EVALUACIN DE FUNCION HEPATICA

1.- DETERMINACIN DE BILIRRUBINA

MTODO COLORIMTRICO PARA LA DETERMINACIN DE BILIRRUBINA DIRECTA Y
TOTAL EN SUERO Y OTROS LQUIDOS BIOLGICOS
INTRODUCCIN
La bilirrubina, compuesto de degradacin de la hemoglobina, es captada por el hgado para su
conjugacin y excrecin en la bilis. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares
pueden provocar hiperbilirrubinemias. La eritroblastosis fetal o anemia hemoltica del recin
nacido es una patologa provocada por incompatibilidad materno-fetal en la que se produce
una destruccin excesiva de glbulos rojos. Esto resulta en un severo aumento de la
bilirrubina srica con el consecuente riesgo de difusin del pigmento al sistema nervioso
central, por lo que la determinacin de la bilirrubina en estos nios recin nacidos resulta
sumamente importante.
FUNDAMENTO
La bilirrubina reacciona especficamente con el cido sulfanlico diazotado produciendo un
pigmento color rojo-violceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimtricamente a 530 nm. Si
bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la
bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que
posibilite su reaccin. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no
conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafena al medio de
reaccin.
MUESTRA
Suero, plasma o lquido amnitico
a) Recoleccin: obtener suero o plasma de la manera usual. Proteger de la luz natural o
artificial, envolviendo el tubo con papel negro. Tambin es posible realizar la determinacin en
lquido amnitico.
b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, debe usarse heparina para su
obtencin.
c) Sustancias interferentes conocidas: hemlisis moderada o intensa inhibe la reaccin
directa, obtenindose valores de bilirrubina total falsamente aumentados. Referirse a la
bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente
fresca. En caso de no efectuarse el ensayo en el momento, el suero debe conservarse hasta
48 horas en el refrigerador (2-10C) y la sangre entera no ms de 24 horas en refrigerador o
12 horas a temperatura ambiente. El lquido amnitico es conveniente mantenerlo congelado
hasta el momento de efectuar el ensayo. La accin de la luz es capaz de destruir en una hora
hasta un
50% de la bilirrubina presente en la muestra. Es por tal motivo que debe protegerse
cuidadosamente.
VALORES DE REFERENCIA
Total
Adultos:
RN hasta 24 horas:
2 da:
3 da:
4 a 6 da:
Menor de 1 mes:

0,3 - 1,0 mg/dl

hasta 8,7 mg/dl
1,3 11,3 mg/dl
0,7 12,7 mg/dl
0,1 12,6 mg/dl
0.2 1,0 mg/dl

Directa

Adultos:
RN vara con los das:

menor que 0,1 mg/dl

hasta 0,6 mg/dl

Indirecta

Adultos:

menor que 1 mg/dl

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

La accin de la luz, tanto sobre los sueros como sobre las soluciones estndar, es capaz de
destruir en una hora hasta el 50% de la bilirrubina presente.
PROCEDIMIENTO
I- TECNICA PARA SUERO
En tres tubos de fotocolormetro marcados B (Blanco),
D (Directa) y T (Total) colocar:
Muestra (suero)
Agua destilada
Desarrollador
Reactivo Sulfanlico
Diazorreactivo

B
100 l
1,3 ml
-100 l

D
100 l
1,3 ml
--100 l

T
100 l
-1,3 ml
-100 l

ST1
50 l
-1,3 ml
-100 l

ST2
100 l
-1,3 ml
-100 l

Absorbancia
Mezclar de inmediato cada tubo por inversin. Luego de 5 minutos, leer en espectrofotmetro
a 530 nm o en fotocolormetro con filtro verde (520-550 nm), llevando el aparato a cero con
agua destilada.
Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos, excepto para la bilirrubina directa que
debe leerse a los 5 minutos exactos. Si se lee antes, habr subvaloracin de los resultados
por reaccin incompleta. Si se lee despus, habr sobrevaloracin porque comienza a
reaccionar la bilirrubina libre.
Sueros ictricos: debe emplearse la tcnica descripta pero con menores cantidades de
muestra, de acuerdo a la severidad de la ictericia. De tal forma, en caso de ictericia moderada
se usarn 50 l de suero mientras que frente a una ictericia intensa se requieren slo 20 l.
Multiplicar los resultados obtenidos por 3,79 y 9,38 respectivamente.
CALCULO DE LOS RESULTADOS
Calculo del factor:
Absorbancia Bilirrubina (mg/dl) blanco = Absorbancia corregida
Absorbancia corregida/concentracin = promedio de ambos tubos = K
Bilirrubina total (mg/l) = (T - B) / K
Bilirrubina directa (mg/l) = (D - B) / K
Bilirrubina libre (indirecta) = BRB total - BRB directa
Linealidad: la reaccin es lineal hasta 150 mg/l.
REACTIVOS PROVISTOS
Desarrollador: solucin acuosa de benzoato de cafena 0,13 mol/l, tamponada y estabilizada.
Nitrito de Sodio: solucin de nitrito de sodio 0,07 mol/l.
Reactivo Sulfanlico: solucin de cido sulfanlico 29 mmol/l y cido clorhdrico 0,17 mol/l.

INSTRUCCIONES PARA SU USO

Desarrollador: listo para usar.
Reactivo Sulfanlico: listo para usar.
Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo, mezclar 1 parte de Nitrito de Sodio con 21
partes de Reactivo Sulfanlico. Rotular y fechar.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente (< 25C) hasta la fecha de
vencimiento indicada en la caja.
Diazorreactivo: en refrigerador (2-10C) y en frasco de vidrio color caramelo es estable 3
meses a partir de la fecha de su preparacin.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS
La presencia de sedimento y/o cambio de coloracin de los reactivos, pueden ser indicio de
deterioro de los mismos.
Material de referencia:
Bilirrubina Standard: viales conteniendo, cada uno, 500 g de bilirrubina pursima segn
normas de la A.A.C.C. para una concentracin final de 100 mg/l.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Bilirrubina Standard: es estable a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento
indicada en la caja. Una vez reconstituido, es estable 30 das en el congelador o 5 das en el
refrigerador (2-10C). Resguardar de la luz conservndolo en su envase protector.
BIBLIOGRAFIA
-

Tietz, N.W. "Fundamentals of Clinical Chemistry". W.B.Saunders Co. Philadelphia 1976.

Botwell, J. H. - Clin. Chem. 10/3:197 (1964).
Watson, D. - Clin. Chem. 7/6:603 (1961).
Ichida, T.; Nobuoka, M. - Clin. Chim. Acta 19/2:249 (1968).
Zaroda, R. - Am. J. Clin. Path. 45/1:70 (1966).
OBrien, D. et al - Laboratory manual of pediatric microbiochemical techniques, Harper &
Row Pub - 4a Ed. (1968).
- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4 th

2.- DETERMINACIN DE TRANSAMINASAS

ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (ASAT O GOT)
ALANINA AMINOTRANSFERASA (ALAT O GPT)

INTRODUCCIN
ASAT O GOT: La aspartato aminotransferasa es una enzima bilocular (citoplasmtica y
mitocondrial) ampliamente difundida. Se encuentra en mayor concentracin en hgado y
corazn. Cualquier alteracin de estos tejidos produce un aumento en los niveles de AST
circulante. En el infarto agudo de miocardio, se observa un aumento moderado de la enzima a
las 6 u 8 horas de ocurrido el episodio, alcanza niveles mximos alrededor de las 48 horas y
retorna a la normalidad entre el 4 y el 6 da. En pacientes con afecciones hepticas se
observan las mayores elevaciones de AST, sobre todo en los casos de hepatitis con necrosis.
La determinacin de AST adquiere importancia diagnstica cuando sus valores se comparan
con los de otras enzimas de similar origen tisular, es decir que permite completar el
perfil enzimtico de rganos tales como corazn e hgado.
ALAT O GPT: La alanina aminotransferasa (ALT o GPT) es una enzima unilocular
(citoplasmtica) cuya mayor actividad se localiza en el tejido heptico. La destruccin o
cambio de permeabilidad de las membranas celulares provoca la liberacin de ALT a la
circulacin sangunea. Los mayores aumentos de actividad ALT en suero, se producen como
consecuencia de alteraciones hepticas. En el caso de hepatitis virales, el aumento de ALT
precede a la aparicin de ictericia, alcanzando un mximo luego de la observacin de dicho
sntoma. Si los valores permanecen elevados luego de 6 semanas, debe pensarse en la
posibilidad de una hepatitis activa o en el comienzo de una hepatitis crnica, por lo que es de
utilidad las determinaciones seriadas de la enzima. La determinacin de ALT adquiere
importancia diagnstica cuando sus valores se comparan con los de otras enzimas de similar
origen tisular, permitiendo as completar el perfil enzimtico de rganos como el hgado.
FUNDAMENTO
Las determinaciones se realizan acoplando la accin transaminasa a la accin de la enzima
MDH en el caso de ASAT (1) y a la accin de la enzima LDH en el de ALAT (2), en presencia
de NADH.
1.
L-Aspartato + -cetoglutarato

ASAT

Oxalacetato + NADH

Oxalacetato + Glutamato
MDH
Malato + NAD+

El l-aspartato reacciona con el -cetoglutarato en presencia de ASAT formndose oxalacetato

y glutamato. El oxalacetato producido es reducido por la enzima MDH con la consiguiente
oxidacin del NADH a NAD+.
2.
L-Alanina + -Cetoglutarato

ALAT

Piruvato + Glutamato
LDH

Piruvato + NADH

Lactato + NAD+

La l-alanina reacciona con el -cetoglutarato en presencia de ALAT formndose piruvato y

glutamato. El piruvato producido es reducido por la enzima LDH con la oxidacin del NADH a
NAD+.

En ambos casos la actividad enzimtica se mide determinando la disminucin de absorbancia

a 340 nm segn el NADH sea oxidado a NAD+.
MUESTRA
De preferencia utilizar suero libre de hemlisis o plasma. Descartar muestras con hemlisis
visible ya que se pueden obtener valores falsamente elevados. ASAT es estable a lo menos 7
das y ALAT a lo menos 3 das entre 2 y 8 C y ambas sobre 1 mes a 20 C.
RANGOS DE REFERENCIA:
ASAT: Hasta 25 U/L a 30C
Hasta 40 U/L a 37C
ALAT: Hasta 29 U/L a 30C
Hasta 45 U/L a 37C
PROCEDIMIENTO:
Tener el porta-cubetas del espectrofotmetro a la temperatura de reaccin (30 37 C). Llevar
a cero de absorbancia a 340nm con agua destilada.
En una cubeta agregar 1 ml del reactivo de trabajo de la enzima que desea determinar y
precalentar en el porta-cubetas por un mnimo de 5 min.
Agregar 0,1 ml de muestra, mezclar, incubar por 1 min y leer la absorbancia inicial (A1).
Repetir las lecturas a intervalos de 1 min, hasta por 4 min.
CLCULOS:
Determine el cambio de Absorbancia por min. (A/min.).
Actividad ASAT ALAT = A/min. x 1746
Vt x
1000
Factor = -------------------------------- = 1746
NADH340nm x P x Vm
donde
Vt = volumen total de la reaccin.
NADH340nm = coeficiente de extincin milimolar del NADH (6,3 mmol/l x cm).
P = espesor del paso de luz de la cubeta.
Vm = volumen de muestra utilizado.
OBSERVACIONES:
-Los volmenes de reactivo y muestra pueden ser alterados proporcionalmente de acuerdo al
espectrofotmetro utilizado.
-Si el A/min es mayor que 0,3 repetir el ensayo con la muestra diluida adecuadamente con
suero fisiolgico. El resultado obtenido se multiplica por la dilucin.
-Los rangos normales deben informarse de acuerdo a la temperatura a la cual se realiza el
ensayo.
REACTIVOS:
-Reactivo 1 ASAT: Buffer fosfato pH 7,7 (25C)
-cetoglutarato
l-aspartato
LDH
1500 U/L
-Reactivo 1 ALAT: Buffer fosfato pH 7,5 (25C)
-cetoglutarato
l-alanina
LDH
-Reactivo 2 ASAT y ALAT: NADH

80 mM
15 mM
200 mM
MDH
80 mM
15 mM
600 mM
2500 U/L
5 mM

800 U/L

-Reactivo de trabajo: Mezclar 4 partes de reactivo 1, correspondiente a la enzima a

determinar, con una parte de reactivo 2 (Sustrato). Verificar de acuerdo al Kit respectivo.
Este reactivo de trabajo es estable 15 das entre 2-8C, 5 das a temperatura ambiente.
Descartar el reactivo si su absorbancia contra blanco de agua destilada es menor de 0,8 a 340
nm.
BIBLIOGRAFA
- Tietz, N.W. (ed.) Fundamentals of Clinical Chemistry W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1976.
- Henry, R.J. Clinical Chemistry: Principles and Technics. Harper and Row Publishers. New
York, 1964.
- Provisional Recommendations on IFCC methods for the measurement of catalytic
concentrations of enzymes. Clin. Chem. 23(887), 1977.