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UNIVERSIDAD DE CUENCA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

CARRERA DE BIOQUMICA Y FARMACIA
ESTANDARIZACIN DEL MTODO PARA ALCOHOLEMIAS POR

CROMATOGRAFA DE GASES
TESIS PREVIA A LA OBTENCIN DEL

TTULO DE BIOQUMICA FARMACUTICA
AUTORAS: DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

NANCY YOLANDA QUITO UCHO
DIRECTORA: SILVIA JOHANA ORTIZ ULLOA, Ph.D.
ASESOR:
DR. MANUEL GUILLERMO VEGA CUESTA
CUENCA-ECUADOR
2015
RESUMEN
La ingesta de etanol se ha relacionado a consecuencias lamentables a nivel

social, familiar y jurdico; siendo importante el desarrollo de mtodos de
deteccin de etanol en sangre, prueba ms confiable a nivel cuantitativo.
En el presente trabajo se realiz la primera fase de la optimizacin de un
mtodo para el anlisis de alcoholemia por cromatografa de gases con
inyeccin directa y deteccin de ionizacin de llama (GC-FID). Se realiz la
optimizacin de algunos parmetros cualitativos y cuantitativos, incluyendo
tiempos de retencin estables, selectividad del mtodo demostrado por la
ausencia de sustancias interferentes en el anlisis; linealidad a bajos niveles
con un coeficiente de determinacin de R2 = 0.996. La aplicabilidad del mtodo
en un pool de 33 muestras con distintas concentraciones de etanol tomadas
cmo puntos de referencia de baja, media y alta concentracin. La
cuantificacin se realiz por estandarizacin interna mediante el uso de un
estndar interno (n-butanol) y la estandarizacin externa mediante la curva de
calibracin a 4 niveles.
Palabras claves: Alcoholemia, cromatografa de gases, ionizacin de llama,

optimizacin.
DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

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ABSTRACT
The ethanol intake has been linked to unfortunate consequences at the social
level, family and legal; remain important the development of methods for the
detection of ethanol in blood, more reliable test at quantitative level.
In the present work was realized the first phase of the optimization of a method
for the alcoholemia analysis by gas chromatography with direct injection and
detection of ionization of flame (GC-FID). There was realized the optimization of
some qualitative and quantitative parameters, including stable retention times,
selectivity of the method demonstrated by the absence of interfering substances
in the analysis; linearity at low levels with a coefficient of determination R2 =
0,996. The applicability of the method in a grouping of 33 samples with different
taken ethanol concentrations how points of reference of low, average and high
concentration. The quantification was carried out by internal standardization
through the use of an internal standard (n-butanol) and the external
standardization through the calibration curve to 4 levels.
Key Words: alcohol, gas chromatography, flame ionization, optimization

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INDICE
RESUMEN .................................................................................................................... 2
ABSTRACT ................................................................................................................... 3
CLUSULA DE DERECHOS DE AUTOR ..................................................................... 7
CLUSULA DE PROPIEDAD INTELECTUAL .............................................................. 9
AGRADECIMIENTOS ................................................................................................. 11
DEDICATORIA ........................................................................................................... 12
INTRODUCCIN ........................................................................................................ 14
1. MARCO TERICO ................................................................................................. 15
1.1 Alcoholemia ......................................................................................................15
1.1.1 Manifestaciones txicas del alcohol etlico. .................................................16
1.2 Fundamentacin Legal .....................................................................................17
1.3 Mtodos analticos de determinacin de alcohol en sangre ..............................18
1.4 Cromatografa de gases ....................................................................................19
1.4.1 Sistema neumtico. .....................................................................................20
1.4.2 Gas portador. ..............................................................................................20
1.4.3 Filtros de oxgeno. .......................................................................................21
1.4.4 Inyector. ......................................................................................................21
1.4.5 Columna cromatogrfica. ............................................................................22
1.4.6 Horno de la columna. ..................................................................................22
1.4.7 Sistemas de deteccin ................................................................................22
1.4.7.1 Detector de ionizacin de llama (FID). ..................................................22
1.4.8 Sistema informtico. ....................................................................................23
1.5 Anlisis de datos cromatogrficos.....................................................................23
1.5.1 Aspectos cualitativos ...................................................................................23
1.5.2 Anlisis cuantitativo. ....................................................................................24
1.5.2.1 Mtodo estndar externo. .......................................................................24
1.5.2.2 Mtodo de estndar interno ..................................................................25
1.5.2.3 Normalizacin del rea. .......................................................................26
1.5.2.4 Factor de respuesta. ............................................................................26
1.6 Determinacin de alcohol en otros fluidos corporales .......................................27
1.6.1 Anlisis de alcohol en orina. ........................................................................27
1.6.2 Anlisis de alcohol en la saliva. ...................................................................28
1.6.3 Anlisis de alcohol en el lquido cerebral. ....................................................29
1.6.4 Anlisis de alcohol en el humor vtreo. ........................................................29
1.6.5 Anlisis de alcohol en el aire espirado. ........................................................29
Pgina 4
1.6.6 Anlisis de alcoholemias por cromatografa de gases. ................................30

2. METODOLOGA ..................................................................................................... 32
2.1 Tipo de estudio ..................................................................................................32
2.2 Anlisis cromatogrfico .....................................................................................32
2.2.1 Materiales, equipos y reactivos ...................................................................32
2.2.2 Instrumentacin. ............................................................................................32
2.2.3 Preparacin de estndares y curvas de calibracin. ...................................33
2.2.4 Optimizacin del mtodo. ...........................................................................34
2.2.4.1 Tratamiento de muestras. .....................................................................34
2.2.4.2 Linealidad. ............................................................................................35
2.2.4.3 Selectividad. .........................................................................................35
2.2.5 Aplicabilidad del mtodo..............................................................................35
2.2.5.1 Toma de muestras sanguneas. ............................................................36
2.2.5.2 Procesamiento y anlisis de datos. ......................................................36
3. RESULTADOS ........................................................................................................ 37
3.1 Optimizacin del tratamiento de la muestra .......................................................37
3.2 Optimizacin de los parmetros cromatogrficos ...............................................37
3.2.1 Parmetros cualitativos. ..............................................................................37
3.2.2 Parmetros cuantitativos. ............................................................................38
3.3 Aplicabilidad en pool de muestras sanguneas ..................................................40
4. DISCUSIN ............................................................................................................ 44
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .......................................................... 46
5.1 Conclusiones .....................................................................................................46
5.2 Recomendaciones .............................................................................................46
REFERENCIAS .......................................................................................................... 47

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LISTA DE TABLAS
Tabla 1 reas y concentraciones del pool de muestras de sangre de alta, media y baja
concentracin de etanol ..............................................................................................33
Tabla 2 Concentraciones del etanol y n-butanol ..........................................................34
Tabla 3 reas y concentraciones de los estndares en la curva de calibracin de
etanol con estndar interno. ........................................................................................39
Tabla 4 reas y concentraciones del pool de muestras de sangre de alta, media y baja
concentracin de etanol ..............................................................................................41
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Esquema del cromatgrafo de gases. ...........................................................20

Figura 2 Detector de ionizacin de flama. ...................................................................23
Figura 3. Cromatograma del anlisis de etanol en sangre a una concentracin de 0,15
g/L de etanol y 8,1 g/L de n-butanol ............................................................................38
Figura 4 Curva de calibracin para el etanol/n-butanol. ...............................................39

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CLUSULA DE DERECHOS DE AUTOR

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CLUSULA DE PROPIEDAD INTELECTUAL

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AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo queremos agradecer en primer a Dios y a la Virgen Mara

por llenarnos de sabidura, bendiciones y fortaleza para superar obstculos y
dificultades en la elaboracin de este trabajo y porque nos permitieron realizar
este sueo anhelado.
Tambin queremos agradecer a Dios de una manera especial por poner al
frente de este trabajo a nuestra Directora Johana Ortiz Ulloa Ph.D, quin con
su sabidura, paciencia, esfuerzo y tiempo ha sabido guiarnos y motivarnos de
la mejor manera para la realizacin de este sueo.
Al Dr. Manuel Vega, por su apoyo, tiempo, dedicacin y orientacin que ha
importante para este trabajo
A nuestras familias, quienes han sido motivacin durante las largas noches de
estudio, en los momentos de alegra y tristeza durante la carrera estudiantil y
elaboracin de este proyecto.
A la Universidad de Cuenca, y a su vez a la Facultad de Ciencias Qumicas
que nos han brindado y dado las oportunidades necesarias para poder
formarnos profesionalmente.
Como no agradecer a nuestra querida Escuela de Bioqumica y Farmacia y a
todos nuestros docentes quienes con esmero y dedicacin nos han enseado
ms que materias nos han enseado la verdadera ciencia de la vida.

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DEDICATORIA
Quiero dedicar est meta alcanzada a Dios, por haberme dado la oportunidad
de cumplir un sueo, por brindarme amor en todos los momentos de mi vida y
haberme permitido llevar conmigo experiencias, alegras, desvelos, logros,
amigos, a lo largo de mi carrera estudiantil.
Tambin quiero dedicar este trabajo a mi mami Beatriz Chacn, quin con su
amor, apoyo, fortaleza y trabajo supo ser un pilar y motivacin para cumplir
cada una de mis metas.
A mis abuelitos Alipio y Rosario, quienes fueron ejemplo de superacin, ayuda
en cada uno de los momentos de mi vida estudiantil
A mi tas Piedad, y Blanca, quienes con su amor y alegra, supieron motivarme
en los momentos de alegra y dificultad.
A mis hermanas Andrea, Silvia, Gaby, por apoyarme en cada uno de los
momentos de mi vida, y por ser ejemplo para m.
A mis sobrinos por su alegra y amor que llenan mi vida.
A todos mis amigos, quienes de una u otra manera compartieron grandes
momentos juntos, y me ayudaron para alcanzar esta meta.
A mi amiga Nancy Quito, que con su compresin y esfuerzo pudimos realizar
este trabajo.
Diana Narvez

Pgina 12
DEDICATORIA
A Dios por haberme dado la sabidura y las fuerzas necesarias para cumplir
una de mis metas y permitirme llegar a este momento tan especial en mi vida.
A mis padres quienes han sido el pilar ms importante y me han demostrado
siempre su cario y apoyo incondicional; con sus consejos me han sabido guiar
para culminar mi carrera profesional.
A mi esposo, por acompaarme durante este arduo camino y compartir
alegras, fracasos y demostrarme que siempre podr contar con l.
A m ms apreciado tesoro Beln quien con su ternura fue mi estmulo y motivo
para continuar.
A mi familia en general, porque me han brindado su apoyo incondicional y por
compartir conmigo buenos y malos momentos.
A mi compaera de tesis Diana que a pesar de varios obstculos que se nos
present logramos terminar este proyecto.
Nancy Quito.

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INTRODUCCIN
Segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), Ecuador en el 2013, fue el

segundo pas en Amrica Latina con mayor consumo de alcohol per cpita
correspondiente a un promedio 9,4 litros de alcohol por habitante al ao. Segn
la Encuesta Nacional de Salud y Nutricin (2012), la edad de inicio de consumo
de alcohol es de 13 a 15 aos y se lo ha relacionado a consecuencias
lamentables que incluyen la participacin en escndalos, agresiones,
alteraciones psicosociales, enfermedades,
accidentes de trnsito, violencia
intrafamiliar y muerte (Rosero, 2014). Adems, segn la Agencia Nacional de

Trnsito, la embriaguez es la quinta causa probable de siniestros a nivel
nacional.
La evaluacin de la ingesta de alcohol inicia con pruebas fsicas de equilibrio,
coordinacin y percepcin espacial; pero esta relacin es difcilmente
cuantificable. Otra opcin es la aplicacin de la prueba de alcoholemia
determinando el etanol expirado (alcohol sensor), la cual es una prueba poco
confiable a nivel cuantitativo por lo que la prueba de mayor utilidad en
toxicologa forense y en tribunales de justicia es la determinacin de etanol en
sangre por cromatografa de gases que permite la deteccin y cuantificacin de
etanol de una manera rpida, precisa y sensible (Henao & Vaca, 2010). En el
presente trabajo de tesis, se presenta la primera fase de la optimizacin de un
mtodo analtico por cromatografa de gases con inyeccin directa y deteccin
de ionizacin a la llama (GC-FID) para el anlisis de etanol en sangre para su
posterior validacin y estandarizacin en el laboratorio de Anlisis Instrumental
de la Facultad de Ciencias Qumicas.

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1. MARCO TERICO
1.1 Alcoholemia
Alcoholemia es la presencia pasajera de alcohol en sangre como consecuencia
de la ingestin de bebidas alcohlicas o subproducto del metabolismo. Su
medicin implica la determinacin cuantitativa de la concentracin de alcohol
etlico expresado en gramos por litro de sangre en un individuo (Tllez, 2002),
(Silva, 1995).
En bebedores habituales manifiestan los efectos txicos del etanol a
concentraciones de sangre superiores a las de los nios o a las de adultos
bebedores espordicos. El etanol se elimina en los no bebedores habituales a
una velocidad de 15 20 mg/100 ml/h, conocido como etiloxidacin, siendo
necesario de 6-7 horas para que la alcoholemia disminuya en 100 mg/ dl. En
los alcohlicos o bebedores habituales la velocidad de eliminacin alcanza un
promedio de 2535 mg/100ml/h) (Bataller, 2004)
En individuos no bebedores, la alcoholemia oscila entre 0 y 0,03 g/L, a lo que
se denomina alcohol endgeno y se debe a la fermentacin intestinal de la
peptina y a la reduccin de acetaldehdo de otras procedencias. Adems,
estados de infeccin intestinal y la ingesta de comidas ricas en carbohidratos
pueden conllevar a elevar el alcohol endgeno (Camean, y otros, 1995),
(Bataller, 2004).
La alcoholemia suele alcanzar su punto mximo entre los 30 y 90 minutos
despus de haber ingerido alcohol etlico (Camean, y otros, 1995) y comienza
a descender a una tasa de 0,15 gramos por hora. Esta tasa es variable de
persona a persona y tambin depende de la actividad fsica de la persona
luego de haber ingerido alcohol etlico(Silva, 1995).

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1.1.1 Manifestaciones txicas del alcohol etlico. La clsica exteriorizacin

del alcoholismo agudo es la ebriedad
(Buzzo & Soria, 1960). Los efectos
txicos del etanol radican en la depresin de las funciones del Sistema

nervioso,
produciendo
una
correlacin
proporcional entre
los efectos
depresores y la concentracin de alcohol en sangre central (Bataller, 2004). Asi

hablamos de intoxicacin:
1) Ligera (Concentracin de etanol en sangre de 0,5 - 1,5 g/L): Caracterizada

por
locuacidad,
alegra
transitoria,
ligera
falta
de
coordinacin
muscular(Bataller, 2004). Adems se presenta un estado psquico de

extroversin ms o menos exagerada (Buzzo & Soria, 1960).
2) Moderada (Concentracin de etanol en sangre de 1,5 3 g/L): Se
caracteriza por la disminucin de las facultades intelectuales superiores
(conducta), falta de autocontrol, excitacin sexual psquica sin aumento de la
potencia genital, incoordinacin de movimientos (Buzzo & Soria, 1960).
Adems presenta trastorno de la visin, perdida sensorial, coordinacin motora
(Bataller, 2004) .
3) Grave (Concentracin de etanol en sangre de 3 5 g/L): Caracterizado por
trastorno falta de coordinacin muscular, visin borrosa, estado de conciencia
prximo al estupor. En ocasiones se puede presentar hipoglucemia grave con
hipotermia, desviacin conjugada de los ojos (Bataller, 2004).
4) Coma alcohlico (Concentracin superior a 5 g/L): Caracterizada por
inconsciencia, respiracin lenta, hiporreflexia, prdida de la sensibilidad y, con
frecuencia fallecimiento del paciente. En general los pacientes en coma
alcohlico, pueden desarrollar hipotermia, hipoventilacin, acidosis metablica
(Bataller, 2004).

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1.2 Fundamentacin Legal

Entre las varias consecuencias que trae consigo el consumo de alcohol, los
accidentes de trnsito constituyen uno de los principales problemas y causas
de muerte en el Ecuador. Segn Juan Manuel Leao, especialista de
Transporte del Banco Interamericano para el Desarrollo (BID) Ecuador, es el
segundo pas con ms accidentes de trnsito por consumo de alcohol.
En el marco legal de la constitucin de la Repblica del Ecuador en el Artculo
364 se establece la responsabilidad del estado a desarrollar programas de
informacin,
prevencin,
control,
tratamiento
rehabilitacin
para
consumidores de etanol, tabaco y sustancias estupefacientes y psicotrpicas

(Constitucion de la Republica del Ecuador, 2008).
Las siguientes normativas hacen referencia especfica a la alcoholemia y sus

consecuencias (Ley Orgnica de Transporte Terrestre Trnsito y Seguridad
Vial, 2014):
La ley de trnsito (Art. 145.2) quien condujera en estado de embriaguez,

ser sancionado de acuerdo a la siguiente escala:
a. Si el nivel de alcohol por litro de sangre excede de 0,3 gramos y es
inferior a 0,8 gramos, se aplicar la multa de una remuneracin
bsica del trabajador en general, prdida de cinco puntos en su
licencia de conducir y cinco das de prisin.
b. Si el nivel de alcohol por litro de sangre es de 0,8 gramos o ms, se
aplicar la multa de una remuneracin bsica del trabajador en
general, prdida diez puntos en su licencia de conducir y quince das
de prisin.
De las pruebas y su valoracin (Art. 150), cuando un agente de trnsito

presuma que quien conduce un vehculo se encuentra en estado de
embriaguez, proceder a realizar de inmediato el examen de alcohotest. Para
el efecto, los agentes portarn un alcoholmetro. No obstante, si fuere posible,
se prefieren los exmenes de sangre y de orina en una clnica, hospital o
cualquier otro establecimiento mdico o laboratorio de anlisis clnico.
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La ley de trnsito y transporte terrestre (Art. 151), cuando producido un

accidente de trnsito se presuma que quin lo caus se encontraba en estado
de embriaguez, se proceder a realizar de inmediato los exmenes de
alcoholemia. Si las condiciones fsicas del causante del accidente imposibilitan
realizar las mencionadas pruebas, el agente que toma procedimiento
acompaar el traslado del herido a una clnica, hospital u otro establecimiento
mdico, en donde se le realizar los exmenes correspondientes.
En el juzgamiento de los delitos de trnsito (Art. 153), se ordenar la prisin
preventiva del imputado y el retiro de su licencia de conducir vehculos a motor.
Se ordenar tambin la prohibicin de enajenar del vehculo con el que se
ocasion el accidente, fuere o no su propietario el conductor, para efecto de la
responsabilidad civil pertinente.
De los delitos de trnsito (Art. 126), quien conduciendo un vehculo en estado

de embriaguez, ocasionare un accidente de trnsito del que resultaren muertas
una o ms personas ser sancionado con reclusin mayor ordinaria de ocho a
doce aos, revocatoria definitiva de la licencia para conducir vehculos y multa
equivalente a treinta remuneraciones bsicas unificadas del trabajador en
general.
De los delitos de trnsito (Art. 126.1), ser sancionado con prisin de cuatro a
cinco aos quien conduzca un vehculo en estado de embriaguez
y que
ocasionare un accidente de trnsito del que resulten una o ms personas

lesionadas con incapacidad laboral superior a noventa das (Ley Orgnica de
Transporte Terrestre Trnsito y Seguridad Vial, 2014).
1.3 Mtodos analticos de determinacin de alcohol en sangre
Existen varios mtodos para la determinacin de alcohol en la sangre que
incluyen mtodos enzimticos, de microdifusin (los ms antiguos) y de
cromatografa de gases.
Los mtodos enzimticos y los de microdifusin no son especficos ya que
existen interferencia con todas las sustancias voltiles de carcter reductor;
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adems tienen baja velocidad de reaccin por lo que dan resultados inciertos
(Ferrari, 2008). Particularmente, el mtodo enzimtico se basa en la reaccin
con la enzima alcohol deshidrogenasa (no es especfica para el etanol)
(Repetto, 1995). Por su parte, el mtodo de microdifusin se basa en una
reaccin de xidoreduccin, en la que el alcohol presente en la muestra se
difunde y reacciona con el agente oxidante (mezcla sulfocrmica) cambiando
de color naranja a verde manzana. El exceso de dicromato de la muestra es
ledo espectrofotomtricamente y corregido con el blanco de prueba. La
sensibilidad de ste mtodo es de 30 mg / 100 ml (Uribe, 2013).
En la actualidad, el mtodo cromatogrfico es de mayor aceptacin, pues es
muy sensible, verstil, de excelente precisin y exactitud, el cul es en l que
se basa el presente trabajo.
1.4 Cromatografa de gases
La cromatografa de gases (GC) es la tcnica analtica de separacin de
compuestos que permite la identificacin, purificacin y cuantificacin de los
componentes fundamentado en las diferencias de volatilidad y solubilidad de la
mezcla de los solutos a separar. Est tcnica ofrece mejor poder de resolucin
para compuestos orgnicos voltiles siendo considerada como una de las
tcnicas ms sensibles. Su principal
limitacin se encuentra en labilidad
trmica de los analitos, los cuales deben ser estables a la temperatura

requerida para su volatilizacin (Varcarcel & Gomez, 1988).
En la cromatografa de gases la fase mvil es un gas, mientras que la fase
estacionaria puede ser: (a) un slido adsorbente, o (b) un lquido retenido en un
soporte solido (columna empaquetada) o en las paredes de un capilar (columna
capilar).
Los componentes bsicos de un cromatgrafo de gases son: (Figura 1)
Sistema neumtico
Gas portador
Filtros de oxgeno y humedad
Inyector
Columna cromatogrfica

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Horno de la columna
Sistema de deteccin
Sistema informtico
Figura 1 Esquema del cromatgrafo de gases.
Fuente: (Skoog A., Vest M. , & Holler, 2001)
1.4.1 Sistema neumtico. Est compuesto por los gases que alimentan al
sistema cromatogrfico, manmetros y vlvulas reguladoras de los cilindros de
gas. Los manmetros y vlvulas que controlan y regulan la entrada de los
gases al sistema. La presin interna de un cilindro de gas suele estar por
encima de 200 lbs/ pulg2 (psi), y debe ser reducido a las presiones de entrada
que estn entre 10 psi y 50 psi (Barquero, 2006).
1.4.2 Gas portador. Los gases portadores que se usan comnmente son:
helio, nitrgeno y el hidrogeno. El grado de pureza de estos gases debe ser de
99,99% (Barquero Quirs, 2006).Este grado de pureza asegura que no haya
impurezas que originan ruido en la lnea base, causando a su vez una
disminucin de la sensibilidad y los lmites de deteccin de la separacin
(Linde, 2001).
La funcin del gas portador es la de transportar el analito a travs de la fase
estacionaria por lo que deber ser inerte tanto con el analito como con la fase
estacionaria de la columna.
La eleccin del gas depender de la eficiencia y velocidad que tenga para la
separacin, y del tipo de detector que se va a utilizar:

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El hidrgeno permite una alta movilidad originando tiempos de anlisis

cortos, debido a que este tiene la ms baja viscosidad en comparacin
con otros gases.
El helio proporciona en la mayora de los casos las mejores

resoluciones, y es el ms usado.
El nitrgeno es barato, seguro, tiene una fcil purificacin, pero presenta

baja conductividad trmica (Varcarcel & Gomez, 1988).
1.4.3 Filtros de oxgeno.
El sistema de filtros de purificacin de gases
proporciona gases ms puros y reduce el riesgo de que la columna sufra daos

produciendo una prdida de sensibilidad y precisin en el cromatgrafo de
gases y que este se quede inactivo. (Agilent, 2001). Los principales agentes
que deben filtrarse son oxgeno, agua e hidrocarburos (Barquero, 2006).
1.4.4 Inyector.
La precisin de la inyeccin depende de la velocidad de
inyeccin y la cantidad de muestra inyectada. Los volmenes de inyeccin son

tpicamente muy pequeos (del orden de l) por lo que se usan micro jeringas.
La temperatura de inyeccin debe ser lo suficientemente elevada como para
volatilizar todos los componentes de la muestra, no debindose elevar ms all
de este nivel para evitar posibles descomposiciones trmicas de la muestra
(Barquero, 2006)
Al inyectar lentamente, las bandas se ensanchan y la resolucin es mala. En
algunos equipos se dispone de automuestradores automticos que reducen los
errores de precisin.
Algunos inyectores pueden funcionar en el denominado modo split/splitless
(divisin/sin divisin). En el modo divisin (Split) la muestra se divide antes de
entrar en la columna y se aplica para muestras muy concentradas para evitar
sobrecarga de muestra en la columna. En el modo sin divisin (splitless) toda la
muestra se inyecta en la columna.

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1.4.5 Columna cromatogrfica. La columna es el componente esencial del

cromatgrafo ya que es donde se produce la separacin de los solutos, en esta
se encuentra la fase estacionaria (liquida o solida). Actualmente se emplean
columnas capilares que son rpidas y eficientes, con mejor resolucin,
menores tiempos de anlisis, y mayor sensibilidad a pequeas cantidades de
analito. La longitud de las columnas vara de longitud desde 2 metros hasta 100
metros y suelen estar enrolladas a fin de que encajen en el horno. El material
de las columnas es de acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln. Las
columnas capilares de slica fundida son muy frgiles, por lo que estn
recubiertas de poliimida (Harris, Analisis Quimico Cuantitativo, 2003).
1.4.6 Horno de la columna. La temperatura de la columna es una variable
importante por lo que la columna normalmente se introduce dentro de un horno
termostatizado. La temperatura ptima de la columna depende del punto de
ebullicin de las muestras y el grado de separacin necesario. En el caso de
muestras complejas se utiliza un programa de rampas de temperatura para
lograr la separacin de los componentes de la muestra (Barquero, 2006).
El horno de la columna consta de un sistema de flujo de aire adecuado que
permita el rpido calentamiento y enfriamiento del horno (Parrales, Reyes, &
Pine, 2012). Dentro del horno la columna se conecta en un extremo al puerto
de inyeccin, y en el otro al detector (Rodriguez & Olgun, 2004).
1.4.7 Sistemas de deteccin.
Una vez separado los componentes de la
muestra en la columna, estos pasan por un sistema de deteccin que origina

una seal proporcional a la cantidad de soluto (Anzano, 2002). Independiente
del tipo de detector, su temperatura siempre debe ser ms elevada que la
mxima temperatura de trabajo a que se someta la columna, con el fin de evitar
que se puedan condensar en el detector compuestos eluidos de baja
volatilidad.
El detector utilizado en el presente trabajo es el detector de ionizacin a la
llama (FID), el cual se describe a continuacin.
1.4.7.1 Detector de ionizacin de llama (FID). El funcionamiento del FID se
basa en la accin de una flama de hidrgeno/ aire sobre la muestra que sale de
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la columna. Las molculas orgnicas que atraviesan la flama se rompen y se

produce iones, los cuales son colectados en un electrodo parcial y produce una
seal elctrica. El FID es extremadamente sensible en un amplio rango
dinmico. La respuesta del FID se basa en el nmero de carbonos y otros
elementos como halgenos (Olgun & Rodrguez, 2004) (Figura 2).
Figura 2 Detector de ionizacin de flama.
Fuente: (Rodriguez & Olgun, 2004)
1.4.8
Sistema
informtico.
El
sistema
informtico
incorporado
al
cromatgrafo recibe la seal generada en el detector y la traduce en

informacin digital que permite el tratamiento computarizado de los datos,
incluyendo la integracin del rea del pico cromatogrfico y la medicin del
tiempo de retencin de los analitos (Varcarcel & Gomez, 1988)
1.5 Anlisis de datos cromatogrficos
1.5.1 Aspectos cualitativos. Uno de los parmetros caractersticos que
permite la identificacin de una sustancia es el tiempo de retencin (t R) que es
el tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra para que el
pico del analito alcance el detector. Los tiempos de retencin dependen de una
variedad de condiciones experimentales como temperatura, fase estacionaria,
gas portador (Varcarcel & Gomez, 1988).

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1.5.2 Anlisis cuantitativo. Se basa en la comparacin del rea o altura del

pico del componente de inters con la de estndares de esta sustancia de
concentracin conocida, sabiendo que existe una relacin lineal entre el rea o
altura de pico y la
concentracin en un determinado intervalo de
concentraciones.
Cuando el anlisis se basa en la altura del pico se requiere que el ancho de los
picos no sufra modificaciones durante la obtencin de los cromatogramas de la
muestra y los estndares para obtener resultados exactos. Por esta razn
comnmente los anlisis se basan en el rea del pico debido a que este es un
parmetro independiente de los efectos de ensanchamiento (Skoog, Holler, &
Nieman, 2001).
1.5.2.1 Mtodo estndar externo. Con el rea o la altura del pico conocido
se puede determinar la masa o concentracin de la muestra inyectada si se
conoce la curva de calibracin que relaciona la respuesta del detector con la
cantidad de compuesto inyectada. La calibracin se realiza mediante el uso de
patrones externos. Se obtienen los cromatogramas de disoluciones patrn de
distinta concentracin y se representa el rea de pico en funcin de la
concentracin para construir la curva de calibracin. Por interpolacin se
obtiene la concentracin de los componentes de la muestra (Skoog A., Vest M.
, & Holler, 2001).
Por lo general los detectores presentan curvas de tipo sigmoidea, razn por la
cual es conveniente trabajar siempre dentro del rango dinmico lineal del
detector, que se define como la zona del rango dinmico en la que la respuesta
del detector es lineal frente a la concentracin de soluto.
El detector produce una respuesta dependiente de la concentracin del soluto
que llega a l; el valor mnimo de este rango corresponde a la sensibilidad del
detector, y el valor mximo corresponde con la concentracin del soluto a partir
de la cual la respuesta es constante (CSIC, 2008).
Uno de los problemas que se presenta en este mtodo de calibracin es la
reproducibilidad de la inyeccin y el control estricto de la cantidad inyectada,
por lo que se debe tomar las debidas precauciones para alcanzar la exactitud.
Pgina 24
Adems la calibracin debe repetirse peridicamente para verificar la fiabilidad

de la cuantificacin. Debido al problema de irreproducibilidad en la inyeccin,
resulta til el empleo de un estndar interno (UCV, 2008).
1.5.2.2 Mtodo de estndar interno. Se utiliza con frecuencia en el anlisis
cuantitativo para compensar posibles errores derivados de la manipulacin de
la muestra y de la inyeccin ya que de esta manera el estndar y la muestra
sern afectados de igual forma por las diversas condiciones que afectan la
inyeccin.
La caracterstica que debe tener el estndar interno es ser una sustancia que
produce un pico separado de los picos de la muestra, pero que se encuentre
cerca de ellos y que tenga caractersticas similares a la de la muestra que se
va analizar.
La adicin de un estndar interno debe hacerse a la muestra y a cada
disolucin patrn en una cantidad iguales exactamente medidas. Para la
cuantificacin, se emplea la relacin entre el rea de pico del componente de
inters/rea
de
pico
del
estndar
interno
concentracin
del
analito/concentracin del estndar interno (Barquero, 2006).

Con la curva de calibracin se obtiene la ecuacin lineal que nos permitir
calcular la concentracin del analito:
y = mx + b
En donde,
y =rea patrn / rea de estndar
x = concentracin de patrn / concentracin de estndar
m = pendiente
b = intercepto
Del cromatograma se obtienen las reas de analito y del estndar y luego con
la ecuacin de la curva de calibracin y conociendo la masa del estndar se
puede obtener la masa del analito en la muestra (Fernndez & Garcia, 2010)

Pgina 25
La ventaja de este mtodo es que es independiente del volumen de inyeccin

de muestra lo que es sumamente importante para aquellas tcnicas
cromatogrficas que utilizan un mtodo de introduccin de muestra no
automatizado como por ejemplo el uso de jeringas de inyeccin en
cromatografa gaseosa (Fernndez & Garcia, 2010).
1.5.2.3 Normalizacin del rea. Este procedimiento evita las incertidumbres
asociadas con la inyeccin de la muestra.
Este mtodo permite establecer el porcentaje de cada componente en la
muestra. Se calcula dividiendo el rea de cada componente entre el rea total y
multiplicando por 100%, es decir:
% Analito = (rea de a / rea total) x 100
En donde,
rea de a= rea de un analito determinado
rea total = suma del rea de todos los analitos homlogos.
Este trmino es independiente del volumen de inyeccin de muestra, y para su
clculo todos los picos deben estar separados (Skoog, Holler, & Nieman,
2001).
1.5.2.4
Factor de respuesta. Cada detector tiene una forma particular de
respuesta para cada analito y permite ajustar el clculo de la normalizacin de las

reas. La respuesta del detector de ionizacin a la llama (FID) es independiente de la
temperatura, del flujo de gas de arrastre y de la velocidad de flujo; por lo que se facilita
los clculos debido a que se pueden establecer relaciones directas de peso de
muestra.
El clculo de factor de respuesta se realizar experimentalmente pesando la cantidad
exactamente conocida del patrn del analito a estudiar, se determina su rea en el
cromatgrafo y luego se realiza el clculo.
(FR ) analito = conc. Analito /rea analito
En donde,
FR = Factor de respuesta
Pgina 26
Conc. = concentracin del analito
1.6 Determinacin de alcohol en otros fluidos corporales

La determinacin de alcohol etlico puede hacerse en diferentes fluidos
corporales, incluyendo sangre, orina, saliva, aire espirado, cerebro, humor
vtreo, entre otros (Vargas, 1991).
Las determinaciones en sangre son las ms eficaces. De hecho, el anlisis en
otros biofluidos, lo que en realidad se intenta es calcular la concentracin
de etanol en sangre.
Los procedimientos de anlisis del etanol en biofluidos, pueden agruparse en
tres grupos, cada uno de los cuales tiene sus ventajas y limitaciones. El primer
grupo hace referencia a las tcnicas de microdifusin, cuya reaccin es poco
especfica pero su ejecucin es econmica pues no requiere medios o
instrumentos especiales. El segundo grupo se basa en la oxidacin mediante
aldehdo deshidrogenasa, el cual es un procedimiento sencillo, especfico, muy
utilizado por laboratorios de anlisis clnicos. Sin embargo, esta tcnica puede
dar falsos resultados en presencia de otros alcoholes. El tercer grupo hace
referencia a tcnicas cromatogrficas, especficamente a cromatografa de
gases. Este es un procedimiento ms especfico, sensible y fiable que permite
simultneamente realizar el anlisis cualitativo y cuantitativo del etanol (Ladrn
de Guevara & Moya, 1995).
1.6.1 Anlisis de alcohol en orina.
Al menos un 10% de etanol ingerido se elimina sin metabolizar por orina. Los
estudios experimentales han demostrado la gran variabilidad de la correlacin
de alcohol en orina/sangre, ya que la alcoholuria depende de muchos factores,
como:
a) La diuresis, ya sea por retencin urinaria fisiolgica o patolgica o por el
efecto diurtico propio del etanol.
b) Estado de hidratacin del sujeto, dieta y funcin renal, que influyen en la
densidad de la orina.

Pgina 27
c) Momento de la toma de muestra, ya que la alcoholuria es inferior a la

alcoholemia hasta en mximo de sta, a partir de ah se invierten los
trminos.
Debido a esto, la valoracin de alcohol en la orina presenta una serie de
inconvenientes, especialmente ligadas al hecho que al llegar el alcohol a la
vejiga se diluir en la orina almacenada en sta, por lo que la concentracin en
ella ser inferior a la de la sangre.
En consecuencia, a pesar de la sencillez de obtencin de la muestra, y de la
mejor conservacin de la misma, no parece que la determinacin de alcohol en
orina sea un procedimiento recomendable a efecto de aplicacin de la
legislacin; sino ms bien para otros fines como control de la bebida en el
trabajo o en programas de rehabilitacin, etc (Reppeto, 1995).
Se ha propuesto el siguiente factor de correlacin de la concentracin de
alcohol en orina y sangre, indicndose entre parntesis los valores medios
calculados por Budd en cadveres:
Orina / sangre: 1,4 (1,5) (Reppeto, 1995).
El rango de medicin de alcohol etlico en orina va de 10 mg/dL - 600 mg/dL.
(Beckman Coulter, 2003)
1.6.2 Anlisis de alcohol en la saliva.
Ha sido propuesto que la tasa de alcohol en la saliva y sangre es casi idntica,
que la saliva normal esta desprovista de sustancias reductoras voltiles y que
el hecho de fumar no modifica el tenor de estas sustancias (Fabre & Truhaut,
1976). Despus de la ingestin de una bebida alcohlica concentrada, el
alcohol que impregna la boca desaparece casi del todo, a los 10 minutos y
completamente a los 20 minutos.
Para la saliva el factor de correlacin es de 1, 12, con grandes variaciones,
acordes con las oscilaciones de la constitucin de la saliva (Reppeto, 1995). El
rango de deteccin en pruebas rpidas es de 0,02 g/dL y 0,3 g/dL (ABS, 2005)

Pgina 28
1.6.3 Anlisis de alcohol en el lquido cerebral.

En el caso de un peritaje mdico legal, despus de la autopsia, la
determinacin puede hacerse no solo en la sangre, sino tambin en el cerebro.
El contenido de alcohol en este puede indicar, en efecto, si la muerte ha
sobrevenido bruscamente o si la difusin ha podido efectuarse en todo
el organismo (Fabre & Truhaut, 1976).

Para el lquido cerebral el factor de correlacin es de 1,18 liquido cerebral /
sangre (Reppeto, 1995).
1.6.4 Anlisis de alcohol en el humor vtreo. El humor vtreo es considerado

una muestra bastante til debido a que aqu el alcohol permanece estable ya
que no tiene contaminacin bacteriana. El cociente de humor vtreo/sangre es
de 1,3 (Serrano & Velez, 2011).
La cantidad de alcohol normalmente presente el humor es de 0,024g/L
(Simonin, Snchez, Sales, & Linares, 1962).
Segn un trabajo de tesis realizado se ha observado que el rango de
determinacin de etanol en humor vtreo va desde 0,58 g/L a 3,88 g/L
(Serrano & Velez, 2011) .

1.6.5 Anlisis de alcohol en el aire espirado. La concentracin de alcohol en
el aire es independiente del volumen de la solucin pero, en cambio, es influida
por la temperatura y la concentracin de sales. Para el alcohol, el grado de
particin entre sangre y aire, a 37C, es de 2100 a 1; es decir, dos mil cien
mililitros de aire alveolar contiene el mismo peso de alcohol que contiene un
mililitro de sangre.
En este mtodo de anlisis se distinguen tres fases:
a) Recoleccin de una muestra de volumen y composicin adecuados.
b) Reaccin del alcohol en esta muestra con reactivos como la solucin de
dicromato en cido sulfrico.
c) Medida del cambio de color con esa reaccin.
Pgina 29
La confiabilidad de los aparatos de medicin (alcoholmetros) an es

cuestionado, debido a que los resultados ms confiables se logran mediante el
anlisis de sangre, los resultados pueden alterarse por las condiciones
variables en que los oficiales de polica deben manejar estos instrumentos.
(Vargas, 1991)
Una precaucin elemental es evitar que el alcohol que humedece la boca
durante la medicin pueda falsear los resultados. Para ello debe insistir en que
la muestra de aire se tome por lo menos quince minutos despus de la
ingestin de bebidas alcohlicas, y proceder siempre al enjuague con agua
antes de iniciar la prueba. (Vargas, 1991)
Segn el Reglamento Argentino de metrologa para los medidores de
concentracin de alcohol en aire exhalado, stos debern ser capaces de
medir en todas las concentraciones en masa en el rango que va de 0,00 g/L
hasta al menos 1,50 g/L.
1.6.6 Anlisis de alcoholemias por cromatografa de gases.
El medio ideal para apreciar la impregnacin alcohlica de un individuo es la
sangre, esto se debe a que contiene pocas sustancias voltiles reductoras
susceptibles de interferir en la determinacin, y tambin porque la
concentracin de alcohol est equilibrada con la del lquido cefalorraqudeo y
sobre todo con el sistema nervioso central, constituyendo el receptor
fundamental de la accin txica del alcohol (Truhaut & Fabre, 1977).
El mtodo ms aceptado para la determinacin de alcoholemia es
cromatografa de gases (Rodrguez & Mayero Franco, 2000). En los sistemas
primitivos el anlisis consista en la desproteinizacin de la sangre y la posterior
inyeccin en el cromatografo; o tambin hacer pasar la sangre diluida por un
pirolizador conectado al cromatografo, para destruir la materia orgnica.
Actualmente, el procedimiento de eleccin es la inyeccin de espacio de
cabeza, de donde se extrae una muestra alcuota del vapor para su posterior
inyeccin en el cromatgrafo, dejando atrs los interferentes de la matriz de la
muestra sangunea.

Pgina 30
Para la determinacion de alcoholemia en el caso de individuos vivos se obtiene

la muestra de sangre de la vena radial o cubital de antebrazo; la toma de
muestra de cadveres debe hacerse de la vena femoral o axial, o bien de las
cavidades cardacas. La sangre venosa se debe extraer con jeringa de un solo
uso, sin desinfeccin de la piel con alcohol o derivados de este. Sino con jabn,
o con algn producto no alcohlico. Adems debe aadirse a la sangre oxalato
sdico como anticoagulante y fluoruro de sodio que evita la fermentacin
(Camean, y otros, 1995).

Pgina 31
2. METODOLOGA
2.1 Tipo de estudio

El tipo de estudio fue de tipo descriptivo, analtico, cuantitativo.
2.2 Anlisis cromatogrfico
2.2.1 Materiales, equipos y reactivos
Balones aforados 25 y 100 ml
Pipetas serolgicas 1, 2 y 5 ml
Tubos de ensayo con tapa rosca
Microjeringa Hamilton, capacidad 1 l
Tubo con oxalato de potasio (6 mg) y fluoruro sdico (7.5 mg) para
recoleccin de muestras sanguneas.
Micropipetas automticas (0,5- 10,0 l; 10-100 l; 100-1000 l) marca

Labmate
Generador de Hidrgeno (Parker, modelo H2-90)
Homogeneizador Vortex (Genie 2, modelo G-560)
Cromatgrafo de gases con detector FID (Agilent, modelo 6890n G 1530

N)
Etanol absoluto grado IR pureza 99,9% (Merck, Alemania)
N- Butanol grado reactivo, pureza 99,8%, (Merck, Alemania)
Acetonitrilo grado HPLC pureza 99,9% (Merck, Alemania)
Tween 20 (Panreac, Espaa).
Agua purificada tipo I (conductividad de 0,78 ) obtenida mediante

sistema Milli-Q (Millipore, USA)
2.2.2
Gases (nitrgeno, aire sinttico) pureza 99,99% (Linde, Alemania)

Instrumentacin.
La optimizacin de la tcnica se realiz en un
cromatgrafo de gases Agilent 6890n, con un detector de ionizacin a la llama

(FID). La separacin cromatogrfica se realiz en una columna Agilent DB-624,
de 30 metros de longitud, 530 m de dimetro interno y 3 m de grosor de
pelcula. El gas portador fue nitrgeno, el cual se utiliz a un caudal constante
Pgina 32
de 5 ml/min. El cromatgrafo de gases fue operado en las condiciones que se

describen en la Tabla .1
Tabla 1 reas y concentraciones del pool de muestras de sangre de alta, media y
baja concentracin de etanol
Inyector
Columna
Horno
Detector
2.2.3
Volumen de inyeccin
0,5 l
Modo
Divisin (Split)
Temperatura inicial
250 0C
Presin
3,7 psi
Relacin de Divisin (split ratio)
13,6:6
Flujo de divisin
74,7ml/ min
Ahorrador de gas
20 ml/min por 2 min
Modo de flujo
Constante
Presin de columna
370 psi
Flujo del gas portador
5,5 ml/min
Velocidad de flujo promedio
39 cm/seg
Condiciones iniciales
40 0C por 3,30 min
Rampa de temperatura
20 0C hasta 180 0C
Equilibracin de columna
220 0C durante 2 min
Tiempo total de corrida
12,30 min
Temperatura
300 0C
Flujo de hidrgeno
36 ml/min
Flujo de aire
400 ml/min
Preparacin de estndares y curvas de calibracin.
El anlisis
cuantitativo del mtodo analtico optimizado se bas en la estandarizacin

interna y la estandarizacin externa. Se utiliz como estndar interno al nbutanol, el cual fue adicionado a las soluciones estndar en un
volumen
constante (250 l) equivalente a una concentracin de 8,1 g/ l en la solucin

final (25 ml).
La curva de calibracin de etanol se realiz a 4 niveles en un rango lineal de
0.01-0.5 g/l. Las soluciones estndares se obtuvieron a partir de etanol
absoluto por dilucin con agua destilada. La preparacin de las soluciones
estndares se detalla en la tabla 2.
Pgina 33
Tabla 2 Concentraciones del etanol y n-butanol
ETANOL
N-BUTANOL
ABSOLUTO
(estndar interno)
Vol.
Conc.
Vol.
Etanol
Etanol
butanol
(l)
(mg)
0,5
Conc.
butanol
Aforo
Etanol(g/l
(l)
(g/l)
(ml)
0,395
250
202,9
25
0,0158
8,1
1,5
1,186
250
202,9
25
0,0474
8,1
2,372
250
202,9
25
0,0948
8,1
16
12,652
250
202,9
25
0,5061
8,1
2.2.4
Optimizacin del mtodo. En el
preparacin de la muestra,
Conc.
n-
Conc.
Vol.
ID
n-
nbutano
l (g/l)
presente trabajo se optimiz la
los parmetros de selectividad y linealidad del
mtodo analtico.
2.2.4.1 Tratamiento de muestras. Para la optimizacin de la preparacin de
las muestras sanguneas se realizaron las siguientes modificaciones en la
tcnica:
Inicialmente la preparacin de las muestras se llev a cabo siguiendo la

metodologa publicada (Pontes, y otros, 2009), en la que se mezcla: 100 l
de sangre, 10 l de N-butanol, 195 l de Acetonitrilo y 195 l de Tween 20
, y luego se centrifuga por 5 minutos a 1600 rpm.
A partir de este mtodo se obtuvo una solucin lechosa, por lo cual se

decidi modificarla. La cantidad Tween 20 fue disminuda de 195 a 90 l
y, a su vez, se increment la cantidad de acetonitrilo de 195 a 300l.
Adems se prolong el tiempo de centrifugacin de 5 a 10 min a 2000 rpm.
A partir de esta modificacin; se obtuvo una cantidad concentrada pero

insuficiente de sobrenadante por lo que se prosigui con la siguiente
modificacin. Se aadi agua destilada (500 l) a la mezcla y se centrifug.

Pgina 34
Con esta ltima modificacin se logr obtener una correcta separacin del
sobrenadante.
Mediante estas modificaciones se optimiz la extraccin del etanol de la
sangre total, cuyo procedimiento se detalla a continuacin:
a. Se colocaron 100 l de sangre en un tubo de vidrio tapa rosca.
b. Se aadi 10l n-butanol (estndar interno) y se mezcl en un
homogeneizador vortex por 30 segundos.
c. Se diluy la muestra a 500 l, aadiendo 90 l de Tween 20 y 300 l
de acetonitrilo. Est solucin se mezcl en un homogeneizador vortex
por 30 segundos.
d. La solucin se centrifug a 2000 rpm durante 10 minutos.
e. Se extrajo el sobrenadante en otro tubo de vidrio y se adicionaron 500l
de agua destilada.
f. La muestra se conserv a 4 C hasta el momento de inyeccin en el
cromatgrafo.
2.2.4.2 Linealidad. Se evalu en un rango lineal desde 0,0158 g/ l hasta
0,5061 g/l considerando la relacin entre la concentracin (analito/ estndar
interno) y el rea (analito- estndar interno).
2.2.4.3 Selectividad. Para evaluar la selectividad del mtodo los interferentes
fueron descartados mediante la verificacin de la ausencia de picos en los
tiempos de retencin de los analitos estudiados
2.2.5 Aplicabilidad del mtodo.
Para evaluar la aplicabilidad del mtodo
optimizado para la deteccin y cuantificacin de etanol en sangre por

cromatografa de gases (GC-FID) se analizaron muestras sanguneas de
voluntarios despus de haber ingerido una bebida alcohlica (100 ml de Ron
San Miguel de Oro). Estas muestras fueron tomadas a distintos horarios para
poder ser usadas como puntos de referencia (pool de muestras) de alta, media
y baja concentracin de etanol en sangre, as:
Muestras de concentracin alta: Una parte de las muestras (pool

donador 1-6) fueron extradas en la maana y la otra parte (pool

Pgina 35
donador 7-11) fueron extraidas en la noche, las 2 extracciones se

realizaron despus de 1 hora tras la ingesta de la bebida alcohlica.
Muestras de concentracin media: Fueron extradas en la maana

(pool donador 1-6) y noche (pool donador 7-11) despus de 2 horas
tras la ingesta de la bebida alcohlica.
Muestras de concentracin baja: Fueron extradas en la maana

(pool donador 1-6) y noche (pool donador 7-11) con un ayuno previo
de 6 horas.
2.2.5.1 Toma de muestras sanguneas. Se recolectaron muestras de sangre

total de 11 voluntarios, mediante el siguiente procedimiento:
a. Se desinfect la zona de puncin con agua oxigenada (producto no
alcohlico).
b. Se extrajeron
5 ml de sangre en un tubo con tapn gris claro,
debidamente codificado, que contena el anticoagulante oxalato de

potasio y el inhibidor glicoltico fluoruro de sodio que evita la
fermentacin.
c. Se agit suavemente la muestra de sangre total recolectada durante 1
minuto.
d. Se conserv la muestra a temperatura en refrigeracin (4C) hasta el
momento del anlisis.
2.2.5.2 Procesamiento y anlisis de datos. Los datos obtenidos fueron
procesados en el software Chemstation (Agilent, USA) y en el programa Excel
2007.

Pgina 36
3. RESULTADOS
3.1 Optimizacin del tratamiento de la muestra. El tratamiento de la muestra

para la extraccin del etanol de sangre total fue optimizado a partir de la
metodologa publicada por (Pontes, y otros, 2009). Mediante ciertas
modificaciones se optimiz el procedimiento se detalla a continuacin:
Se colocaron 100 l de sangre en un tubo de vidrio tapa rosca.
Se aadi 10 l de N-butanol (estndar interno), y se mezcl en un

homogeneizador vortex por 30 segundos.
Se diluyo la muestra a 500 ml, aadiendo 90 l de Tween 20 y 300 l

de Acetonitrilo. Esta solucin se mezcl en un homogeneizador vortex
por 30 segundos.
La solucin se centrifug a 2000 rpm durante 10 minutos.
Se extrajo el sobrenadante en otro tubo de vidrio y se adicionaron 500 l

de agua destilada
La muestra se conserv a 4C hasta el momento de inyeccin en el

cromatgrafo.
3.2 Optimizacin de los parmetros cromatogrficos
3.2.1 Parmetros cualitativos. El etanol fue detectado a un tiempo de

retencin promedio en los estndares de la curva de calibracin fue de 4,1
0,01 min, mientras que el n-butanol (estndar interno) fue detectado a 7.1
0,003 min (Tabla 3.3). En el pool de muestras sanguneas, el tiempo de
retencin promedio de etanol fue de 4,0 0,02 min y del n-butanol fue
detectado a 6,9 0,01 min (Tabla 3.4).
En cuanto a la selectividad del mtodo analtico, en el cromatograma se
registran solo los picos de los analitos de inters por lo tanto hubo ausencia de
sustancias interferentes provenientes de las muestras sanguneas (Figura 3.3).

Pgina 37
3.2.2 Parmetros cuantitativos. La linealidad de la curva de calibracin de

etanol fue establecida en un rango de
0,0158 g/L - 0,5061 g/L con un
coeficiente de determinacin R2 de 0.996 (Figura 3.4). Las reas y

concentraciones obtenidas para la curva de calibracin se presentan en la tabla
3.
Figura 3. Cromatograma del anlisis de etanol en sangre a una concentracin de
0,15 g/L de etanol y 8,1 g/L de n-butanol
Fuente: Autoras

Pgina 38
Tabla 3 reas y concentraciones de los estndares en la curva de calibracin de

etanol con estndar interno.
ETANOL
N-BUTANOL
(estndar interno)
Conc.
Conc.
Tiempo de
Etanol (g/l)
retencin
0,0158
n-
butanol
Tiempo
de rea
rea Etanol /
rea
(g/l)
retencin
(pA)
n-butanol
4,086
3,797
8,1
7,097
1802,2
0,002
0,0474
4,077
4,963
8,1
7,096
1678,8
0,003
0,0948
4,104
14,162
8,1
7,102
2351,4
0,006
0,5061
4,074
76,851
8,1
7,097
1758,1
0,044
Figura 4 Curva de calibracin para el etanol/n-butanol.
Curva de calibracin
rea Etanol/n-butanol
0,050
y = 0,0875x - 0,0008
R = 0,9961
0,040
0,030
0,020
0,010
0,000
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Conc. Etanol (g/l)
Fuente: Autoras

Pgina 39
3.3 Aplicabilidad en pool de muestras sanguneas

Para evaluar la aplicabilidad del mtodo se investig un total de 33 muestras
sanguneas provenientes de voluntarios despus de haber ingerido 100 ml de
una bebida alcohlica (Ron San Miguel). Las muestras fueron clasificadas en
tres grupos: alta, media y baja concentracin y fueron usadas como puntos de
referencia (pool de muestras) (Tabla 4)

Pgina 40
Tabla 4 reas y concentraciones del pool de muestras de sangre de alta, media y baja concentracin de etanol
ETANOL
N-BUTANOL
(estndar
interno)
ID
Tiempo
ETANOL/
ESTNDAR
INTERNO
Pool-
Pool-
Tiempo
Donador
concentracin
retencin
(pA)
retencin
(pA)
butanol
x=(y-b)/m
Alto
4,086
6,642
7,097
1798,9
0,0037
0,033
0,33
Alto
4,077
7,400
7,096
2002,6
0,0037
0,033
0,33
Alto
4,104
2,536
7,102
1170,4
0,0022
0,016
0,16
11
Alto
4,074
4,101
7,097
1979,1
0,0021
0,015
0,15
14
Alto
4,093
3,100
7,108
1226,3
0,0025
0,020
0,20
17
Alto
4,131
2,410
7,117
1100,4
0,0022
0,016
0,16
20
Alto
4,135
5,800
7,118
1305,0
0,0044
0,042
0,42
23
Alto
4,126
6,012
7,112
1644,5
0,0037
0,033
0,33
26
Alto
4,13
6,100
7,113
2026,3
0,0030
0,025
0,25
29
10
Alto
4,129
7,637
7,115
1674,3
0,0046
0,043
0,43
32
11
Alto
4,131
2,200
7,113
1383,1
0,0016
0,009
0,09

de rea
CLCULO
de rea
rea
Etanol/n- Conc
Conc. Final
Pgina 41
Medio
4,084
3,800
7,095
2025,1
0,0019
0,012
0,12
Medio
4,084
3,800
7,095
2025,1
0,0019
0,012
0,12
Medio
4,09
7,525
7,099
1482,8
0,0051
0,049
0,49
12
Medio
4,079
3,015
7,097
1882,9
0,0016
0,009
0,09
15
Medio
4,097
2,100
7,109
1707,9
0,0012
0,005
0,05
18
Medio
4,135
1,900
7,119
2062,7
0,0009
0,001
0,01
21
Medio
4,137
2,400
7,116
1662,8
0,0014
0,007
0,07
24
Medio
4,126
4,016
7,111
1387,3
0,0029
0,024
0,24
27
Medio
4,129
4,200
7,114
1900,4
0,0022
0,016
0,16
30
10
Medio
4,133
5,500
7,116
1748,9
0,0031
0,027
0,27
33
11
Medio
4,1
0,600
7,109
1868,0
0,0003
-0,005
Bajo
4,124
0,906
7,101
1724,3
0,0005
-0,003
Bajo
4,082
7,091
2227,7
Bajo
4,082
7,1
1494,7
10
Bajo
4,082
7,099
2044,4
13
Bajo
4,082
7,107
2124,9

Pgina 42
16
Bajo
4,131
1,038
7,117
2385,4
0,0004
-0,0042
19
Bajo
4,131
0,906
7,115
1404,0
0,0006
-0,0018
22
Bajo
4,132
0,600
7,114
1364,7
0,0004
-0,0041
25
Bajo
4,124
0,604
7,111
1645,0
0,0004
-0,0049
28
10
Bajo
4,082
7,114
2321,2
31
11
Bajo
4,082
7,115
1607,2
* Concentracin final tras correccin con el factor de dilucin (1/10)

Pgina 43
4. DISCUSIN
En la actualidad existen diferentes mtodos de evaluacin de la ingesta de
alcohol, lo cual inicia con pruebas fsicas de equilibrio, coordinacin y
percepcin espacial. La subjetividad de estas pruebas demanda que para la
utilizacin de mtodos ms cuantitativos para la deteccin de etanol en fluidos
corporales, que incluyen la determinacin de etanol en el aliento por la tcnica
alcohol-sensor (Henao & Vaca, 2010); determinacin de etanol en sangre total
por tcnicas enzimticas por reaccin con la enzima alcohol deshidrogenasa, y
los mtodos de microdifusin por reaccin de xidoreduccin. Sin embargo,
estas tcnicas son consideradas poco confiables a nivel cuantitativo ya que
presentan interferencias con otras sustancias voltiles y proporcionan
resultados inciertos (Ferrari, 2008). En contraste, la tcnica de cromatografa
de gases es un mtodo
ms selectivo, verstil, de excelente precisin y
exactitud (Varcarcel & Gomez, 1988).

Este trabajo de tesis presenta la primera fase de la optimizacin de un mtodo
para el anlisis de alcoholemia por cromatografa de gases con inyeccin
directa y deteccin de ionizacin a la llama. Para este mtodo se utiliz
cromatografa
de
gases
con
inyeccin
directa.
diferencia
de
la
instrumentacin usual para esta determinacin, en este mtodo no se utiliz el

dispositivo para la inyeccin de espacio de cabeza (head space) que permite
eliminar los efectos de la matriz (Monteiro & Colaboradores, 2014) pero su
costo es muy elevado (Gerchman, Schnitzer, Gal, Mirsky, & Chinko,
2012)(Pontes, y otros, 2009). Es as, que se opt por mtodo relativamente
ms econmico que incluye un tratamiento previo a las muestras sanguneas
para reducir las interferencias (Jain, 1971).
Para la extraccin del etanol se realiz una seleccin de sustancias
extractantes y de patrn interno en los cuales se evaluaron las siguientes
caractersticas: moderada a baja volatilidad, baja solubilidad en agua, distintos
tiempos de retencin para permitir una cuantificacin fiable de compuestos
orgnicos.
Pgina 44
Como agente extractante se utiliz acetonitrilo que es un solvente de mediana

polaridad y que produjo precipitacin en la muestra de sangre, permitiendo una
buena desproteinizacin de una manera ms simple y en menor tiempo
(Alvarez Guerra, G. Parkes, & D. Bell, 2006). Por su parte, el tensoactivo
Tween 20 fue elegido debido a su accin detergente que permiti la lisis
celular de los componentes sanguneos. Esta lisis ocurre a nivel de la
membrana celular, en donde los detergentes rompen la barrera lipdica
solubilizando las protenas e interrumpiendo la interaccin lpido-lpido, lpidoprotena y protena-protena (Jimenez, 2015). Esta lisis permiti la completa
extraccin del etanol y cuyos residuos fueron finalmente separados por
centrifugacin. La dilucin del extracto permiti una reduccin adicional de los
interferentes de la muestra.
En la optimizacin del presente mtodo se evaluaron algunos parmetros
cualitativos y cuantitativos. Los tiempos de retencin de los estndares y de
etanol en muestras sanguneas fueron comparados y se obtuvo una variacin
de 0.1, demostrando as la aplicabilidad del mtodo en muestras reales. Se
evalu tambin la selectividad verificando la ausencia de sustancias
interferentes junto a los analitos en los cromatogramas. Adems, la linealidad
a un rango muy bajo (0,0158 g/ l hasta 0,5061 g/l) result satisfactoria (R 2 =
0.996)

Pgina 45
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones
En el presente trabajo de tesis se optimiz la primera fase del mtodo para la
determinacin de alcoholemia mediante cromatografa de gases con inyeccin
directa y deteccin de ionizacin a la llama (FID). Particularmente, se optimiz
el tratamiento de la muestra, la selectividad, la linealidad a rangos de baja
concentracin y la aplicabilidad en muestras sanguneas. La cuantificacin de
alcoholemia
se
realiz
con
estandarizacin
interna
(n-butanol)
estandarizacin externa (curva de calibracin a 4 niveles).

Este mtodo, aunque requiere de pruebas adicionales de optimizacin y su
posterior validacin, podra representar una alternativa econmica y rpida que
requiere un volumen de muestra muy pequeo (100 ul).
5.2 Recomendaciones
Se recomienda continuar con los estudios de optimizacin y validacin, que
incluya precisin, exactitud, linealidad a niveles de concentracin ms altos,
lmites de deteccin y cuantificacin, entre otros. Adems, se podra explorar el
uso de columnas cromatogrficas alternativas. Por ejemplo, la columna HPBlood Alcohol de 7.5 metros de longitud x 0.32 mm de dimetro interno y 2.00
m de pelcula, que por tener una fase estacionaria ms robusta podran
adaptarse mejor a este mtodo y permitir la reduccin del tiempo de anlisis,
aumentar el tiempo de vida de la columna y resistir a la carga de sustancias
solubles acompaantes a los analitos en la muestra.
El mtodo de anlisis cuantitativo de alcoholemia, una vez optimizado y
validado, podra aplicarse no solo para el control de alcoholemias sino tambin
en estudios varios de metabolismo y toxicologa.

Pgina 46
REFERENCIAS
ABS. Costa Rica (2005, noviembre 30). Prueba rpida de alcohol por
saliva.Obtenido
de
http://www.abs-
cr.com/documentos/prueba_rapida_alcohol.pdf
Agilent Technologies (2001, julio 30), Filtros de purificacion de gases . Obtenido

de http://www.chem.agilent.com/Library/brochures/5990-8243ES.pdf
Alvarez Guerra, E. D., G. Parkes, H., & D. Bell, J. (2006). Estudio comparado
de dos mtodos de desproteinizacin para la evaluacin de sangre total y
plasma mediante espectroscopa de resonancia magntica . Redalyc.
Bioquimia, 67. Disponible en: http://www.medigraphic.com/pdfs/bioquimia/bq2006/bq062d.pdf
Barquero Quirs, M. (2006). Principios y Aplicaciones de la cromatografa de

Gases (1 ed). San Jos: Editorial Universidad de Costa Rica.
Bataller, R. (2004). Toxicologa Clnica. (1ra. Ed.). Valencia: Universidad de

Valencia.
Beckman
Coulter,
Inc.
(septiembre
de
2003).
Sistemas SYNCHRON
Etanol.Obtenido de http://www.crbreus.org/pnt/alcohol.pdf
Buzzo, A., & Soria, M. F. (1960). Toxicologa. (5ta. ed).Buenos Aires: Editorial
Libreros.

Pgina 47
Camean, A., Lpez Artiguez, M., Martnez, D., Menendez, M., Reppeto, G.,
Reppeto, M,Soriano, M. T. (1995). Toxicologa Avanzada. Madrid: Editorial Daz
de Santos S.A.
Chiriboga, V. (20 de Enero de 2003). Reglamento sobre conduccion de
vehiculos bajo la influencia de alcohol, drogas o sustancias estupefacientes.
Disponible
en:
http://www.derechoecuador.com/productos/producto/catalogo/registrosoficiales/2003/enero/code/17742/registro-oficial-20-de-enero-del-2003suplemento
Diaz Garnica, A., & Moreno, H. (2000). Alcohol, Embriaguez en lesiones

personales culposas, Validez Del Dictamen Pericial. Resolucion Interlocutoria
N.- 1-59, (pg. 9). Cali.
Fabre,R. & R. Truhaut.Tratado de Toxicologa. Madrid: Editorial Paraninfo.
Fernndez, I., & Garcia, E. (2010). Cuantificacin de compuestos por

cromatografa: Mtodo del Patrn Interno. Universidad Politcnica de Valencia.
Recuperado
Enero
15,
2015.
Disponible
en
http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/16356/M%C3%A9todo%20Patr%C3
%B3n%20Interno.pdf?sequence=2
Ferrari, L. A. (2008). Anlisis Toxicolgico del etanol y su interpretacin

Forense. Ciencia Forense Latinoamericana.
Gerchman Y, Schnitzer A. Gal R, Mirsky N, & Chinko N. (2012, February). A

simple rapid gas-chromatography flame-ionization-detector (GC-FID) method
for the determination of ethanol from fermentation processes. African Journal of
Biotechnology. 11(15).
Pgina 48
Harris, D. (2003). Anlisis Qumico Cuantitativo.(3.ed) Barcelona: Editorial

Revert.
Henao, L., & Vaca, E. (2010). Validacin de la Determinacin de alcoholemia y

metanol por Cromatografa de Gases con automuestreador de voltiles e
Identificacin de acetaldehdo,
acetona y 2-propanol. Universidad
Tecnolgica de Pereira. Recuperado Septiembre 20, 2014. Diponible en:

http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/11059/1685/1/61595131H493.pdf
Jain, N. (1971). Direct Blood-Injection Method for Gas Chromatographic

Determination of Alcohols and Other Volatile Compounds. Clinical Chemistry,17
(2)
Jimenez, L. (2015) Lisis celular por medio de detergentes. Disponible en:

http://www.academia.edu/10194525/Lisis_celular_por_medio_de_detergentes
Jones, A. (1995). Measuring ethanol in saliva with the QED enzymatic test
device: comparison of results with blood- and breath-alcohol concentrations.
Department of Forensic Toxicology, University Hospital, Linkping, Sweden. 19
(3): 169-74.
Ladrn de Guevara , J., & Moya Pueyo, V. (1995). Toxicologa mdica clnica y
laboral. Madrid: Editorial McGraw-HILL.
Ley Orgnica de Transporte Terrestre Trnsito y Seguridad Vial, Ley 1, 2014

(supl 2008).
Pgina 49
Martinis, B. Martins M, Santos M. C. (Agosto 2004). Determination of ethanol in

human blood and urine by automated headspace solid-phase microextraction
and capillary gas chromatography. Journal elsevier, Analytica Chimica Acta.
Recuperado Septiembre 14, 2014 de www. elsevier.com/locate/aca
Monteiro, C., Franco, J. M., Proena, P., Castaera, A., Claro, A., Vieira, D. N.,
& Corte-Real, F. (2014). Qualitative and quantitative analysis of a group of
volatile organic compounds in biological samples by HS-GC/FID: application in
practical cases. Forensic science international, 243, 137-143.
Nollet, L. (2006). Chromatographic Analysis of the Environment. En L. M. L

Nollet , Chromatographic Analysis of the Environment (pg. 143). United States:
Robert Lee.
Olgun, L., & Rodrguez, H. (2004). Instituto de Biotecnologa: Mtodos en

Biotecnologa: Cromatografa de gases.Consultado Enero 16, 2015 desde
Universidad
Autonoma
de
Mxico,
pag.
16-17.
Sitio
Web:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/cromatografia_de_gases.pdf
Parrales, A., Reyes, M., & Pine, W. (2012). Cromatografa del Gas Natural.
Obtenido Noviembre 22, 2014 de Escuela Superior Politcnica del Litoral.
SitioWeb: http://www.cib.espol.edu.ec/Digipath/D_Tesis_PDF/D-94183.pdf
Pontes, H., De Pinho, P. G., Casal, S., Carmo, H., Santos, A., Magalhes, T., ...
& Bastos, M. L. (2009). GC determination of acetone, acetaldehyde, ethanol,

Pgina 50
and methanol in biological matrices and cell culture. Journal of chromatographic

science, 47(4), 272-278.
Repetto, M. (1995). Toxicologa Avanzada. Madrid:Editorial Daz de Santos,

S.A.
Rosero, J. (Marzo 2014). El consumo de alcohol en los adolescentes de lo

ilegal a lo socialmente aceptable. Revista PostData. Edicin 1. Obtenido de:
http://www.ecuadorencifras.gob.ec/documentos/webinec/Revistas/postdata.pdf.
Serrano, M., & Velez, E. (2011). dspace.ucuenca.edu.ec. Obtenido de

http://dspace.ucuenca.edu.ec/bitstream/123456789/2438/1/tq1078.pdf
Silva , H. (1995). Medicina Legal y Psiquiatra Forense.(1995). Chile: Edtorial
Jurdica de Chile
Simonin , C., Snchez Maldonado, G., Sales Vzquez, M., & Hernandez
Linares, E. (1962). Medicina Legal Toxicolgica. Barcelona. Editorial: Jims.
Skoog A., D., Vest M. , D., & Holler, J. (2001). Fundamentos de Qumica
Analtica. (pg. 694). Barcelona. Editorial Revert.
Skoog, D., Holler, F., & Nieman, T. (2001). Principios de Anlisis instrumental.
(pg. 751 - 753). Madrid. Editorial Mc-Graw Hill.

Pgina 51
Tllez Rodrguez, N. R. (2002). Medicina Forense: Manual Integrado.(1.ed).

Bogot: Editorial Panamericana formas e impresos
Uribe Acevedo, R. (2013). Portal biblioteca Universidad de Antioquia.
Alcoholes. Obtenido Noviembre 26,2014 de Universidad de Antioquia. Stio
Web:
http://www.udea.edu.co/portal/page/portal/bibliotecaSedesDependencias/unida
desAcademicas/FacultadMedicina/BilbiotecaDiseno/Archivos/Departamentos/Al
coholes-farmacologia-toxicologia-medicina-udea.pdf
Varcarcel Cases, M., & Gomez Henz, A. (1988). Tecnicas Analiticas de
Separacion. Barcelona: Editorial Revert SA.
Vargas Alvarado, E. (1991).Medicina Forense y Deontologa Medica. Distrito

FederalMxico: Editorial Trillas.

Pgina 52

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UNIVERSIDAD DE CUENCA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

ESTANDARIZACIN DEL MTODO PARA ALCOHOLEMIAS POR

TESIS PREVIA A LA OBTENCIN DEL

AUTORAS: DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

DIRECTORA: SILVIA JOHANA ORTIZ ULLOA, Ph.D.

DR. MANUEL GUILLERMO VEGA CUESTA

La ingesta de etanol se ha relacionado a consecuencias lamentables a nivel

Palabras claves: Alcoholemia, cromatografa de gases, ionizacin de llama,

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

Key Words: alcohol, gas chromatography, flame ionization, optimization

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

1.6.6 Anlisis de alcoholemias por cromatografa de gases. ................................30

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

Figura 1 Esquema del cromatgrafo de gases. ...........................................................20

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

CLUSULA DE DERECHOS DE AUTOR

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

CLUSULA DE PROPIEDAD INTELECTUAL

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

El presente trabajo queremos agradecer en primer a Dios y a la Virgen Mara

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

Segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), Ecuador en el 2013, fue el

accidentes de trnsito, violencia

intrafamiliar y muerte (Rosero, 2014). Adems, segn la Agencia Nacional de

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

1.1.1 Manifestaciones txicas del alcohol etlico. La clsica exteriorizacin

(Buzzo & Soria, 1960). Los efectos

txicos del etanol radican en la depresin de las funciones del Sistema

depresores y la concentracin de alcohol en sangre central (Bataller, 2004). Asi

1) Ligera (Concentracin de etanol en sangre de 0,5 - 1,5 g/L): Caracterizada

muscular(Bataller, 2004). Adems se presenta un estado psquico de

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

1.2 Fundamentacin Legal

consumidores de etanol, tabaco y sustancias estupefacientes y psicotrpicas

Las siguientes normativas hacen referencia especfica a la alcoholemia y sus

La ley de trnsito (Art. 145.2) quien condujera en estado de embriaguez,

De las pruebas y su valoracin (Art. 150), cuando un agente de trnsito

La ley de trnsito y transporte terrestre (Art. 151), cuando producido un

De los delitos de trnsito (Art. 126), quien conduciendo un vehculo en estado

ocasionare un accidente de trnsito del que resulten una o ms personas

limitacin se encuentra en labilidad

trmica de los analitos, los cuales deben ser estables a la temperatura

Filtros de oxgeno y humedad

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

Fuente: (Skoog A., Vest M. , & Holler, 2001)

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

El hidrgeno permite una alta movilidad originando tiempos de anlisis

El helio proporciona en la mayora de los casos las mejores

El nitrgeno es barato, seguro, tiene una fcil purificacin, pero presenta

1.4.3 Filtros de oxgeno.

El sistema de filtros de purificacin de gases

proporciona gases ms puros y reduce el riesgo de que la columna sufra daos

La precisin de la inyeccin depende de la velocidad de

inyeccin y la cantidad de muestra inyectada. Los volmenes de inyeccin son

DIANA ESTEFANA NARVEZ CHACN

1.4.5 Columna cromatogrfica. La columna es el componente esencial del

Una vez separado los componentes de la

muestra en la columna, estos pasan por un sistema de deteccin que origina