LEVADURAS KILLER COMO

POTENCIALES AGENTES DE CONTROL

DE CONTAMINANTES DE BODEGAS PATAGONICAS
Christian A. Lopes 1,2,*; Marcela P. Sangorrín 1,*; Adriana R. Marongiú 1
y Adriana C. Caballero 1
1Departamento de Química, Laboratorio de Microbiología y Biotecnología, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional del
Comahue, Buenos Aires 1400 (8300) Neuquén, Argentina.
2Departamento de Biología Aplicada, Laboratorio de Microbiología Agrícola, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional
del Comahue. Cinco Saltos, Río Negro, Argentina.
*Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas de la República Argentina (CONICET)

Se conoce la existencia de cepas de levadura que producen toxinas que resultan inhibitorias para el desarrollo y metabolismo
de otras levaduras. Sobre esta base de conocimiento y sobre los conceptos del control biológico, se busca la utilidad de esta
característica particular con un enfoque beneficioso, que se constituya en una herramienta para la enología. Con este propó-
sito este trabajo evalúa el efecto de levaduras con característica killer sobre levaduras cuyo accionar resulta perjudicial para
la calidad del producto vino.
It's well known the existence of yeast strains that produce toxins with inhibitory effects on other yeast metabolism and deve-
lopment. According to this and the biological control concepts, the utility of this special characteristic is looked for, to genera-
te a beneficial tool for the enology. Based on this purpose, this work analyses the effect of yeasts with killer characteristic over
other yeast, which activity results prejudicial to the quality of wine product.

Palabras claves: Pichia anomala, biotipo killer, biocontrol,
Dekkera/Brettanomyces
Keywords: Pichia anomala, killer biotype, biological control,
Dekkera/Brettanomyces
Resumen
Levaduras pertenecientes a diferentes géneros habitantes
naturales de mostos de fermentación vínica y superficie de
equipamiento de bodegas, han sido asociadas desde hace
años al deterioro del vino debido a los efectos provocados
por las mismas en diferentes etapas del proceso fermenta-
tivo. Entre los géneros más ampliamente difundidos están
Dekkera/ Brettanomyces productores de etil-fenoles y res-
ponsables en muchas ocasiones de la pérdida total del vino
en el cual logran desarrollarse.
Bajo la premisa de que la utilización de cepas de levaduras
productoras de toxinas killer podría ser una herramienta útil
y efectiva en el control de las especies contaminantes, se
evaluó esta capacidad en 10 cepas killer de referencia y 55
aislamientos killer indígenas. Las levaduras contaminantes
utilizadas correspondieron a las especies Candida boidinii
(9 aislamientos), Hanseniaspora uvarum (21 aislamientos),
P. guilliermondii (2 aislamientos), Geotrichum silvicola (4
aislamientos) y a una especie no identificada (22 aislamien-
tos) aisladas de superficies de tanques de fermentación y
toneles de tres bodegas regionales y asociadas con algún
tipo de alteración en ensayos de laboratorio. Paralelamente
se evaluó el mismo panel de levaduras killer frente a siete
cepas de B. bruxellensis de colección. En general, se
observó que las cepas killer no-Saccharomyces indígenas
fueron capaces de arrestar el crecimiento o matar al 84%
de los aislamientos contaminantes, mientras que ninguna
de las 30 cepas killer indígenas de la especie S. cerevisiae
tuvo esa capacidad. Particularmente el aislamiento 3Mai5
de la especie P. anomala, presentó actividad killer frente al
71% de las cepas de Brettanomyces y la cepa killer de refe-
rencia Kluyveromices lactis var. drosofilarum (K10) fue la
única capaz de inhibir el desarrollo de los dos aislamientos
de P. guilliermondii indígenas. Los aislamientos indígenas
podrían presentar nuevas variantes de las toxinas que
resultarían de gran interés tanto en la industria vitivinícola
como en otras industrias biotecnológicas para el control de
contaminantes.
Introducción
Muchas especies de levaduras han sido relacionadas desde
hace años con el deterioro del vino. Este deterioro por parte
de levaduras puede ocurrir en distintas etapas durante la
producción del vino y puede relacionarse tanto con el des-
arrollo de los microorganismos, con la consecuente forma-
ción de películas o flóculos, como con la síntesis de altas

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concentraciones de compuestos indeseables como sulfuro rum con actividad killer frente a los aislamientos de P. gui-
de hidrógeno u otros volátiles sulfurados, ácido acético, lliermondii.
varios ésteres y fenoles volátiles (Fleet, 1998; Du Toit y
Pretorius, 2000). El almacenamiento de los vinos previo a su Materiales y Métodos
embotellamiento, que ocurre tanto en tanques de fermenta-
Levaduras killer
ción como en barricas o toneles, es un momento crítico para
el desarrollo de levaduras contaminantes. Se utilizaron 55 aislamientos killer indígenas (25 no-
Saccharomyces y 30 S. cerevisiae) y 10 cepas killer de refe-
Tanques de fermentación o barricas incompletos son hábi-
rencia (siete no-Saccharomyces y tres S. cerevisiae) (Tabla 1).
tats ideales para el desarrollo de levaduras oxidativas o
débilmente fermentativas productoras de películas en
superficie usualmente pertenecientes a los géneros
Candida y Pichia (ej. C. boidinii y P. membranifaciens). Estas
levaduras se han sociado a contaminaciones relacionadas
con una higiene inadecuada de los establecimientos
(Stratford, 2006). No obstante, los vinos pueden también ser
deteriorados por especies fermentativas de los géneros
Dekkera, Zygosaccharomyces, Saccharomyces y
Saccharomycodes. Sin dudas, especies del género
Dekkera (anomorfo Brettanomyces) representan el mayor
problema asociado a levaduras en la industria vitivinícola
debido a la producción de compuestos fenólicos volátiles
(Loureiro y Malfeito-Ferreira, 2003). Trabajos recientes tam-
bién relacionan a la especie Pichia guilliermondii como posi-
ble responsable del deterioro del vino debido a su capaci-
dad de producir una alta cantidad de compuestos fenólicos
volátiles en ensayos de laboratorio (Dias et al., 2003;
Martorell et al., 2006). Estudios en desarrollo están tratando
de elucidar si esta especie debería ser tenida en cuenta
como una levadura contaminante peligrosa en la industria
vitivinícola.

Muchos métodos de control han sido propuestos para pre-

venir la contaminación del vino con levaduras haciendo par-
ticular énfasis en los géneros Dekkera/ Brettanomyces; entre
estos métodos se incluyen una adecuada higiene de la
bodega, el sulfitado, y la filtración. Sin embargo, estos pro-
cesos pueden no ser muy efectivos particularmente durante
el añejamiento de los vinos. En la búsqueda de nuevas
estrategias de control, algunos autores han sugerido la utili-
zación de cepas de la especie S. cerevisiae seleccionadas o
genéticamente manipuladas portadoras de actividad killer
frente a levaduras contaminantes particulares (Shimizu,
1993; Du Toit y Pretorius, 2000). En este contexto, la búsque-
da de levaduras killer productoras de toxinas capaces de
inhibir el desarrollo de estos microorganismos indeseables
se vislumbra como una posibilidad interesante en enología.
De hecho, toxinas de las especies P. anomala y K. wicker-
Tabla 1: Identidad y origen de las levaduras killer usadas en
hamii han sido recientemente propuestas para el control de
este trabajo.
Dekkera/ Brettanomyces (Comitini et al., 2004) mientras que
toxinas de K. phaffi han demostrado ser útiles en el control Levaduras contaminantes
de levaduras apiculadas de los géneros Kloeckera/
Hanseniaspora (Ciani y Fatichenti, 2001). Se evaluó la sensibilidad killer de 58 aislamientos de levadu-
ras indígenas pertenecientes a cinco especies provenientes
Con el objetivo de desarrollar un eficiente sistema de biocon-
de superficies de tres bodegas Nor-Patagónicas designadas
trol basado en interacciones killer, se evaluó la capacidad de
en este trabajo EP, DV y HC (Figura 1). Asimismo se evaluó
10 cepas killer de referencia y 55 aislamientos de levaduras
la sensibilidad de 7 cepas de colección correspondientes a
killer indígenas de inhibir el crecimiento de levaduras relacio-
la especie contaminante B. bruxellensis.
nadas con la producción de efectos indeseables aisladas de
superficies de bodegas de la región Nor-Patagónica Todos los aislamientos evaluados mostraron capacidad
(Sangorrín et al., 2005). Paralelamente se evaluó la sensibili- potencial de producir algún tipo de alteración en vinos de
dad de cepas de B. bruxellensis de colección frente al acuerdo a ensayos previamente realizados a escala de
mismo panel de levaduras killer. Finalmente, se detectó un laboratorio (Tabla 2).
aislamiento killer indígena perteneciente a la especie P. ano-
Sensibilidad killer
mala con un amplio espectro killer frente a levaduras conta-
minantes particularmente frente a cepas de B. bruxellensis y La sensibilidad de cada aislamiento fue evaluada frente a las
una cepa de referencia de la especie K. lactis var. drosofila- cepas killer indígenas y de referencia, enumeradas en la

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Tabla 1. La evaluación de la sensibilidad killer se realizó por
inhibición de crecimiento en placas de Agar YEPD-MB (g l-1:
extracto de levadura 10, glucosa 20, peptona 20, agar 20,
azul de metileno 0.003) amortiguado a pH 4,5 con buffer
citrato-fosfato y adicionado con 0,003 % de azul de metileno
como lo describe Sangorrín et al. (2001). Se realizaron sus-
pensiones de cada levadura indígena (108 células/ml) y 0,1
ml de estas se sembraron como césped en la superficie del
medio de cultivo. Se dejó secar y a continuación se sembra-
ron estrías de las levaduras killer. Las placas se incubaron a
28ºC durante 72 hs.
Figura 1: Localización de las 3 bodegas estudiadas (DV, HC
y EP) en la región Nor-Patagónica (Región Vitivinícola Sur
Argentina). Zonas en gris oscuro: áreas cultivadas. Adentro:
Sudamérica- Argentina- Patagonia. Fuente: Instituto
Nacional de Vitivinicultura, Argentina.
Cada aislamiento indígena evaluado se consideró sensible
cuando alrededor de la estría de la cepa killer se observó un
halo de inhibición de crecimiento, generalmente acompaña-
do por un halo azul de células muertas. La ausencia del halo
de inhibición indicó resistencia del aislamiento a la toxina. Un
aislamiento fue considerado neutro (N) cuando mostró resis-
tencia a todas las cepas killer ensayadas. Los experimentos
fueron realizados por triplicado.
Resultados y discusión
Con el objetivo de seleccionar cepas killer capaces de lle-
var a cabo un biocontrol de cepas contaminantes indíge-
nas, se evaluó la sensibilidad de 58 aislamientos de leva-
duras contaminantes obtenidas de superficies de equipa-
miento de tres bodegas Nor-Patagónicas y pertenecientes
a las especies C. boidinii (9 aislamientos), G. silvicola (4 ais-
lamientos), H. uvarum (21 aislamientos), P. guilliermondii (2
aislamientos), una especie no identificada (22 aislamien-
tos) y siete cepas de B. bruxellensis de colección (Tabla 2)
frente a un panel compuesto por 10 cepas killer de referen-
cia y 55 aislamientos killer indígenas pertenecientes a dife-
rentes especies (Tabla 1). En general, en este trabajo se
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observa que la actividad killer de las cepas y aislamientos
del panel mostró variabilidad entre aquellos aislamientos
contaminantes pertenecientes a una misma especie, con
lo cual se aprecia el carácter cepa-especifico del compor-
tamiento killer.
ESPECIES
(Número de
aislamientos)
Candida
boidinii
(9)
Geotrichum
silvicola
(4)
Hanseniaspora
uvarum
(21)
Pichia
guilliermondii
(2)
Especie no
identificada
(22)
Brettanomyces
bruxellensis
(7)
Tabla 2: Levaduras contaminantes utilizadas en este trabajo y
efectos perjudiciales detectados en ensayos previos
(Sangorrín et al., 2005).
En cuanto a la actividad killer de las cepas de referencia, los
espectros más amplios de acción -osea la capacidad de
inhibir el desarrollo de un mayor porcentaje de especies con-
taminantes- los presentaron las cepas Saccharomyces
cerevisiae (K1), K. lactis (K10), Williopsis saturnus (K9) y
ambas cepas de P. anomala (K5 y K8) (Tabla 3). No obstan-
te, sólo dos de las 7 cepas de B. bruxellensis y ningún aisla-
miento de la especie G. silvicola presentó sensibilidad a
alguna de esas cepas killer (Tabla 3). Los dos aislamientos
de la levadura contaminante P. guilliermondii presentaron
sensibilidad únicamente frente a la cepa de referencia K.
lactis var. drosophilarum (K10). Esta especie contaminante
ha sido previamente detectada en fermentaciones vínicas en
la región Nor-Patagónica y potencialmente relacionada con
el aroma fenólico de los vinos resultantes (Lopes et al., 2006
enviado), con lo cual, podría ser una levadura contaminante
de gran relevancia en la región si se llegara a comprobar
esta influencia negativa en el vino.
En relación a los aislamientos killer indígenas evaluados,
ochenta y cuatro porciento de los mismos correspondientes
a especies no-Saccharomyces fueron capaces de matar o
arrestar el crecimiento de alguno de los 58 aislamientos con-
taminantes evaluados (Tabla 3). Por el contrario, ningún ais-
lamiento indígena de la especie S. cerevisiae mostró capa-
cidad killer frente a las cepas contaminantes (Tabla 3). Esto
demuestra el espectro restringido de acción de la/s toxina/s
producidas por la especie S. cerevisiae con respecto a las
otras especies killer, e indicaría que un cultivo iniciador per-
teneciente a esta especie con capacidad killer, y sin modifi-
caciones genéticas, no sería suficiente para combatir las
levaduras contaminantes en bodegas.
Tabla 3. Sensibilidad killer de los aislamientos indígenas provenientes de las superficies de equipos de bodegas y de cepas de
B. bruxellensis frente a levaduras killer indígenas y de referencia.

Por otra parte, únicamente los aislamientos indígenas

a)
correspondientes a las especies P. anomala y P. kluyveri
fueron capaces de inhibir el crecimiento de G. silvícola y lo
hicieron en alto porcentaje (75% en todos los casos). En par-
ticular, el aislamiento 13 correspondiente a la especie killer P.
anomala (3Mai5) mostró el espectro más amplio de activi-
dad killer y fue capaz de combatir el 71% de las cepas de B.
bruxellensis (Figura 2). Este resultado concuerda con repor-
tes previos donde se menciona el amplio espectro interge-
nérico de la toxina killer de esta especie (Magliani et al.,
1997). Debido a la capacidad de inhibir el desarrollo de un
amplio rango de microorganismos no emparentados, la
actividad de la toxina killer de P. anomala ha atraído enorme-
mente la atención (Magliani et al., 1997; Schmitt y Breinig, b)
2002). Se ha reportado el uso de esta u otras especies del
mismo género de levaduras en el biocontrol de levaduras
contaminantes en diversas industrias alimenticias tales
como la producción de aceitunas en salmuera (Llorente et
al., 1997; Santos et al., 2000), y más recientemente para el
biocontrol de B. bruxellensis en vino (Comitini et al., 2004). En
este trabajo, los cinco aislamientos de B. bruxellensis que
mostraron sensibilidad al aislamiento indígena P. anomala
3Mai5, fueron sin embargo resistentes a las toxinas produci-
das por las cepas de referencia de la misma especie. El
comportamiento killer del aislamiento indígena 13 de P. ano-
mala frente a las especies contaminantes, diferente al
observado en las dos cepas killer de referencia de la misma Figura 2: Espectros de actividad killer de levaduras pertene-
especie, podría indicar la presencia de una nueva toxina cientes a la especie P. anomala frente a las contaminantes de
killer en poblaciones indígenas de la especie P. anomala bodegas Nor-Patagónicas. A: cepas de referencia K5 y K8. B:
aislamientos indígenas 13, 14, 15 y 16.
(Figura 2).

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 Lauri en el word no está la tabla 5

Caracterización a nivel de cepas La relación entre el número de aislamientos y el número de

perfiles obtenidos, demuestra que las especies más diver-
Debido a que tanto la sensibilidad killer como la producción
sas resultaron H. varum y la especie no identificada, mien-
de efectos enológicamente indeseables fueron variables
tras que la que menor diversidad intrespecífica mostró fue
dentro de cada una de las especies estudiadas, se evaluó
G. silvicola (Tabla 5). Las especies de levadura H.
la diversidad intraespecífica de las levaduras con el objetivo
uvarum/K. apiculata son habitantes comunes de las etapas
de encontrar una relación entre la identidad al nivel de
iniciales de los procesos de fermentación vínica, superficie
cepas y los efectos causados por los aislamientos. Como
de uvas y de equipos de bodegas en la región Nor-
método de caracterización se empleó el biotipo killer, es
Patagónica (Lopes, 2004) y de muchas otras regiones pro-
decir los perfiles de sensibilidad frente al panel de cepas
ductoras de vino en el mundo (Schutz y Gafner, 1993; Torija
killer. Las diez cepas killer de referencia utilizadas en este
et al., 2001; van Keulen et al., 2003). Aún cuando el creci-
trabajo fueron propuestas como panel de levaduras killer en
miento controlado de estas especies de levaduras en los
varios trabajos científicos para la taxonomía de levaduras
estadios iniciales de la fermentación se ha asociado con un
basadas en los perfiles de sensibilidad (Vaughan-Martini et
impacto positivo sobre la complejidad química y la calidad
al., 1996; Boekhout y Scorzetti, 1997; Sangorrín et al.,
sensorial de los vinos, su capacidad de producir elevados
2002). En este trabajo, se utiliza un nuevo panel de levadu-
niveles de ácido acético las convierte en levaduras poten-
ras que incluye a representantes de especies que no están
cialmente relacionadas con el deterioro de los vinos (Ciani
incluidas en el panel de referencia (K1- K10) y que permiti-
y Maccarelli, 1998; Zohre y Erten, 2002). En este trabajo, el
rían tener resultados más exhaustivos en estudios de sensi-
38 % de lo de los aislamientos de H. uvarum presentó un
bilidad de diferentes aislamientos, tanto para análisis de
perfil de sensibilidad neutro (N), es decir ninguna cepa killer
diversidad como para control biológico de distintos microor-
del panel fue capaz de inhibir el crecimiento de los mismos
ganismos (Tabla 4).
(Tabla 4). Este resultado se corresponde con estudios pre-
vios realizados en nuestro laboratorio en los que se eviden-
cia un alto porcentaje de cepas neutras en las poblaciones
naturales de H. uvarum en la región Nor-Patagónica
(Sangorrín et al., 2001), lo cual sería una desventaja si se
desea controlar a esta especie utilizando como herramien-
ta la actividad killer.

Adicionalmente los resultados de la caracterización a nivel

de cepas muestran que en general, dentro de la misma
especie las cepas productoras de efectos enológicamente
indeseables son las mismas dentro de cada bodega, pero
no coinciden cuando los aislamientos provienen de distintas
bodegas (Tabla 4).

En resumen, todas las especies contaminantes evaluadas

en este trabajo fueron combatidas en mayor o menor pro-
porción por alguna de las cepas killer utilizadas en este tra-
bajo en ensayos en placa. La selección de la cepa killer a uti-
lizar dependerá de la cepa contaminante a controlar. En par-
ticular, el aislamiento killer indígena 1 de la especie P. ano-
mala y la cepa de referencia K. lactis var. drosophilarum
(K10) podrían utilizarse en el biocontrol de cepas de B. bru-
xellensis y P. guilliermondii respectivamente o frente a otras
levaduras contaminantes de relevancia regional, una vez
evaluada la actividad de las toxinas en condiciones de vinifi-
cación.

Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Universidad Nacional del
Comahue por medio del proyecto I-117, y el CONICET por
medio del subsidio 1104/04 y la beca postdoctoral otorgada
a C.A.L.

NDLR: Si desea contactarse con alguno de sus autores

Tabla 4: Número de cepas (N) de las especies aisladas de comuníquese con enologia@revistaenologia.com
bodegas según su perfil de sensibilidad a diez cepas killer de Puede consultar la bibliografía en
referencia (K1-K10) y las 25 aislamientos no-Saccharomyces www.revistaenologia.com
indígenas seleccionadas productoras de toxina killer.

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