Fagocitosis

Alatorre E, Escobar DG, Eslendy L, Gutierrez LS Rodrguez NE, Romero V

Objetivos
General:

Observar si la administracin de etanol en las clulas blancas sanguneas

disminuye sus capacidad de fagocitosis contra un agente patgeno
(levadura de Cndida Albicans) teniendo una muestra de control sin etanol.

Particulares:

Comparar el nmero de clulas encontradas en la muestra de control y en

la experimental.

Identificar si las clulas de cada una de las muestras fagocitaron alguna

levadura de Cndida Albicans

Si las clulas fagocitaron levaduras, hacer el conteo de estas y comparar

los resultados entre ambas muestras.

Introduccin
La fagocitosis representa la forma ms primitiva de defensa del husped
(respuesta inmune natural), en el cual una cantidad de clulas especializadas del
organismo (leucocitos) ingieren y digieren a cuerpos extraos para su nutricin o
para ser eliminados, mediante la produccin de agentes qumicos y enzimticos
(microbicidas).1
Es un grupo celular muy relacionado con los macrfagos aunque son
consideradas una lnea celular independiente. Se llaman as por su semejanza
con las dendritas neuronales, pero no estn relacionadas en modo alguno con el
sistema nervioso a pesar de que ambas tienen muchas proyecciones espiculares
en su superficie. Estas clulas dendrticas actan como conexin entre los
sistemas inmunes innato y adaptativo, pues presentan antgenos a las clulas T4.
Su funcin fagocitaria la llevan a cabo en los tejidos que estn en vnculo con el
medio externo y estn ubicados principalmente en la piel, la nariz, los pulmones, el
estmago y los intestinos1.
Las clulas fagocticas polimorfonucleares son clulas implicadas en el equilibrio y
el mantenimiento del organismo los encontrados normalmente en la sangre,
migran hacia el lugar de la lesin, siendo as el tipo ms comn de fagocitos,
durante la fase aguda de la inflamacin, particularmente en el caso de las
infecciones bacterianas, por lo que son los protagonistas en el control y
eliminacin de agentes patgenos. 1

Los macrfagos y neutrfilos en ocasiones tienen la capacidad de englobar

bacterias o sustancias extraas directamente. La presencia de opsoninas facilita la
ingestin de la bacteria mediante el recubrimiento denominado opsonizacin. Se
han identificado dos tipos de opsoninas la Ig G (sub tipo 1 y sub tipo 3) y el
complemento C3b, las partculas opsonizadas se fijan a dos receptores de
superficie de neutrfilos o macrfagos, Fe y C3b respectivamente. La opsonizacin
puede llevarse a cabo mediante tres mecanismos: Los anticuerpos solos pueden
actuar como opsoninas; los anticuerpos ms el antgeno, pueden activar la va
tpica del complemento para producir opsonina; la opsonina puede elaborarse
mediante un sistema termo lbil, en que la inmunoglobulina y otros factores activan
el C3 mediante la va alterna. 3
Tras la adherencia tiene lugar la ingestin. En este proceso la membrana
citoplasmtica del fagocito emite unas proyecciones denominadas seudpodos
que engloban al microorganismo. Una vez rodeado el patgeno los pseudpodos
se renen, se fusionan y los encierran en una bolsa conocida como fagosoma o
vescula fagoctica. La membrana fagosmica contiene enzimas que bombean
protones (H+) en el fagosoma, lo que reduce el ph cerca de 4. A este Ph se
activan las enzimas hidrolticas. En esta fase de la fagocitosis el fagosoma se
separa de la membrana citoplasmtica y penetra en el citoplasma, en cuyo interior
entra en contacto con los lisosomas que contienen enzimas digestivas y
sustancias bactericidas. Tras el contacto las membranas del fagosoma y del
lisosoma se fusionan para formar una estructura nica y ms grande denominada
fagolisosoma. El contenido del fagolisosoma tarda slo de 10 a 30 minutos para
destruir la mayora de los tipos de bacterias. Entre las enzimas lisosmicas que
atacan directamente a las clulas microbianas se encuentra la lisozima, que
hidroliza el peptidoglicano de las paredes celulares bacterianas. Otras enzimas,
como las lipasas, las proteasas, la ribonucleasa y la desoxirribonucleasa,
hidrolizan distintos componentes macromoleculares de los microorganismos. Los
lisosomas tambin contienen enzimas que pueden elaborar productos del oxgeno
txicos como el radical superxido, el perxido de hidrgeno, el oxgeno singulete
y el radical hidroxilo. Los productos txicos del oxgeno se forman a travs de un
proceso como estallido respiratorio. 4
Mediante estudios clnicos y experimentales se ha demostrado que el alcohol es un
frmaco inmunomodulador que aumenta la susceptibilidad del husped a contraer
infecciones por la induccin de factores especficos innatos y la respuesta celular. 1

Numerosos trabajos han demostrado que el consumo de alcohol suprime la

respuesta del sistema inmunitario innato e incrementa el riesgo de padecer

infecciones (Boe et al., 2003; Goral and Kovacs, 2005; Quinton et al., 2005;
Szabo, 1999; Szabo and Mandrekar, 2009).De hecho, el tratamiento agudo de
alcohol disminuye la activacin de la va de sealizacin de los receptores TLR en
macrfagos humanos y de ratn, suprimiendo la activacin de p38, ERK, NF- B
e inhibiendo la produccin de citocinas (Goral and Kovacs, 2005; Mandrekar et al.,
2002; Pruett et al., 2004c). El etanol tambin inhibe la activacin de los receptores
TLR4 y TLR3, afectando a los mecanismos de defensa de los macrfagos frente a
diversos microorganismos (Dai etal., 2005; Pruett et al., 2004a).
El alcohol aguda suprime la capacidad del sistema inmune para eliminar Streptococcus
pneumoniae, agrava sepsis, y aumenta el riesgo de complicaciones en el trauma y
queman pacientes2
El etanol tambin suprime lipopolisacrido (LPS) inducida por el factor nuclear-B (NF-B) la
unin a ADN, interfiere con la produccin de la citoquinas pro-inflamatorias: factor de
necrosis tumoral (TNF-) Y la IL-6 en ambos macrfagos, perjudicando la funcin de las
clulas dendrticas.3 La sealizacin se inicia mediante receptores TLR receptores de
reconocimiento de patrones expresado en las clulas del sistema inmune innato, estos
tienen receptores para IL-1. Para poder dar una respuesta de sealizacin.
Todo esto se da en una reaccin de fase aguda del consumo de alcohol, pero en una fase
crnica hay un dao inflamatorio en hgado y cerebro. 4 Se ha encontrado que balsas de
lpidos provocan una perturbacin en los receptores y la sealizacin 5 en el cerebro y en
el hgado.
El estallido respiratorio es el proceso por el cual se producen en los macrfagos y los
PMN los intermediaros reactivos del oxgeno ROI, como el anin superxido, el radical
hidroxilo y el perxido de hidrgeno en los macrfagos y los leucocitos
polimorfonucleares. El estallido respiratorio est mediado por la enzima oxidasa del
fagocito y lo desencadenan habitualmente mediadores inflamatorios, como el LTB4, el
PAF y el TNF, o productos bacterianos, como los pptidos N-formilmetionil.6
La presencia de oxgeno es un requisito vital para la destruccin y digestin de los
agentes patgenos por los fagocitos, pero no es necesaria para la fagocitosis misma.
Cantidades considerables de oxgeno se consumen en el estallido respiratorio.7
Los leucocitos polimorfonucleares (PMN), son movilizados a los sitios de inflamacin
donde destruyen a los agentes invasores, mediante la liberacin de radical superxido,
especies reactivas del oxgeno derivadas y enzimas proteolticas.7
Los PMN adquieren la capacidad de producir especies activas de oxgeno (ROS) cuando
experimentan la activacin. Este fenmeno se caracteriza por el aumento sbito del
consumo de oxgeno (O2), antes citado, no asociado al transporte electrnico
mitocondrial, catalizado por el sistema NADPH-oxidasa y denominado "estallido
respiratorio".2 Los mecanismos utilizados para la eliminacin de agentes patgenos por
los fagocitos se dividen en dependientes (ROI dependientes) e independientes (ROI
independientes) de radicales libres de oxigeno; en cuanto a la destruccin de patgeno o

material fagocitado, es indispensable la produccin de radicales libres de oxgeno en el

fagocito activado para ejercer su fase efectora y provocar la muerte de las bacterias
fagocitadas y la fragmentacin de material ingerido. Las clulas fagociticas dependen de
NADPH oxidasa (ion superxido) tienen actividad antimicrobiana directa.8

Hiptesis
De una muestra de sangre de una compaera del equipo, las clulas blancas sin
administracin de alcohol presentarn un mejor mecanismo de fagocitosis que las
clulas blancas a las que se les administre alcohol al ser expuestas a levaduras
de Cndida Albicans.

Material y mtodos

1. Tomar una muestra de sangre de 10ml con una jeringa estril de 10 ml.
2. Se coloca la muestra en un tubo estril de tapn de rosca de 16x100 que
contiene 4 perlas de vidrio
3. Agitar el tubo de tapn de rosca, inclinndolo hacia el tapn, para evitar que
el tubo se rompa por la friccin de las perlas (desfibrilar la sangre y evitar
que se coagule)

4. Sacar la sangre desfibrinada con una pipeta Pasteur y se coloca en un tubo

estril de tapn de gasa 13x100.

5. Repartir en 2 tubos estriles de tapa de gasa (aproximadamente 5 ml de

sangre en cada
uno). Un tubo de
control y uno
experimental.

6. A la muestra
experimental se
le agrega alcohol
del 96%-3gr. de
alcohol
7. En la caja de
Petri colocar en
el fondo el papel absorbente y agregar solucin salina estril (cmara
hmeda). Con una micropipeta de 100 a 1000 l de capacidad, se coloca
1ml de sangre a uno de los cubreobjetos dejando caer la muestra
cuidadosamente para evitar que se derrame.
8. Meter la caja en la incubadora una hora a 37C. se van a pegar las clulas
blancas al portaobjetos.
9. Despus de la incubacin, se lavan los cubreobjetos con solucin salina al
8.5% estril. Por goteo y por las esquinas con la pipeta de Pasteur, hasta
que los cubreobjetos estn libres de eritrocitos.
10. Estimulo: Colocar el antgeno (levaduras de C.albicans) dentro de la
incubadora colocar el preparado de antgeno D-MEM+100L de NBT (azul

de nitrotetrazolium). Se adiciona 1ml por cada muestra de cultivo y se deja

incubando a 37C por una hora.
11.2 lavado. Se lavan los cubreobjetos 2 veces con solucin salina.
12. Secar cuidadosamente los cubreobjetos y dejarlos secar a temperatura
ambiente.
13. Teir los cubreobjetos con safranina 0.5% durante 7 minutos.
14. Enjuagar con agua de la llave y dejar secar.
15. Montar el cubreobjetos en un portaobjetos y se le va z colocar resina, para
fijarlos y as poder observarlas en el microscopio
ptico para hacer el conteo de clulas que
fagocitaron.
16. Realizar observacin y conteo de clulas.

Resultados
Experimental

Se contarn las clulas que estn enteras

Se descartarn acumulaciones de clulas
Se contarn las levaduras que sean endocitadas
Se contarn levaduras que se observen de color morado
Se sumar el toral de clulas que s fagocitaron levaduras
Celulas por
campo

Clulas que se Levaduras

fagocitadas
fagocitaron
levaduras
0

Levaduras de
color
morado(reduc
cin de NBT)
0

Celulas por
campo

Total

Clulas que se Levaduras

fagocitadas
fagocitaron
levaduras

Levaduras de
color
morado(reduc
cin de NBT)

10

10

58

100% de las clulas fagocitaron levaduras

Cada una de las clulas fagocitaron de 1 y 4 levaduras

Control

Se contarn las clulas que estn enteras

Se descartarn acumulaciones de clulas
Se contarn las levaduras que sean endocitadas
Se contarn levaduras que se observen de color morado
Se sumar el toral de clulas que s fagocitaron levaduras

Clulas que se Levaduras

fagocitadas
fagocitaron
levaduras

Clulas por
campo

Total

Levaduras de
color
morado(reduc
cin de NBT)

19

31

42.10% de las clulas fagocitaron levaduras

Cada una de las clulas fagocitaron entre 1 y 3 levaduras
Conclusin.
Una vez realizada la prctica y obtenidos los resultados del conteo de las clulas
el equipo analiz los datos y concluye que:

La muestra de control presenta mayor nmero de clulas que la muestra

experimental.

Las clulas de la muestra control fagocitaron mayor nmero total de

levaduras que las clulas experimentales, sin embargo no todas las clulas
de la muestra control fagocitaron levaduras mientras que las de la muestra
experimental s.

La cantidad de levaduras que fagocitaron las clulas de la muestra

experimental es mayor que las de la muestra control.

Todo esto indica que en la muestra control hubo menor nmero de muertes
celulares o la tcnica de lavado fue mejor que en la muestra experimental.
Adems se puede observar que las clulas control tienen una capacidad de
fagocitar levaduras, mientras que en las experimentales est disminuida a
causa del etanol agregado.

La hiptesis planteada fue corroborada y es cierta dado que en la muestra control

hay un mayor nmero de clulas identificadas y estas fagocitaron ms levaduras
que en la muestra experimental; los objetivos fueron alcanzados y con todos los
datos se puede concluir tambin que este fenmeno podra estar presente en las
clulas blancas de los pacientes alcohlicos, reduciendo su capacidad de
fagocitosis y aumentando la probabilidad de padecer infecciones o enfermedades.
Bibliografa
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