LANASEVE

Rige a partir de:

30/03/11

Cdigo:
IA-MBA-PE-014

Manejo y mantenimiento de cultivos de referencia

Versin 04

Pgina 1 de 5

Elaborado por: Coordinador Tcnico de Seccin

Revisado por: Analista

Aprobado por: Jefe de Seccin

1. Objetivo
Describir un procedimiento para la manipulacin y mantenimiento de cultivos de referencia que garanticen la
pureza, estabilidad y viabilidad de los microorganismos de referencia utilizados durante el trabajo analtico.
2. Alcance
Aplica a los cultivos que constituyen la coleccin de referencia del laboratorio.
3. Responsabilidad y Autoridad
El Jefe de seccin debe velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento.
El Coordinador Tcnico de Seccin debe supervisar el cumplimiento de las normas establecidas en este
procedimiento.
El analista debe ejecutar las actividades descritas en este procedimiento.
4. Definiciones
Cultivo de referencia certificado: cultivos provenientes de una coleccin de cultivos reconocida nacional y/o
internacionalmente, acompaada de un certificado, que especifique las caractersticas fenotpicas y genotpicas.
Cultivo de reserva: cultivo obtenido a partir de la reactivacin y resiembra de un cultivo de referencia certificado
y mantenido como una fuente para la preparacin de cultivos de trabajo.
Cultivo de trabajo: son subcultivos obtenidos de un cultivo de reserva destinados al uso como control en el
trabajo diario.
5. Abreviaturas y/o Siglas
No aplica
6. Referencias
IA-MBA-PE-014-RE-001 Lista de cepas de referencia
IA-MBA-PE-014-RE-002 Control Interno de Cepas de Referencia
IA-MBA-PE-014-RE-003 Transferencia peridica de cepas de trabajo
Garanta de la calidad de los laboratorios de microbiologa de alimentos
Manuales para el control de calidad de los alimentos.

7. Fundamento Terico
Los laboratorios de microbiologa deben tener cultivos de referencia certificados por una(s) coleccin(es) de
cultivo(s) reconocida(s) nacional o internacionalmente. Estos cultivos de referencia deben ser manipulados y
preservados de forma tal que sus caractersticas fenotpicas y genotpicas originales permanezcan inalteradas.
El procedimiento se fundamenta en la reactivacin de los cultivos de referencia certificados (liofilizados o
congelados), a travs de la utilizacin de medios de cultivo especficos, incubando a la temperatura y tiempo
establecido para cada microorganismo.
Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versin impresa es una copia no controlada

LANASEVE

Rige a partir de:

30/03/11

Cdigo:
IA-MBA-PE-014

Manejo y mantenimiento de cultivos de referencia

Versin 04

Pgina 2 de 5

Elaborado por: Coordinador Tcnico de Seccin

8.

Revisado por: Analista

Aprobado por: Jefe de Seccin

Materiales, Medios de cultivo y Reactivos

8.1 Materiales
vortex
pipetas graduadas de 1-2 ml
papel parafilm
Criotubos de 2,0 ml estriles
Aplicadores de madera o perlas de vidrio
8.2 Medios de cultivo y Reactivos
Agar tripticasa soya
Agar tripticasa soya + 10 % NaCl
Caldo casaminocidos
Caldo infusin cerebro corazn
Caldo nutritivo
Caldo tripticasa soya
Caldo tripticasa soya 10 % NaCl
Glicerol al 10 % - 20 % - 50 %- 80 %
Parafina o aceite mineral estril
Set de reactivos para tincin de Gram
9. Procedimiento
9.1 Reactivacin del cultivo de referencia
9.1.1

Registrar en IA-MBA-PE-014-RE-001 Lista de cepas de referencia. Reactivar los cultivos de

referencia certificados (liofilizados o congelados), siguiendo las instrucciones indicadas por el
proveedor.

9.1.2

Preparar subcultivos en fase estacionaria, en tubos de agar tripticasa soya e incube a la temperatura
y tiempo adecuado.

9.1.3

Subcultivar en medio slido y lquidos selectivos y no selectivos.

9.1.4

Registrar las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas (utilice mtodos convencionales y/o rpidos
para la identificacin de microorganismos).

Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versin impresa es una copia no controlada

LANASEVE

Rige a partir de:

30/03/11

Cdigo:
IA-MBA-PE-014

Manejo y mantenimiento de cultivos de referencia

Versin 04

Pgina 3 de 5

Elaborado por: Coordinador Tcnico de Seccin

Revisado por: Analista

Aprobado por: Jefe de Seccin

Nota: si las caractersticas del cultivo no cumple con las especificaciones, descrtelo y comunquelo a la
institucin de origen.
9.1.5

Elaborar cultivos de reserva a partir del cultivo obtenido en el punto 9.1.2 y preservar segn los
mtodos descritos en el punto 9.2. Se deben rotular con el nombre del microorganismo, nmero de
identificacin (ATCC) y fecha. Mantener los registros del nmero de cultivos de reserva preparados
por lote.

9.1.6

Elaborar los cultivos de trabajo subcultivando uno de los cultivos de reserva. Identificar con el
nombre del microorganismo y el nmero de lote.

9.1.7

Registrar la informacin en el formulario IA-MBA-PE-014-RE-002 Control Interno de Cepas de

Referencia.

9.2. Mtodo de preservacin: Congelacin

9.2.1

Preparar dos o ms repiques del cultivo de referencia certificado, en medio slido e incube por el
tiempo y temperatura apropiados para el microorganismo procesado. La cantidad de placas y/o
tubos de agar no selectivo a obtener a partir de la cepa de referencia estar relacionado con la
cantidad de crioviales que se necesiten almacenar.

9.2.2

Aadir 2,0 ml del agente crioprotector estril (caldo BHI con glicerol 20%, caldo nutritivo con glicerol
50% o glicerol al 10 %) al cultivo.

9.2.2 Raspar la superficie del cultivo, utilice un aplicador de madera o perlas de vidrio estriles para preparar
una suspensin de por lo menos 10 7-108 ufc / ml.
9.2.3 Dispensar alcuotas de 0,1 - 0,2 ml en criotubos de 2,0 ml estriles previamente rotulados con los
datos del cultivo.
9.2.4 Colocar los tubos inmediatamente a las temperaturas de congelacin. Cuando el laboratorio no
dispone de equipos que alcancen temperaturas de -70, las suspensiones deben elaborarse en caldo
nutritivo con 50% de glicerol para que puedan ser almacenadas a -20 C.
9.2.5 Si el almacenamiento utilizado es de 70 C, se puede realizar la congelacin en dos pasos, primero a
- 20 C y luego a - 70 C, para evitar choque trmico.
9.2.6 En el caso de la cepa de Vibrio cholerae , inocular un tubo que contiene 10 ml de caldo + 10 % NaCl,
incubar 35 C durante 6-12 horas. Aadir 2 ml del caldo a un criotubo + glicerol 80 % estril y
congelar a 70 C . Se deben hacer subcultivos cada 6 meses.
Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versin impresa es una copia no controlada

LANASEVE

Rige a partir de:

30/03/11

Cdigo:
IA-MBA-PE-014

Manejo y mantenimiento de cultivos de referencia

Versin 04

Pgina 4 de 5

Elaborado por: Coordinador Tcnico de Seccin

Revisado por: Analista

Aprobado por: Jefe de Seccin

9.2.7 Para Campylobacter jejn, inocular un tubo de 10 ml de casaminocidos e incubar a 41 C -44 C

durante 48 horas. Luego colocar 2 ml en un criovial y aadir glicerol 10-20 %; congelar a 70 C. Se
deben hacer subcultivos cada 6 meses.
9.2.8 Realizar controles de viabilidad: cultivar el microorganismo en medios nutritivos antes y despus del
proceso.
9.3
9.3.1

Mtodo de preservacin: Temperatura ambiente

Preparar los repiques del cultivo de referencia certificado en tubos tapa de rosca, rotulados y con
medio slido de agar tripticasa de soya e incube por el tiempo y temperatura apropiados para el
microorganismo procesado.

9.3.2

Luego de incubar, aadir una capa de aceite mineral o parafina estril que cubra todo el cultivo hasta
1,0 cm por encima de la superficie del agar.

9.3.3

Sellar el tubo con papel parafilm y almacene a temperatura ambiente.

9.3.4

Realizar controles peridicos de pureza y viabilidad.

9.4
9.4.1

Transferencia peridica
Preparar subcultivos del cultivo de referencia certificado en tubos tapa de rosca, con medio agar
tripticasa soya.

9.4.2

Incubar por el tiempo y temperatura apropiados para el microorganismo procesado.

9.4.3

Mantener entre 4 C 8 C. Realizar controles peridicos de pureza y viabilidad

9.4.4

En el caso de Vibrio cholerae inocular un tubo de agar de tritpticasa soya + 10 % NaCl, hacer una
incisin profunda en el medio. Desenroscar los tubos e incubar a 35 C durante 24 2 horas Luego
enroscar los tubos y almacenar a 4 C.

9.4.5

Para la cepa de Campylobacter jejuni

se debe inocular un tubo

de 10

ml de caldo

casaminocidos e incubar a 41 C -44 C durante 48 2 horas en atmsfera microaeroflica (jarra).

Luego se raya en placas de agar sangre e incubar a 41 C -44 C durante 48 horas en jarra. Guardar a
4 C.
9.4.6

Registrar la informacin en el formulario IA-MBA-PE-014-RE-003 Transferencia peridica de cepas de

trabajo.

Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versin impresa es una copia no controlada

LANASEVE

Rige a partir de:

30/03/11

Cdigo:
IA-MBA-PE-014

Manejo y mantenimiento de cultivos de referencia

Versin 04

Pgina 5 de 5

Elaborado por: Coordinador Tcnico de Seccin

Revisado por: Analista

Aprobado por: Jefe de Seccin

10. Medidas de Bioseguridad

Para realizar este procedimiento de forma segura es necesario seguir las normas bsicas de bioseguridad que
se aplican en los laboratorios de microbiologa para laboratorios de nivel NB-2 Potencial Moderado, teniendo en
cuenta que se trabaja con microorganismos vivos, para lo cual es indispensable el uso de todos los equipos y
materiales de proteccin personal, previniendo los siguientes riesgos:
Biolgicos: auto-inoculacin accidental, invasin a travs de la piel, inhalacin de aerosoles.
Fsicos: cortaduras, quemaduras.
Qumicos: inhalacin de aerosoles, absorcin por la piel y mucosas.
10. Anexos
No aplica

Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versin impresa es una copia no controlada