EXTRACCIN Y CARACTERIZACIN DE ADN DE LEVADURA

UNIVERSIDAD DE NARIO
DEPARTAMENTO DE QUMICA
RESUMEN: Se realiz una prctica de extraccin y caracterizacin de ADN a partir de
levadura por un mtodo consistente en cuatro pasos; el rompimiento celular se llevo a
cabo con arena y la extraccin inicial del ADN se llevo a cabo en bao de hielo con SDS y
EDTA. La desnaturalizacin de las protenas se llevo a cabo con una solucin de
cloroformo-alcohol isoamlico y posterior centrifugacin a 3000 rpm. La extraccin final
del ADN se logro mediante precipitacin con etanol. El ADN obtenido correspondi a un
slido de color amarillo y apariencia coloidal muy soluble en agua. Las pruebas de
caracterizacin de ADN fueron positivas para la identificacin general de ADN por el
mtodo de Feulgen-Schiff y la prueba de fosfatos. La prueba de desoxipentosas con
difenilamina present un resultado negativo debido a la contaminacin del reactivo de
difenilamina, debido a esto se utiliz una prueba con el reactivo de Bial que present un
resultado positivo.

INTRODUCCIN
La informacin que permite vivir a los
seres vivos est contenida en los
cidos
nuclecos.
Estos
son
macromolculas
compuestas
por
nucletidos,
que
tienen
en
su
estructura un azcar (ribosa o
desoxirribosa), una base nitrogenada
(adenina, guanina, citosina, timina,
uracilo) y un grupo fosfato.
En
principio, segn el azcar que forma
su esqueleto se distinguen dos tipos
de cidos nuclecos: el ADN, con
desoxirribosa y el ARN, con ribosa. El
ADN contiene la informacin gentica
necesaria para la sntesis de las
protenas que forman los seres vivos y
llevan a cabo todos los procesos
fisiolgicos de los seres vivos. El ARN
tiene diversas funciones siendo una de
las principales el transporte de la
informacin desde el ADN hasta la
maquinaria donde se producen las
protenas.
A
nivel
estructural
encontramos que mientras el ADN se
encuentra mayoritariamente formado
por una doble hlice con dos hebras
complementarias, el ARN est formado
por molculas de una sola hebra que
se
pliegan
sobre
s
mismas
adquiriendo estructuras internas. (1)
En su estructura secundaria, y de
acuerdo a los diversos estudios
fisicoqumicos, el ADN en solucin
acuosa ha demostrado que se trata de
un
polmero
de
elevado
peso
molecular (5 x 106) y que ofrece una

configuracin ms bien rgida y

distendida. Entre las consecuencias de
su elevado peso molecular y de la
rigidez de sus molculas se destaca la
elevada viscosidad de las soluciones
acuosas de ADN. Una solucin de ADN
tiene una densidad mucho mayor que
la del agua. Otra consecuencia de las
citadas propiedades de la molcula de
ADN es la gran facilidad con que las
fuerzas de friccin reducen su peso
molecular por rotura de su cadena. Es
prcticamente imposible obtener a
partir de material biolgico ADN sin
que tenga cierto grado de friccin, por
lo que es muy probable que los pesos
moleculares del ADN aislado (5 x 10 6)
tengan poco que ver con el tamao de
la molcula del ADN in vivo.
El ADN fibroso aislado tiene un modelo
de difraccin de rayos X muy neto,
indicio experimental directo de una
estructura secundaria muy regular.
Watson y Crick propusieron en 1953
una estructura secundaria del ADN,
que dedujeron de stos modelos de
difraccin de rayos X, y que estaban
de acuerdo con las observaciones de
Chargaff, mostrando que ciertos pares
de base de ADN, se presentan en
cantidades
equimoleculares.
Esta
estructura de Watson y Crack est
constituida por dos cadenas de ADN
que se enrollan helicoidalmente en
torno a un eje central comn,
originando una molcula de cadena
doble y de unos 20 de dimetro. Las

cadenas de azcar-fosfato estn

situadas en la parte externa de estas
hlices orientadas con direccin de
enrollamiento a la derecha; las bases
purnicas y pirimidnicas se encuentran
enlazadas por puentes de hidrgeno,
en la parte interna de las citadas
hlices, con los planos de sus anillos
orientados perpendicularmente al eje
central. Slo se tolera el apareamiento
de bases entre la adenina y la timina o
entre la guanina y citosina.(2)
Debido a que el ADN es la molcula
que almacena la informacin precisa
para que un ser vivo pueda llevar a
cabo todas las funciones que necesita,
su aislamiento de clulas y tejidos es
el
primer
paso
en
muchas
investigaciones
en
biologa.
El
aislamiento del ADN tambin es
empleado en diversos campos como la
medicina, la biotecnologa o la
criminologa para obtener mejores
terapias,
mejorar
cosechas
o
identificar individuos. Cuando se habla
del ADN hay que diferenciar el ADN
genmico, que se encuentra en el
ncleo y contiene la mayora de los
genes, de los ADNs extranucleares,
que se encuentran en la mitocondria y
el
cloroplasto
y
contienen
la
informacin de ciertas protenas
necesarias para el funcionamiento de
esos orgnulos celulares.(1)
En el presente informe se muestra un
mtodo de extraccin del ADN de
levadura en cuatro fases:
1) Rotura de las clulas de
levadura.
2) Homogeneizacin del extracto
en presencia de detergente y
EDTA.
3) Desnaturalizacin
de
las
protenas ligadas al ADN.
4) Precipitacin
del
ADN
con
etanol.
MATERIALES Y MTODOS
Extraccin del ADN
Se pesaron 5 g de levadura seca y 3 g
de arena para ser macerados en un

mortero durante 5 min hasta dejar la

levadura muy fina.
El slido fue
trasvasado a un erlenmeyer de 500
mL
con
tapa
(las
operaciones
siguientes se realizaron dentro de un
bao de hielo) y se adicionaron 30 mL
de
solucin
salina
de
EDTA.
Posteriormente se adicionaron 2 mL de
SDS al 25% y, en el bao de hielo, se
agit la mezcla durante 2 min.
A
continuacin se calent el conjunto
durante 10 min a 60 C en un bao de
agua con agitacin suave.
La mezcla se enfri a temperatura
ambiente y se adicionaron 5 mL de
perclorato de sodio 6 M, agitando
fuertemente para conseguir una
distribucin rpida y uniforme.
Se
adicionaron 40 mL de cloroformo y
alcohol isoamlico (24:1) a la mezcla y
se agit el conjunto durante 15 min.
La emulsin resultante se centrifug a
3000 rpm durante 10 min. Se recogi
con
cuidado
la
fase
superior
sobrenadante
con
una
pipeta,
evitando arrastrar los precipitados de
la interfase.
El sobrenadante fue transferido a un
matraz de 250 mL colocado en un
bao
de
hielo,
se
aadieron
lentamente 70 mL de etanol sobre la
solucin
procurando
no
mezclar
demasiado el lquido contenido en el
matraz.
A continuacin, con una
varilla de vidrio se agit suavemente
el
conjunto
observando
la
precipitacin del ADN en forma de
fibras blanquecinas dentro del matraz.
Se extrajo una pequea cantidad del
ADN y disolvi en 3 mL de agua y 0.5
mL de solucin salina de EDTA para
utilizarlo
en
las
pruebas
de
identificacin del ADN.
Pruebas
ADN

de

caracterizacin

del

Soluciones de cidos nuclecos:

Con el ADN obtenido se prepar 10 mL
de una solucin de cido nucleico al
1% aproximadamente.

Prueba de fosfatos: A 1 mL de la
solucin
de
cido
nucleico
se
agregaron 2 mL de molibdato de
amonio y 1 mL de cloruro estannoso
hasta observar la aparicin de un color
azul que indica la presencia del grupo
fosfato.
Prueba para desoxipentosas: a) A 1
mL de la solucin de cido nucleico se
adicionaron
2
mL
de
cido
tricloroactico al 10% y se calent el
conjunto en bao mara durante unos
15 min. Posteriormente se agregaron
6 mL de difenilamina agitando la
solucin y dejndola otros 10 min en el
bao
mara
hasta
observar
el
desarrollo de una coloracin azul que
indica la presencia de una 2desoxipentosa.
b) A 1 mL de la solucin de cido
nucleico se adicionaron 2 mL de cido
tricloroactico al 10 % y 2 mL del
reactivo de Bial colocando la solucin
en bao mara durante algunos
minutos hasta observar el desarrollo
de una coloracin verde que indica un
resultado positivo para la prueba.
Reaccin de Feulgen-Schiff: En un
tubo de ensayo se colocaron 2 mL del
reactivo de Schiff y se agregaron 2 mL
del hidrolizado colocando el tubo en un
bao mara durante 5 min hasta
observar
la
formacin
de
una
coloracin azul que indica un resultado
positivo para la prueba.
ANLISIS DE RESULTADOS
El mtodo de extraccin del ADN de
levadura permiti la obtencin de un
precipitado amarillo que present una
solubilidad apreciable en agua, debido
probablemente a la presencia de los
muchos grupos fosfato aninicos en la
molcula de ADN(3). El primer paso de
la extraccin permiti la ruptura de las
clulas de levadura por un medio
fsico, la friccin con arena. El SDS
utilizado como detergente permiti la
degradacin de los componentes
celulares para permitir la liberacin del
ADN.

El EDTA impide la precipitacin

temprana del ADN atrapando cualquier
ion presente en la solucin. En los
organismos eucariticos el ADN se
halla asociado con algunas protenas
llamadas histonas, estas protenas y
cualquier otro tipo de impurezas de
tipo
protico
pueden
ser
desnaturalizadas por la accin del
cloroformo,
separndose
de
las
molculas de ADN que permanecen en
la fraccin de alcohol isoamlico, estas
partculas
proteicas
pueden
ser
separadas del extracto de ADN por
medio del proceso de centrifugacin a
3000 rpm. Finalmente la adicin de
etanol (un disolvente con polaridad
media) permite la precipitacin del
ADN a partir del extracto obtenido por
medio de la centrifugacin, el ADN
obtenido por medio de este mtodo no
estar completamente purificado y
existirn fracciones considerables de
ARN y algunas otras impurezas
adheridas a l.
Los resultados obtenidos en las
pruebas de caracterizacin del ADN se
resumen en la Tabla 1:
Tabla 1. Resultados de las
pruebas de caracterizacin de
ADN.
Desoxipent
osas
a)
b)
+

Fosfat
os
+

FeulgenSchif
+

+ = positivo
- = negativo

La reaccin general que se presenta

en la prueba de fosfatos podra ser
representada de la siguiente manera:
O

O
R O P O

+ (NH4)2MoO4

R O P O NH4 + MoO42O NH4

O
O
R O P O NH4 + SnCl2
O NH4

O
R O P O
O

+ 2Cl

Sn

Azul

La reaccin produce un color azul

intenso al agregar el cloruro estannoso,
si se agrega una cantidad insuficiente
del reactivo no se formar el

compuesto con el estao y por tanto

no se apreciar el cambio de color en
la solucin, formndose una coloracin
verde-azul.
En la prueba de desoxipentosas la
reaccin a) que se realiz con
difenilamina en medio cido se podra
representar as:
HOH2C

OH

H+

H
N

(fucsina
bsica)
de
color
caracterstico(4).
En este caso, la
prueba positiva se evidenci por la
formacin de una coloracin violeta
intensa.
CONCLUSIONES

Complejo verde

OH
Difenilamina

-D-2-Desoxirribosa

Esta reaccin di un resultado

negativo para la muestra debido
probablemente a que el reactivo de
difenilamina
se
encontraba
contaminado, lo cual habra impedido
la
formacin
del
complejo
de
coloracin azul. Debido a esto fue
necesario utilizar otra prueba para
realizar la caracterizacin de la 2desoxipentosa. La prueba se realiz
en presencia del reactivo de Bial.
La prueba con el reactivo de Bial es
caracterstica para las pentosas. La
reaccin general que se presenta es la
siguiente:
HC O
CH2
HC OH

H+

HC O
C
CH

HC OH

CH

CH2OH

HC

2-D-desoxiribosa

Furfural

CH3
OH
O

Fe3+

CHO

Furfural

El extracto de ADN obtenido de la

muestra de levadura correspondi a
un slido de color amarillo de
apariencia coloidal que present
una solubilidad apreciable en agua.
Este extracto representa en su
mayor parte ADN, sin embargo, es
muy probable que esta muestra no
se encuentre totalmente pura y que
contenga cantidades considerables
de impurezas como ARN. Debido a
esto el mtodo presentado en la
presente
practica
podra
ser
utilizado como un mtodo de
extraccin inicial siendo necesarios
otros procedimientos de purificacin
(como utilizacin de enzimas) para
obtener un ADN mucho ms puro.
Las pruebas de caracterizacin de
ADN mostraron resultados positivos
en todos los casos excepto en la
prueba
de
reconocimiento
de
pentosas por medio de la reaccin
con
difenilamina
debido,
probablemente, a que el reactivo
utilizado
no
se
encontraba
completamente puro.

Complejo verde

OH
Orcinol

La reaccin de Feulgen-Schiff es una

prueba utilizada para la identificacin
de ADN. En general, consta de una
hidrlisis acida en presencia de un
cido mineral (comnmente HCl) para
eliminar las bases del ADN dejando los
extremos aldehdicos libres para que
estos puedan reaccionar formando un
complejo con el reactivo de Schiff

BIBLIOGRAFA
(1) Martnez, J. L. Extraccin de ADN.
Biologa:
Ciencias
Ambientales.
UNED. Mxico, 1985. Pg. 98
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Bioqumica Descriptiva.
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Edicin.
Addison
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Iberoamericana.
Mxico, 1998. Pg.
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(4) Stains, Microscopic. Schmidt, Ute. June
15, 2000. Ullmans Encyclopedia of
Industrial Chemistry. Willey VCH Verlag
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