CONSTRUO DE UMA RETA PADRO DE PROTENAS

Relatrio 2

Turno: P4

Grupo: 2

Autores: Letcia Vitorino (10150328), Liliana Gomes (10150), Mara Pitrez

(10150348), Maria Ins Oliveira (10150367)
Data de entrega: 14/03/2015

I. Introduo terica e objetivos

O trabalho laboratorial permitiu-nos a construo de uma retapadro para protenas bem como analisar a diferena entre uma reta
deste tipo e curva de calibrao.
A reta-padro d-nos o intervalo de linearidade em que o nosso
estudo vlido, enquanto que uma curva de calibrao a unio de
vrios pontos considerando todas as variaes.
A preparao das solues-padro que nos vai permitir a
construo desta reta, sendo que uma soluo-padro aquela cuja
concentrao conhecida e como tal permite a construo de um
grfico de absorvncia por concentrao do qual acedemos reta e
sua respetiva equao.
O

mtodo

utlizado

foi

novamente

mtodo

da

espectrofotometria. O espectrofotometro um instrumento de

anlise, capaz de medir a quantidade de luz absorvida por
determinada amostra. O resultado deste mtodo um grfico,
conhecido de espectro, cujos valores permitiram-nos da aula anterior
retirar que 595 nm o comprimento de onda timo de absorvncia da
protena BSA, sendo por isto, o comprimento de onda que vamos usar
neste trabalho laboratorial.
Os componentes principais do espectrofometro so:

- Fonte de luz: o espectrofotmetro pode ser composto por uma

ou duas lmpadas que podem ser de deuretrio emitindo radiao UV
e a outra de tungstnio e emitir luz visvel.
- Monocromador: os aparelhos mais antigos podem possuir um
prisma monocromador, mas os mais modernos possuem dispositivos
que transformam a luz incidida em vrios comprimentos de onda num
s, a luz monocromtica.
- Cuvete: recipiente que contm a amostra em anlise que
dever de ser de quartzo quando houver a necessidade de trabalhar
com UV.
- Detetor: dispositivo que deteta a frao de luz que passou
pela cuvete e transfere esse valor para o ecr do aparelho.
A espectrofotometria est fundamentalmente ligada Lei de
Lambert-Beer:
A= cl, onde: A a absorvncia; o coeficiente de extino
molar; l o comprimento da cuvete.
Baseando-nos nesta lei, podemos concluir que a absorvncia
diretamente proporcional concentrao da soluo oque implica
tambm que para uma soluo mais concentrada haja maiores
valores de absorvncia e

de forma semelhante, quanto maior a

distncia tambm maior ser a absorvncia.

II. Resultados
Branco

Padro 1

Padro 2

Padro 3

Padro 4

Concentrao (g/ L)

0,01

0,02

0,04

0,07

Absorvncia (A)

0,477

0,834

1,277

1,594

Dados:

Reta- padro de protenas

f(x) = 21.76x + 0.23
R = 0.91

Grfico:

Grfico 1 - reta - padro de protenas

Clculo das concentraes:

[Soluo padro ]inicial=0,5 g /L

Vf ( Soluo padro ) =1150 L

Padro 1
Ci V i =Cf V f
C f (Soluo padro)=

0,5 25
=0,01 g/ L
1150

Padro 2
Ci V i =Cf V f
C f (Soluo padro)=

0,5 50
=0,02 g /L
1150

Padro 3
Ci V i =Cf V f
C f (Soluo padro)=

0,5 100
=0,04 g /L
1150

Padro 4
Ci V i =Cf V f
C f (Soluo padro)=

0,5 150
=0,07 g /L
1150

III. Discusso e consideraes finais

O principal objetivo desta atividade laboratorial foi a construo
de uma reta padro para protena BSA (Bovine serum albumin). Para
a sua construo utilizmos vrios mtodos, mais especificamente o
mtodo de espectrofotometria e o mtodo de Bradford (j falado no
relatrio anterior).

A espetrofotometria uma tcnica de anlise qumica que

estuda a interao entre a energia radiante e a matria. Este mtodo
qualitativo e tambm quantitativo, uma vez que permite a
substncia presente numa dada soluo e tambm a quantidade
desta. Este mtodo baseia-se na absoro ou emisso de energia por
parte da substncia em estudo. Quando a radiao monocromtica de
determinado comprimento de onda atravessa uma soluo, a energia
emitida pela soluo, vai ser menor do que aquela que incidiu sobre
esta. A esta intensidade de radiao chamamos de absorvncia, que
uma caracterstica que esta diretamente relacionada com a
natureza da amostra, a sua capacidade de absorver radiao assim
como com a sua concentrao na soluo e a espessura do recipiente
onde est contida (l). Estas relaes so traduzidas pela lei de
Lambert-Beer. Com base nesta lei, temos que: A = E I c, em que A a
absorvncia, E o coeficiente de extino (constante caracterstica
de cada espcie qumica), I o trajeto tico da luz e, por fim, c a
concentrao.
O coeficiente de extino E, uma caracterstica de cada
substncia e depende tambm do solvente em que est dissolvido, da
temperatura e do comprimento de onda utilizado. Devido a sua
grande especificidade, por vezes, no possvel verificar os valores
tablados para esta grandeza, o que impede de utilizar a lei de
Lambert-Beer diretamente para obter a concentrao da sustncia.
Por conseguinte recorremos a elaborao de uma reta-padro, o
objetivo desta atividade prtica. Esta reta vai representar vai
representar a lei de Lambert-Beer a partir dos valores de absorvncia
obtidos de solues -padro da protena em estudo. O grfico
resultante ter no eixo das ordenadas os valores de Absorvncia
obtidos e no eixo das abcissas a concentrao. O declive desta reta
corresponde constante de proporcionalidade.
Outro objetivo desta atividade laboratorial foi verificar que a
absorvncia

de

uma

soluo

diretamente

proporcional

concentrao do soluto, segundo a Lei de Lambert-Beer. de

salientar que a absorvncia tanto maior quanto maior for a
distncia percorrida, no nosso caso a distncia percorrida foi igual a 1
cm.
Para calibrar (zerar) o espectrofotmetro foi necessrio
utilizar uma soluo ausente de protena (varivel dependente em
estudo) que se designa de branco. Esta soluo contm apenas
reagente de Bradford e gua destilada.
Procedemos apenas realizao de um branco aquando do
momento inicial visto que o comprimento de onda utilizado foi o
mesmo para todas as solues.
Para melhorar significativamente os resultados seria favorvel
fazer um mnimo de 8 solues-padro, no entanto por ns foram
apenas elaboradas 4 solues-padro (todas com concentraes de
protena BSA diferentes). Estas solues foram preparadas com
micropipetas o que permitiu o rigor das suas preparaes. Os
reagentes utilizados foram: gua destilada, corante azul de Comassie
e protena BSA.
Como referido no relatrio anterior o corante de Azul de
Comassie

forma complexos com a protena BSA em soluo,

apresentando uma cor acastanhada. Esta propriedade explica o

degrad que se verificou nas diferentes solues-padro, como
podemos verificar na imagem que se encontra nos resultados. Uma
maior concentrao de protena BSA em soluo permite tambm a
formao de uma quantidade maior de complexos que se foram entre
a protena e o corante. Podemos concluir portanto que quanto maior
for a quantidade de protena em soluo, mais aparente ser a
colorao azulada da soluo.
No que toca utilizao do uso do espectrofotmetro, devemos
ter alguns cuidados para assim evitar o mximo de erros de leitura
que

comea

na

calibrao

deste

seguindo

as

instrues

recomendadas, na certificao se o equipamento est fechado ou no

aquando da leitura, pois a luz ambiente interfere com os resultados.
Com base nos dados obtidos na atividade laboratorial anterior,
constatamos que o comprimento de onda ideal para a substncia
analisada (BSA) de 595nm, por esta razo, este foi o valor escolhido
nesta experincia.
Medimos ento a absorvncia, no espectrofotmetro, para cada
soluo padro. Com os resultados obtidos contrumos a reta-padro
para a protena BSA: 21,758x + 0,2272 em que 21,758 o declive da
reta e portanto a contante de proporcionalidade da protena BSA.
importante referir que teoricamente esta reta devia passar na origem
uma

vez

que

utilizmos

branco

como

soluo-padro.

Possivelmente, devido as condies em que ocorreram a preparao

das solues poderia haver erros de leitura uma vez que o
espetrofotmetro bastante sensvel.
Atravs da reta-padro obtida obtivemos tambm o coeficiente
de correlao: 0,9131. O coeficiente de correlao permite-nos
verificar se o modelo utilizado eficaz ou no e deve variar entre 0 e
1. Com base nos nossos resultados verificamos que o modelo da
nossa reta-padro consegue traduzir eficazmente os resultados
obtidos.
Podemos concluir que o objetivo desta atividade prtica foi bem
sucedido uma vez que o coeficiente de correlao foi prximo de 1.
Este trabalho permitiu tambm a familiarizao com a tcnica
da espectrofotometria e um dos mtodos colorimtricos mais
utilizados o mtodo de Bradford.