)
Amostra -- -- -- -- -- -- 1,0 1,0
(PF ou PT) (ml)
Água destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -- -- --
Reagente do Adicionar em todos os tubos 5 ml
Biureto

Tabela 4.1- Dosagens para curva de calibração

b) Agitou-se todos os tubos, deixando-os em repouso durante 10 minutos;


c) a absorbância dos tubos foi analisada no fotocolorímetro 540 nm, sendo o aparelho zerado com o
tubo nº 1 (branco = concentração zero de proteínas).
d) Utilizou-se duas cubetas em que umas delas continha o material do tubo 1 e a outra para as
demais soluções.

Obs.: É necessária a limpeza externa da cubeta que recebe as soluções do tubo 2 ao tubo 8 usando
papel higiênico, a fim de não afetar o valor da absorbância registrada pelo fotocolorímetro. A partir
do tubo 6 é necessário lavar as cubetas. Além disso, a troca das cubetas deve ser instantânea para o
aparelho não se descalibrar.

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5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Misturando-se o ácido clorídrico à solução de leite formou-se um precipitado branco após a


adição de 2mL do ácido. Segundo a análise feita com o papel indicador, o pH da amostra ficou entre
4 e 5. Tal precipitado corresponde à caseína, proteína do leite. Enquanto que a parte superior é
composta pelas outras duas proteínas também importantes ao leite: lactoalbumina e lactoglobulina.
O ácido clorídrico foi adicionado ao leite com o intuito de diminuir o pH da solução e,
consequentemente, atingir o ponto isoelétrico da caseína (pI=4,6). A amostra foi filtrada para obter-
se o PF: líquido translúcido levemente amarelado.
Em seguida, diluiu-se 0,5mL de leite em 9,5mL de água destilada para diminuir a
concentração do leite já que lei de Beer-Lambert é válida somente para soluções relativamente
diluídas, uma vez que acima de certas concentrações a relação entre a absorvância e a concentração
deixa de ser linear. Tornando viável a análise da absorbância das PTs no fotocolorímetro (tubo 8).
O tubo 1(branco), contendo apenas água e a solução do biureto, possuía uma coloração
azulada e foi utilizado para calibrar o fotocolorímetro. Do tubo 2 ao 6, o aumento da concentração
de proteínas, fez com que a coloração tendesse gradativamente ao violeta.
Os tubos 7 e 8 apresentaram coloração violeta intermediária às colorações dos tubos 2 ao 6.
Analisando as Densidades Ópticas obtidas, mostradas no Gráfico 5.1 e na Tabela 5.1, foi
possível observar uma certa relação entra a absorbância e a concentração de proteínas de acordo
com o esperado, ou seja, uma relação diretamente proporcional.

Tubo mg/ml 1 2 3 4 5 6 7 8
Luz absorvida 0,0 0,04 0,07 0,10 0,14 0,18 0,09 0,09
Tabela 5.1- resultados obtidos no fotocolorímetro

Lembrando que o tubo 7 contém o material solúvel restante após a precipitação da caseína e
que primeiramente o leite foi diluído para 20mL (o dobro do volume inicial), a concentração
encontrada para esta amostra ( Tabela 5.1 ) deve ser multiplicada por 2 para se ter a quantidade real.

Cmg/mL = 2 x C7 → Cmg/mL = 2 x 2.7 → Cmg/mL = 5.4 mg/mL.

Onde: Cmg/ml = Concentração real das PFs;


C7 = Concentração do tubo 7.

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Com o tubo 8 também houve um processo de diluição. No entanto, a proporção de diluição
não foi de 1:2 como no tubo 7, e sim de 1:20. Portanto o valor obtido na Tabela 5.1 deverá ser
multiplicado por 20. Logo

C'mg/mL = 20 x C8 → C'mg/mL = 20 x 2.7 → C'mg/mL = 54mg/mL.

Onde: C'mg/mL = Concentração real das PTs;


C8 = concentração no tubo 8.

Enfim, a concentração da caseína é a subtração da C'mg/ml menos a Cmg/mL

Ccaseína = C'mg/mL – Cmg/mL → Ccaseína = 54.0 – 5.4 → Ccaseína = 48.6 mg/mL.

Sendo assim, encontra-se facilmente a porcentagem de caseína no leite fazendo a razão da


concentração da caseína com a concentração PTs real, multiplicando esse valor por 100

%Caseína = (Caseína / C'mg/mL ) x 100 → %Caseina = (48.6 / 54.0) x 100 →


→ %Caseína = 90%

Esperava-se obter um resultado entorno de 85% de caseína, como está escrito na literatura.
Supõe-se que o esperado não ocorreu devido a um erro de pipetagem, onde, ao se adicionar o ácido
HCl 2% em excesso, o pH ficou mais ácido do que o necessário, fazendo com que o ponto
isoelétrico da lactoalbumina que é entre 4,2 e 4,5, fosse atingido também, e esta, então, estaria
presente no precipitado juntamente com a caseína que possui seu ponto isoelétrico muito próximo
(pI = 4,6). O mesmo já não ocorre com a lactoglobulina que contém o pI aproximadamente igual a
5,2.

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Gráfico 5.1 - Gráfico obtido através da curva de calibração

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6. CONCLUSÃO

Visto que a fotocolorimetria e a espectrofotometria são técnicas analíticas que permitem


determinar a concentração das soluções através da medida da intensidade de luz absorvida ou
transmitida pelas mesmas, percebeu-se que com uma maior concentração de proteínas, há o
aumento no valor da absorbância (medida no fotocolorímetro) e, portanto, a quantidade de luz
transmitida (medida no espectrofotômetro) tende a reduzir/diminuir.

As curvas de calibração são determinadas através dos resultados obtidos por esses aparelhos.
Onde inicialmente há sempre um solução, considerada o branco, onde não está diluído nele o
material em estudo, no caso as proteínas, e as demais soluções aumentam gradativamente a
concentração deste material, gerando assim um gráfico de conc. (mg/ml) X absorvância, formado
por uma reta, já que é diretamente proporcional o aumento das variáveis.

Os cálculos apresentados tem como objetivo final mostrar a concentração de caseína


presente no material de estudo que foi retirada inicialmente na forma de um precipitado, que ocorre
devido à adição de ácido. Tal calculo se baseia em uma relação entre as proteínas totais presente no
tubo 8 menos as proteínas filtradas presente no tubo 7.

Por tratar-se de um experimento que inclui ou aborda métodos quantitativos, a mensuração


de cada material a ser utilizado tem influência direta nos resultados obtidos. Por exemplo, segundo
a literatura, “quando se realiza a dosagem de proteínas do leite, a porcentagem de caseína
encontrada é de 85%” – não coincidindo com/ contrariando, de certo modo, o observado nessa
(aula) prática, em que se obteve, algebricamente, uma porcentagem de 90% de caseína. Tal
desigualdade pode ter ocorrido em função de erros grosseiros na dosagem dos materiais, variando
assim, suas concentrações.

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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Bactérias Diazotróficas Crescidas em Meio de Cultivo Semi-Sólido. Embrapa, Seropédica RJ.
Julho de 2007.

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de março de 2010.

LIMA, CAROLINA & SAGIO, SOLANGE. Curvas padrões para determinação de açúcares
redutores, açúcares solúveis totais, proteínas e aminoácidos. Universidade Federal de Lavras,
departamento de biologia. Lavras MG, agosto de 2007.

SANTOS, GERALDO T. & SOUZA, LUCIMAR G. Valores Nutricionais do Leite de Vaca.


Curitiba PR, 2002.

Teoria e Prática da espectrofotometria quantitativa. "Photographic Chemistry 2076-302


Laboratory: 5 Spectrophotometry and Beer's Law":
<http://www.rit.edu/~bekpph/Chemistry/5_Spectrophotometry.html > Acessado em: 29 de março de
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TIBÚRCIO, H.M. Controle interno da qualidade analítica, 1aed.março/1995.

ULRICH, ALEXANDER HENNING & ARMELIN, HUGO AGUIRRE. Apostila de Bioquímica


QBQ220N. Universidade de São Paulo, Instituto de Química, 2006.

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