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Araraquara, SP 2009
ii
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
JLIO DE MESQUITA FILHO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS
CMPUS DE ARARAQUARA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS
Dissertao
Graduao
Pesquisa
apresentada
em
e
Medicamentos,
Cincias
ao
Programa
Farmacuticas,
Desenvolvimento
da
de
Faculdade
de
Ps-
rea
de
Frmacos
de
Cincias
do
Ttulo
de
Mestre
em
Cincias
Farmacuticas.
iii
Ficha Catalogrfica
Elaborada Pelo Servio Tcnico de Biblioteca e Documentao
Faculdade de Cincias Farmacuticas
UNESP Campus Araraquara
CAPES: 403000005
iv
Eclesitico 1.
vi
vii
Willian Shakespeare
viii
pela
confiana,
pelos
ensinamentos,
ix
... Depois de algum tempo voc aprende a construir todas as suas
estradas no hoje, porque o terreno do amanh incerto demais ...
Aprende que verdadeiras amizades continuam a crescer mesmo a
longas distncias
Descobre que as pessoas com quem voc mais se importa na vida so
tomadas de voc muito depressa... por isso sempre devemos deixar as
pessoas que amamos com palavras amorosas; pode ser a ltima vez que
as vejamos. Aprende que as circunstncias e os ambientes tm
influncia sobre ns, mas ns somos responsveis por ns mesmos.
Comea a aprender que no se deve comparar com os outros, mas com o
melhor que pode ser. Descobre que se leva muito tempo para se tornar
a pessoa que quer ser, e que o tempo curto
Aprende que, ou voc controla seus atos, ou eles o controlaro...
Aprende que heris so pessoas que fizeram o que era necessrio fazer,
enfrentando as conseqncias
Aprende que pacincia requer muita prtica
Aprende que maturidade tem mais a ver com os tipos de experincia
que se teve e o que voc aprendeu com elas do que com quantos
aniversrios voc celebrou. Aprende que h mais dos seus pais em voc
do que voc supunha e que nunca se deve dizer a uma criana que
sonhos so bobagens...
Aprende que nem sempre suficiente ser perdoado por algum...
Algumas vezes voc tem de aprender a perdoar a si mesmo
E voc aprende que realmente pode suportar... que realmente forte, e
que pode ir muito mais longe depois de pensar que no se pode mais. E
que realmente a vida tem valor e que voc tem valor diante da vida!
Nossas dvidas so traidoras e nos fazem perder o bem que poderamos
conquistar se no fosse o medo de tentar.
William Shakespeare
x
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar comigo todos os dias me protegendo e
fortalecendo, mas especialmente naqueles em que os momentos mais
difceis e complicados somados saudade dos meus queridos me davam
vontade de jogar tudo para o alto e desistir. Mas a f, a esperana, o
otimismo, a luz do Esprito Santo me iluminaram para que conseguisse
dar mais este passo. Guarda-me Deus, pois eu me abrigo em ti (Salmo
16)
Ao meu querido filho Gabriel, por compreender e perdoar os
momentos de ausncia, pelo seu carinho, amor e torcida para que este
trabalho fosse concludo.
Aos
meus
queridos
pais,
por
serem
exemplos
de
pessoas
Faculdade
de
Cincias
Farmacuticas
da
Universidade
xi
Ao
Departamento
de
Frmacos
Medicamentos
da
FCF
(UNESP).
Prof. Dra. Tas Maria Bauab, pela colaborao nos ensaios de
atividade antimicrobiana realizados neste trabalho.
Profa. Dra. Vera Lcia Isaac Borges e Profa. Dra. Maria Jos
Vieira Fonseca por participarem da banca de qualificao e pelas
observaes pertinentes.
Prof Dra. Maria Jos Vieira Fonseca e Prof Dra Maria
Stella Gonalves Raddi por participarem da banca de defesa desta
dissertao e pelas sugestes e crticas para melhoria deste trabalho.
Ao Renato e Francisco, da SAEPE, pelo apoio tcnico com as
fotografias utilizadas neste trabalho.
Aos funcionrios da biblioteca, Max, Ana Cristina, Rita, Moacir,
Natalina, Irani e tambm aos demais, por sempre terem me ajudado
prontamente nos momentos de dvida.
s funcionrias da Ps-graduao, Cludia, Laura e Snia, pelos
esclarecimentos necessrios.
Aos amigos e colegas deste Curso de Ps-Graduao.
Aos amigos do Laboratrio de Controle Biolgico de Qualidade de
Frmacos e Medicamentos, Andria Moreno, Cristina Laignier, Dbora
Perez, Sandra Monteiro, Patrcia Ricarte, Daniela Vieira, Cristiani
Lopes, Jaqueline Perez, Marcelo Hiene, Mariana Passoni, Adam de
Oliveira, pelas conversas, dicas, criticas, auxlios e momentos de
descontrao para que esta caminhada fosse menos difcil.
Maria de Ftima Rodrigues, pelo apoio tcnico e acima disso
pela amizade, companheirismo, conselhos e momentos de diverso. Voc
muito especial !
minha querida estagiria Jaqueline, que muito me auxiliou na
realizao do teste desafio e nos ensaios de atividade antimicrobiana, e
xii
minha
querida
amiga
Cristina
Laignier
pela
amizade
conquistada em um dos momentos mais difceis deste Curso de PsGraduao, por muitas vezes reservar um pouquinho do seu tempo
para me auxiliar contribuindo com idias e sugestes e principalmente
ter ajudado os dias serem menos cansativos com suas brincadeiras. Cris,
obrigada por sua amizade, voc muito querida!
Aos meus tios Zilda e Gilberto, pelas oraes, apoio e por sempre
terem estado junto de mim.
A todos os outros tios, tias e primos que me fortaleceram com suas
oraes e apoio.
Ao meu querido amigo Wendel Cleber Soares, que, mesmo sem
saber, sempre foi exemplo de dedicao, determinao, organizao,
competncia e acima de tudo, humildade.
querida tia Clarice, pelas oraes e amizade desde os meus
primeiros anos.
Ao meu querido amigo Marcelo Tozette, pelas descontraes para
me encorajar, apoio e torcida para que tudo desse certo.
CAPES, pelo apoio financeiro.
Eclesitico. 6-5.
xiii
SUMRIO
AGRADECIMENTOS......................................................................................................
ix
SUMRIO.......................................................................................................................
xii
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................
xvii
LISTA DE TABELAS.......................................................................................................
xx
xxiv
xxvii
RESUMO........................................................................................................................
xxix
ABSTRACT.....................................................................................................................
xxxi
1. INTRODUO..........................................................................................................
2. OBJETIVOS..............................................................................................................
3. REVISO BIBLIOGRFICA........................................................................................ 7
3.1. Microbiota ou flora normal da pele...........................................................................
10
3.4. Anti-spticos............................................................................................................
13
3.5. Clorexidina...............................................................................................................
14
4.
DE DIGLUCONATO
DE
CLOREXIDINA................................................................................................................
34
35
35
35
36
36
36
36
4.2.2.2. Mtodo...............................................................................................................
36
4.2.2.3. Resultados.........................................................................................................
37
38
38
4.2.3.2. Resultados.........................................................................................................
38
38
xiv
4.2.4.1. Material..............................................................................................................
38
4.2.4.2. Mtodo...............................................................................................................
38
4.2.4.3. Resultados.........................................................................................................
39
39
4.2.5.1. Material..............................................................................................................
39
4.2.5.2. Mtodo...............................................................................................................
39
4.2.5.3. Resultados.........................................................................................................
39
40
4.2.6.1. Material..............................................................................................................
40
4.2.6.2. Mtodo...............................................................................................................
40
4.2.6.3. Resultados.........................................................................................................
40
42
4.2.7.2. Mtodo...............................................................................................................
43
43
4.2.7.3. Resultados.........................................................................................................
43
4.2.7.4. Discusso........................................................................................................... 45
4.3. Anlise quantitativa da soluo de digluconato de clorexidina ...............................
46
46
46
47
48
48
4.3.1.5. Material..............................................................................................................
48
48
48
4.3.1.8. Resultados.........................................................................................................
49
4.3.1.9. Clculos.............................................................................................................
50
50
51
52
53
53
55
4.3.1.12. Discusso........................................................................................................
55
xv
QUALIDADE..................................................................................................................
58
59
5.1.2. Material.................................................................................................................
59
5.1.3. Mtodo..................................................................................................................
60
61
61
5.2.1.1. Discusso..........................................................................................................
62
5.2.1.1.1. Formulaes...................................................................................................
62
62
63
63
63
64
64
5.2.2.2. Resultados.........................................................................................................
64
64
5.2.3.1. Resultados.........................................................................................................
64
5.2.3.2. Discusso..........................................................................................................
65
66
66
66
66
67
5.3.2. Resultados............................................................................................................
67
5.3.3. Discusso.............................................................................................................
68
69
6.1. Mtodos...................................................................................................................
70
70
71
71
71
71
71
71
xvi
6.2.1.1.3. Padronizao e adaptao dos ensaios de atividadee antimicrobiana doss
diferentes sabonetes lquidos contendo digluconato de clorexidina a 1, 2, 3, e 4% peloo
mtodo de difuso em gar............................................................................................. 72
6.2.2. Resultados............................................................................................................
73
6.2.3. Discusso.............................................................................................................
77
6.2.4. Concluso.............................................................................................................
79
80
80
80
80
80
6.3.1.4. Leituras..............................................................................................................
83
6.3.2. Resultados................................................................................................
84
6.3.3. Discusso..................................................................................................
99
6.3.4. Concluso.................................................................................................
104
107
108
108
108
108
109
1110
111
7.8. Resultados...............................................................................................................
113
113
115
7.9. Discusso................................................................................................................
122
7.10. Concluso..............................................................................................................
126
127
8.1. Material....................................................................................................................
128
xvii
8.1.1. Preparo da substncia qumica padro secundrio..............................................
128
8.1. 2. Mtodo.................................................................................................................
128
129
131
133
134
134
134
8.3.3. Resultados............................................................................................................
135
136
136
137
8.4.3. Resultados............................................................................................................
137
8.5. Validao.................................................................................................................
138
8.5.1. Linearidade...........................................................................................................
138
8.5.2. Preciso................................................................................................................
138
8.5.3. Exatido................................................................................................................
139
139
8.5.5. Robustez...............................................................................................................
140
8.6. Discusso................................................................................................................
140
8.7. Concluso................................................................................................................
142
9. DISCUSSO GERAL..................................................................................................
143
10. CONCLUSES.........................................................................................................
149
xviii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura qumica do digluconato de clorexidina.............................................
16
37
41
41
44
44
45
45
49
51
51
Figura 14. Esquema da disposio dos sabonetes lquidos na placa de Petri para o
ensaio de atividade antimicrobiana pelo mtodo de difuso em gar............................
73
Figura 15. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a S. aureus
(a) e E. faecalis (b)..........................................................................................................
75
Figura 16. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a E. coli (c)
e C. albicans (d)..............................................................................................................
75
76
76
xix
Figura 19. Esquema da realizao do ensaio de atividade antimicrobiana pelo
mtodo de microdiluio.................................................................................................
82
93
94
94
95
95
96
96
97
97
98
98
99
99
111
113
116
xx
coli sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no
sabonete lquido isento e com digluconato de clorexidina..............................................
117
119
120
121
129
131
133
140
xxi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina e seus
sais..................................................................................................................................
24
26
29
secundrio
em
espectro
de
infravermelho
em
pastilhas
de
KBr..................................................................................................................................
42
47
47
Tabela 8. Valores dos dimetros dos halos de inibio de crescimento obtidos com a
soluo de digluconato de clorexidina, no ensaio microbiolgico pelo mtodo difuso
em gar..... .....................................................................................................................
50
52
Tabela 10. Anlise da varincia dos dados obtidos no ensaio microbiolgico pelo
mtodo de difuso em gar, da soluo de digluconato de clorexidina........ ................
53
54
55
59
59
60
60
60
65
xxii
Tabela 19. Valores em milmetros dos halos de inibio, obtidos no ensaio de
atividade antimicrobiana pelo mtodo de difuso em gar.............................................
74
84
85
85
86
86
87
87
88
88
89
89
90
90
91
91
92
xxiii
com as diferentes concentraes de digluconato de clorexidina....................................
100
114
114
114
115
115
Tabela 43. Log de UFC/g de P. aeruginosa, nas formulaes com e sem a presena
da clorexidina, em funo do tempo...............................................................................
115
Tabela 44. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes com e sem a presena de digluconato de clorexidina, utilizando P.
aeruginosa......................................................................................................................
116
Tabela 45. Log de UFC/g de E. coli, nas formulaes com e sem clorexidina, em
funo do tempo.............................................................................................................
117
Tabela 46. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes com e sem a presena de digluconato de clorexidina, utilizando E.
coli...................................................................................................................................
118
Tabela 47. Log de UFC/g de S. aureus, nas formulaes com e sem clorexidina, em
funo do tempo.............................................................................................................
118
Tabela 48. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes com e sem a presena de digluconato de clorexidina, utilizando S.
aureus.............................................................................................................................
119
Tabela 49. Log de UFC/g de C. albicans, nas formulaes com e sem clorexidina, em
funo do tempo............................................................................................................
1179
Tabela 50. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes com e sem a presena de digluconato de clorexidina, utilizando C.
albicans...........................................................................................................................
120
Tabela 51. Log de UFC/g de A. niger, nas formulaes com e sem clorexidina, em
funo do tempo.............................................................................................................
120
Tabela 52. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes com e sem a presena de digluconato de clorexidina, utilizando A.
niger................................................................................................................................
Tabela 53. Preparo da curva de Ringbom de digluconato de clorexidina por
121
xxiv
espectrofotometria na regio de ultravioleta a 260 nm...................................................
130
131
da
curva
analtica
de
digluconato
de
clorexidina
pelo
mtodo
133
134
136
Tabela 59. Preparo das solues para o teste de recuperao do sabonete lquido
com digluconato de clorexidina pelo espectrofotomtrico na regio de ultravioleta a
260 nm, utilizando etanol como solvente........................................................................
137
138
139
140
xxv
LISTA DE MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
1. Cromatografia em camada delgada da soluo de digluconato de clorexidina
Placa cromatogrfica Merck (Darmstadt), TLC com slica-gel 60 F254 (20 x 20
cm), com espessura de 0,25 mm.
Estufa Fanem 315 SE.
Cuba de vidro.
Fase mvel: acetato de etila: amnia concentrada: gua destilada: etanol
(1:1:3:5 v/v/v/v). Os reagentes utilizados foram: acetato de etila, Synth (Diadema), amnia
Synth (Diadema), etanol, Synth (Diadema).
Fase estacionria: gel de slica F254 (Merck, Darmstadt).
Agente revelador: soluo de dicromato de potssio 50 g/L em soluo de
cido sulfrico 40%. Os reagentes utilizados foram: dicromato de potssio (Comercial), cido
sulfrico (Chemis).
2. Determinao de pH da soluo de digluconato de clorexidina
Peagmetro Micronal, B 474.
3. Determinao do ponto de fuso dos cristais obtidos com da soluo de digluconato
de clorexidina
Papel de filtro, tubos capilares com 1 mm de espessura e 6 cm de
comprimento.
Estufa Fanem 315 SE.
Hidrxido de sdio (Synth, Diadema), amarelo titnio (Merck, Darmstadt).
Equipamento: LS Logen Scientific, LS III Basic.
4. Determinao da densidade relativa da soluo de digluconato de clorexidina
Picnmetro (Hexis).
Estufa Fabbe, 116.
5. Espectrofotometria de absoro na regio de infravermelho dos cristais obtidos com
da soluo de digluconato de clorexidina
Equipamento: espectrofotmetro de infravermelho Shimadzu FTIR-8300.
Brometo de potssio (KBr) (Reagen, Rio de Janeiro).
6. Espectrofotometria na regio ultravioleta da soluo de digluconato de clorexidina
Equipamento: espectrofotmetro de ultravioleta KAYAK XA modelo HP 8453.
xxvi
Cubeta de quartzo com 1 cm de caminho ptico.
Solventes: etanol (Synth, Diadema), cido clordrico 0,1 M (Synth, Diadema),
hidrxido de sdio 0,1 M (Synth, Diadema).
7. Doseamento microbiolgico da soluo de digluconato de clorexidina
Meio de cultura: gar Casoy (Acumedia, Lansing); gar Brain Heart Infusion
(BHI) (Acumedia, Lansing), caldo Brain Heart Infusion (BHI) (BD, Le Pont de Claix).
Equipamentos: espectrofotmetro Quimis Q798 DRM, estufa de esterilizao
Nova tica 400/5ND, paqumetro digital Mitotoyo IP 65, estufa bacteriolgica Odonto Bras
ECB 1.2 digital, autoclave vertical Phoenix AV 60.
8. Determinao de pH dos sabonetes lquidos contendo digluconato de clorexidina
Peagmetro Micronal, B 474.
9. Determinao da viscosidade dos sabonetes lquidos
Equipamento: viscosmetro de Brookfield, P selecta modelo visco star-L.
10. Anlise microbiolgica das formulaes desenvolvidas
Equipamentos: estufa de esterilizao a 180 C Nova tica 400/5ND, autoclave
vertical Phoenix AV 60, estufa bacteriolgica Odonto Brs ECB 1.2 digital, estufa Fanem 315
SE.
Meios de cultura: gar tioglicolato (Himedia), gar Sabouraud (Acumedia,
Lansing), caldo lactosado (Acumedia, Lansing), caldo tetrationato (Acumedia, Lansing), caldo
selenito cisitina (Merck, Darmstadt), gar verde brilhante (Difco, Le Pont de Claix), gar
xilose-lisina-desoxicolato (Merck, Darmstadt), gar bismuto sulfito (Acumedia, Lansing), gar
Mac Conkey (Merck, Darmstadt), gar eosina-azul de metileno (Difco, L Pont de Claix),
caldo soja-casena (Acumedia, Lansing), gar Vogel Johnson (Acumedia, Lansing), gar
cetrimida (Acumedia, Lansing), gar trplice acar e ferro (Acumedia, Lansing).
11. Ensaios de atividade antimicrobiana
Equipamentos:
estufa
bacteriolgica
Odonto
Bras
ECB
1.2
digital,
xxvii
12. Teste de eficcia de atividade antimicrobiana
vertical Phoenix AV 75, estufa Fanem 315 SE, estufa de esterilizao Nova tica 400/5ND.
(Acumedia, Lansing).
13. Espectrofotometria na regio de ultravioleta para o sabonete lquido com 3% de
digluconato de clorexidina
xxviii
LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS
A. niger
Aspergillus niger
ABS
absorvncia
ANOVA
anlise de varincia
ANVISA
AOAC
APIC
ATCC
B. subtilis
Bacillus subitilis
BHI
BP
British Pharmacopoeia
BS
C. albicans
Candida albicans
CAS
CBM
CCD
CDC
CFM
CIM
cP
Centi Poise
DCB
DCI
DMSO
dimetilsulfxido
DPR
E. coli
Escherichia coli
E. faecalis
Enterococcus faecalis
e.p.m
EP
European Pharmacopoeia
F. Bras
Farmacopia Brasileira
HIPAC
IAL
KBr
brometo de potssio
L.E.S.S
L.M.S.S
lauroilmiristilsarcosinato de sdio
NCCLS
P. acnes
Propioniobacterium acnes
xxix
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
PF
ponto de fuso
p/v
peso/volume
Rf
fator de refrao
S. aureus
Staphylococcus aureus
T%
transmitncia
TSI
UFC
UI
Unidades Internacionais
USP
UV
ultravioleta
v/v
volume/volume
VB
VJ
XLD
comprimento de onda
xxx
RESUMO
Os sabonetes so preparaes destinadas higiene e conhecidos h mais de
4000 anos. So constitudos por sais de cidos graxos com propriedades
detergentes, resultantes da saponificao entre cidos graxos superiores e seus
glicerdeos custa de um material alcalino. Podem ser incorporados com diversas
substncias que possuem algum efeito teraputico ou preventivo sobre a pele, por
facilitarem o contato de tais substncias com o tecido alvo. Porm, isto nem sempre
possvel. Por tratar-se de um tensoativo aninico carboxilado e ter elevada
alcalinidade, muitos dos materiais ou ativos a serem incorporados a este tipo de
preparao podem apresentar instabilidade. Com o advento dos detergentes
sintticos tal situao pode ser contornada, e apesar de constiturem-se tambm em
tensoativos aninicos, e por terem origem em cidos fortes, permitem o preparo de
sabonetes lquidos no alcalinos e apresentam maior compatibilidade frente a
diversos
ativos.
Entre
as
diversas
possibilidades
de
ativos,
os
agentes
antimicrobianos, merecem ateno especial, uma vez que encontra nos sabonetes
um excelente veculo para desempenhar sua funo na assepsia da pele. A
clorexidina um anti-sptico de amplo espectro de ao, sendo ativo frente a
bactrias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, leveduras e vrus. Atua sobre a
membrana celular causando perda de material intracelular, tais como cido nuclico e
potssio, inibio respiratria e coagulao citoplasmtica. Pode apresentar-se na
forma de diversos sais como acetato, cloridrato, gluconato e digluconato. Neste
trabalho foram estudadas formulaes contendo soluo de digluconato de
clorexidina. A soluo amostra utilizada para preparao dos sabonetes foi avaliada
quanto a alguns parmetros como pH, densidade relativa, ponto de fuso,
cromatografia
em
camada
delgada,
espectroscopia
no
infravermelho
xxxi
avaliao
de
atividade
antimicrobiana,
visto
que
as
formulaes
eram
xxxii
ABSTRACT
The soaps are preparation for hygiene and they are well known for 4000 years
ago. They are constituited by salts of fatty acids with detergent properties, resulting
from saponification of fatty acids superiorities and glycerides using an alkaline
material. They may be incorporated with several substances that have a preventive or
therapeutic effect on the skin, by facilitating the contact of such substances with the
target tissue. However, this is not always possible. The soaps are anionic surfactant
and carboxylic and they have high alkalinity, many of the materials or activities to be
incorporated into this type of preparation may be instable. With the advent of synthetic
detergents such situation can be avoided, and despite of they be also anionic
surfactants, and are based on strong acids, allow the preparation of liquid soaps and
alkali not have greater compatibility front of several assets. Among the various
possibilities of active, antimicrobial agents deserve special attention, since the soap is
an excellent vehicle to perform its function in the asepsis of the skin. The
chlorhexidine is an antiseptic of wide spectrum of action, being active against the
bacteria Gram-positive and Gram-negative, fungi, yeasts and viruses. Chlorhexidine is
an excellent antiseptic of wide spectrum of action, being active against the bacteria
Gram-positive and Gram-negative, fungi, yeasts and viruses. Acts on the cell
membrane causing loss of intracellular material, such as nucleic acid and potassium,
respiration inhibition and cytoplasmic coagulation. The salts of chlorhexidine can be
acetate, hydrochloride, gluconate and digluconate. In this work formulation were
studied with solution of chlorhexidine digluconate. The sample solution employed to
prepare the liquid soaps was evaluated for some parameters such as pH, relative
density, melting point, thin-layer chromatography, spectroscopy in the infrared and
ultraviolet spectroscopy. Analytical methodology was developed for the determination
of chlorhexidine digluconate solution for microbiological assay, through agar diffusion
bioassay, using S. aureus. The microbiological method was validated by the
parameters of linearity, accuracy, precision and reproducibility. The results were
statistically analyzed by analysis of variance (ANOVA). The developed formulations
were analyzed for parameters of pH, viscosity, assay of antimicrobial activity,
indicating that the formulations using synthetic detergents have better antibacterial
activity. However, the technique of diffusion in agar was not satisfactory to analyze
antimicrobial activity, since the formulations presented higher viscosity. . The results
corroborate the literature, since the Gram-positive microorganisms were more likely. It
xxxiii
was performed the test methodology for testing challenge for the formulations with
antimicrobial and better economic performance. There was no significant improvement
of the formulations containing chlorhexidine digluconate on the free formulations of
Chlorhexidine. Analytical methodology was developed by spectrophotometry in the
ultraviolet region of 260 nm in the range of concentration of 0.001% to 0.002% for the
formulation which had better microbiological and economic. The method was validated
by the parameters of linearity, precision, accuracy, specificity and robustness. The
results were statistically analyzed by analysis of variance (ANOVA).
1. INTRODUO
Introduo
Introduo
Introduo
2. OBJETIVOS
Objetivos
Avaliar
comparar
atividade
antimicrobiana
das
formulaes
desenvolvidas.
5. Realizar o teste desafio para a formulao que apresentou melhor atividade
antimicrobiana.
6. Desenvolver e validar metodologia de anlise de espectrofotometria na
regio de ultravioleta da formulao que apresentou melhor atividade
antimicrobiana.
3. REVISO DA LITERATURA
Reviso da Literatura
Reviso da Literatura
contudo
pode
ocasionar
infeces
sistmicas
em
pacientes
Reviso da Literatura
10
Entre 1975 e 1985, foram publicados guias sobre prticas de lavagem das
mos em hospitais pelos Centros de Controle e Preveno de Doenas (CDC), que
recomendavam lavar as mos com sabonete no associado a anti-sptico antes e
aps contato com pacientes e lav-las com sabonete associado a anti-sptico antes e
aps a realizao de procedimentos invasivos ou contato com pacientes de alto risco.
Entre 1988 e 1995, guias para lavagem e anti-sepsia de mos, publicados pela
Associao para Profissionais de Controle de Infeces (APIC, Association for
Professionals in Infection Control and Epidemiology), foram similares s orientaes
dos CDC. Em 1995 e 1996, o Comit Consultivo em Prticas de Controle de
Infeces (HIPAC, Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee) dos
CDC recomendava que um sabonete associado a anti-sptico ou um agente nohidratado fosse empregado para higienizar as mos ao deixar os quartos de
pacientes com patgenos multirresistentes (BRASIL, 2008b).
Em 1989, o Ministrio da Sade, no Brasil, publicou o manual Lavar as mos:
Informaes para profissionais de sade, a fim de orientar quanto s normas e aos
procedimentos de lavagem das mos, visando a preveno e o controle de infeces.
Recentemente a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA), disponibilizou o
guia Higienizao das mos em servios de sade, com atualizaes sobre o tema
(BRASIL, 2008b).
Em 2002, o CDC substituiu o termo lavagem das mos por higienizao das
mos, devido maior abrangncia deste procedimento. O termo engloba a
higienizao simples (lavagem simples das mos usando sabo), a higienizao antisptica (lavagem simples das mos com uso de anti-sptico), a frico anti-sptica
(para remoo microbiana, aps remoo de sujidade, com uso de soluo alcolica
a 70%, por exemplo) e a anti-sepsia cirrgica das mos (elimina a microbiota
transitria e diminui a residente, alm de efeito residual, empregando degermante e
maior tempo de procedimento) (BRASIL, 2007; BRASIL, 2008a; BRASIL, 2008b).
A anti-sepsia inadequada da pele pode resultar na perda de atividade
antimicrobiana do anti-sptico utilizado propiciando o surgimento de patgeno
resistente (WEBER et al., 2007).
3.3. Sabonetes
Existem vrios tipos e apresentaes de sabo: em barra, p, lquido e
escamas. O sabonete um tipo de sabo em barra destinado limpeza corporal,
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
Reviso da Literatura
11
Reviso da Literatura
12
Reviso da Literatura
13
3.4. Anti-spticos
A palavra sepsis vem do grego seps e significa ptrido. Refere-se
contaminao por microrganismos e o passo inicial para septicemia. Desta forma,
anti-sptico significa contra infeco (ALCAMO, 2001).
A anti-sepsia um processo de desinfeco em que se empregam usualmente
substncias qumicas (anti-spticos).Tais substncias devem destruir ou inibir os
microrganismos nocivos vegetativos, no formadores de endosporos em tecidos
vivos, pele e mucosas (TRABULSI, ALTERTHUM, 2005; TORTORA et al., 2006).
Anti-spticos so substncias geralmente bactericidas, mas ocasionalmente
podem ser bacteriostticos, com baixa causticidade e hipoalergenicidade, destinados
a aplicaes em pele e mucosa, podendo estar incorporados em sabes e
impregnados em cateteres (ALCAMO, 2001; IMBERT et al., 2003; BRASIL, 2008a).
O uso de anti-spticos iniciou-se em 1847, quando Semmelweis comprovou a
diminuio de casos de febre puerperal empregando soluo de hipoclorito na
lavagem das mos antes de procedimentos clnico-cirrgicos (SILVA et al., 2000). A
tcnica anti-sptica em cirurgias foi introduzida por Joseph Lister, em 1867, que
utilizou o vapor de fenol dirigido para o campo cirrgico, o que reduziu o nmero de
infeces ps-operatrias (SILVA et al., 2000; TRABULSI, ALTERTHUM, 2005).
As unidades de sade utilizam anti-spticos a fim de reduzir a microbiota
transitria das mos dos trabalhadores, diminuir a transmisso de microrganismos,
preparar a pele para procedimentos invasivos e anti-sepsia cirrgica das mos
(WEBER et al., 2007).
Os anti-spticos devem atender aos seguintes requisitos: amplo espectro de
ao antimicrobiana; ao rpida; efeito residual cumulativo; baixa ou nenhuma
toxicidade;
no
possuir
absoro
sistmica;
no
causar
hipersensibilidade,
Reviso da Literatura
14
Reviso da Literatura
15
algumas espcies de Proteus. Quanto aos vrus, possui atividade apenas para alguns
tipos de vrus envelopados, entre eles vrus da hepatite, herpes simples, HIV,
citomegalovrus, influenza e vrus sincicial respiratrio. Para as micobactrias, a
clorexidina apresenta mnima atividade; contra endsporos e cistos de protozorios a
atividade nula (BRITISH CODEX, 1973; NEIDLE, YAGIELA, 1991; BONACORSI et
al., 2000; THOMAS et al., 2000; TORTORA et al., 2006; MARTINDALE, 2007;
WEBER et al., 2007; BRASIL, 2008b).
A atividade antimicrobiana contra esporos bem discutida, uma vez que
alguns autores dizem que possui pouca ao (NEIDLE, YAGIELA, 1991; TORTORA
et al., 2006), enquanto outros dizem que no possui (BRITISH CODEX, 1973; WU,
LIU, 2007; BRASIL, 2008b). Bambace e colaboradores (2003) e MARTINDALE (2007)
complementam que a clorexidina efetiva contra esporos apenas em elevadas
temperaturas.
Atua sobre a membrana celular causando seu rompimento e conseqente
perda de material intracelular como potssio (quando a clorexidina est em baixa
concentrao), inibio respiratria e perda de cido nuclico (quando a clorexidina
est em alta concentrao) e coagulao citoplasmtica (coagulao ou precipitao
de protenas e cidos nuclicos), em razo da interao da clorexidina com protenas
citoplasmticas (BONACORSI et al., 2000; THOMAS et al., 2000). As ligaes na
membrana celular provavelmente ocorrem entre a carga positiva da clorexidina com a
carga negativa dos grupos carboxilas disponveis dos proteoglicanos e os grupos
fosfatos dos cidos teicico e lipoteicico na parede interna bacteriana. Em relao
ao
metabolismo,
clorexidina
inibe
os
sistemas
glicosiltransferase
2-
Reviso da Literatura
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Reviso da Literatura
21
mdio, olhos e outros tecidos sensveis. Alguns cuidados tambm devem ser
seguidos ao preparar a soluo de clorexidina, como utilizar gua esterilizada, utilizar
solues que foram recentemente preparadas, preparar solues em concentraes
corretas e armazen-las adequadamente (MARTINDALE, 2007).
Em 2003, Farias e colaboradores compararam nistatina 100.000 UI e soluo
de digluconato de clorexidina 0,2% sobre o cultivo de C. albicans (ATCC 1031) em
gar BHI. O halo de inibio formado pela clorexidina foi de 27 mm e o formado pela
nistatina foi de 17 mm, demonstrando que a clorexidina pode ser utilizada para auxlio
de preveno e tratamento de candidase oral.
Amorin e colaboradores (2004) determinaram a concentrao inibitria mnima
(CIM), por difuso em gar, de digluconato de clorexidina e p-monoclorofenol, frente
a P. aeruginosa, S. aureus, E. faecalis, E. coli, C. albicans, Prevotella intermedia,
Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis, Prevotella denticola e
Prevotella melaninogenica. Os valores de CIMs para clorexidina variaram de 2,67 a
80,0 g/mL, enquanto que para p-monoclorofenol as CIMs foram 46,67 a 213,33
g/mL. Assim, de acordo com os autores, a clorexidina deve ser a primeira escolha
por ser usada em menor concentrao e ser menos txica que o p-monoclorofenol.
Em 2006, Gonalves e colaboradores avaliaram (in vivo) a contaminao
bacteriana gerada pelo aerossol de procedimentos em consultrios odontolgicos e a
eficcia da soluo de digluconato de clorexidina 0,12% para diminuir o nmero de
microrganismos obtidos neste procedimento. O nmero mdio de UFC coletado em
placa com meio de cultura que ficou afixada ao profissional do consultrio
odontolgico, foi de 54,93 na primeira fase (sem profilaxia com bochecho de soluo
de clorexidina) e 18,93 na segunda (com bochecho); em relao s placas coletadas
com a auxiliar e com o paciente, tambm houve reduo significativa do nmero de
UFC na segunda fase, o que corrobora com outros autores que tambm encontraram
reduo no nmero de UFC aps bochechos com clorexidina 0,12%.
Apesar de a clorexidina possuir efeito antimicrobiano, a soluo de clorexidina
pode ser contaminada por bactrias. Gajadhar e colaboradores (2003), em uma
pesquisa realizada em hospitais de Trinidad (Caribe), verificaram que o antisptico/desinfetante mais utilizado em 11 instituies de sade desta ilha foi a
clorexidina. Porm, a qualidade microbiolgica das solues utilizadas em quatro dos
maiores hospitais, demonstrou contaminao por Pseudomonas spp., que prevaleceu
Reviso da Literatura
22
Reviso da Literatura
23
mtodo
fase mvel ou
(nm)
solvente
coluna
linearidade
amostra
Soluo A: tampo
fosfato de sdio pH
USP (2008) CLAE
239
L1
gluconato
gua,
misturando
com
acetonitrila
Soluo
B:
acetonitrila
EP (2005), potenciometria
cido perclrico
sais
BP (2005)
Siefert
al. (1975)
et Cromatografia a
detector Ni
Supelco
gs
50 200 acetato
ppm
230
gradiente
amnio pH 5,0
Fase B: acetonitrila
C18
10 g/mL a gluconato
10 mg/mL
Reviso da Literatura
24
Tabela 2. Mtodos descritos na literatura para anlise de impurezas e produtos de degradao da clorexidina
referncia
mtodo
(nm)
coluna
linearidade
produto encontrado
CLAE
sdio
pH
trietilamina
239
(2008)
3,0
em
com
gua,
misturando
substncias
L1
relatadas
p-
cloroanilina
com
acetonitrila
Soluo B: acetonitrila
EP (2005),
CG*
reao
BP (2005)
colorimtrica
nitrognio
Octanesulfato
EP (2005),
CLAE
254
cido
BP (2005)
de
actico:
OV 225
4-cloroanilina
Nucleosil C18
substncias relatadas
sdio:
gua:
metanol
Gavlick,
Davis
CG
hlio
(1994)
CLAE
isocrtico
0,956 10
ppm
p-cloroanilina
CLAE e CLAE-
Revelle et
EM**: 230
CLAE e CLAE-EM:
al. (1993)
array,
RMN:
Zorbax CN
CLAE-EM*,
RMN***
MHz
CLAE-UV
Stevens et
Oxidao cataltica
al. (1986)
(OC)
220
299,92
Regis Chemical C6
sdio: CH3CN,
oxignio
pH 2,2
mL/min para OC
300
g/mL
80
p-cloroanilina,
p-clorofenil
Reviso da Literatura
25
(BOSNEVOLL
et
al.,
1974),
por
espectrofotometria
(JENSEN,
CHRISTENSEN, 1971; VRIES et al., 1991), CLAE (LAM et al., 1993; MEDLICOTT et
al., 1994; PESONEM et al., 1995) e micro-extrao em fase slida (MUSTEATA,
PAWLISZYN, 2005) em saliva; por CLAE em urina, (GAFFNEY, COOKE, 1984;
WAINWRIGHT, COOKE, 1986), em urina e soro (HUSTON, et al., 1982; BROUGHAM
et al., 1986; BELOW et al., 2004), em soro (KUDO et al., 2002), LC-ESI-MS para
sangue hemolizado (USUI et al., 2006) e CLAE para a determinao de resduos de
clorexidina em leite de vaca (HEBERT et al., 2003). Os parmetros adotados para
estas anlises esto descritos na Tabela 3.
Reviso da Literatura
26
mtodo
coluna
linearidade
amostra
(nm)
Bosnevoll et al.
(1974).
Jensen
Espectrometria de
saliva
saliva
cintilao lquida
et
al.
UV
250
Clorofrmio
(1971)
Vries
6,9 1,4 mg
g/mL
et.
al.
fluorescncia
541
Tintura eosin-Y
6,7-20 g/mL
saliva
0,05 - 20 g/mL
saliva
2 - 30 g/mL
saliva
(1991)
Lam
et
al.
CLAE - UV
260
(1993)
Medlicott et al.
(1994).
Bekman
de
Ultrasphere
sdio
cido
heptanesulfnico pH 5,0
CLAE com duplo
detector
Acetronitrila:
254
cido
ODS
C18
actico
CLAE com
detector varivel
260
LiChrospher
heptanesulfnico
RP-18
saliva
0,05 - 40 g/mL
saliva
Bondapak C18
1 - 10 g/mL
urina
100
trietileneamine pH 2,5
Musteata et al.
(2005)
Gaffney, Cooke
(1984)
260
sdio pH 5,0
Reviso da Literatura
27
Tabela 3. cont. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina em fluidos biolgicos
Referncia
mtodo
coluna
linearidade
amostra
(nm)
Wainwright,
metanol:
Cooke (1986)
Huston
et
CLAE -UV
260
al.
(1982)
238
Brougham et al.
CLAE-UV,
Below
et
al.
(2004)
260
gradiente,
250
em fase slida
amnia:
sulfnico
gua
Partisil slica
50 - 200 g/mL
urina
ODS Waters
1 - 20 g/mL
urina e sangue
em
metanol: gua
metanol:
CLAE -UV
de
nitrato de amnia
yolueno-4-cido
CLAE -UV
(1986)
soluo
com
20,2
808
heptanosulfato de sdio
Bondapak C18
ng/mL
soro e urina
Coluna
separao
2,5 mg/L e 25
soro e urina
C18
mg/L
0,05 - 50 g/mL
soro
sangue
de
Luna
et
al.
CLAE -UV
260
(2002)
et
al.
LC-ESI-MS*
0,10
trifluoro actico
ODS 100 V
g/mL
hemolizado
Supelco Discovery
1 - 100 g/mL
saliva
CLAE -PDA
(2003)
258
tampo
acetato
acetonitrila
(pH
3,6):
RP-Amide C16
11,0
Reviso da Literatura
28
29
Reviso da Literatura
mtodo
coluna
linearidade
amostra
(nm)
Bailey
et
al.
(1975)
Bauer
et
al.
(1984)
CLAE
254
com
detector
et
al.
(1983)
CLAE
294
com
262
Bondapck C18
0,64
pastilha
2,56
g/mL
Bondapack CN 10
pastilhas
sdio
Erbasil C18
0,02 6 g/mL
creme
Nucleosil C18
2,72
acetonitrila
com
laurilsulfato
de
sdio
Gagliard et al.
et
varivel
Hu
0 - 600 g/mL
amonio pH 5,9
detector
(1985)
Partisil
varivel
Bauer
264
al.
(1991)
CLAE -UV
Gavlick (1992)
CLAE
254
-
PDA
3,5
436
g/mL
contato
Hamilton PRP-1
30 ppm
solues oftlmicas
Fase A: acetonitrila
239
CLAE
H,
(1996)
Cheung
gradiente,
com UV-VIS
e PDA
de amnio pH 5,0
Fase B: tampo fosfato: acetonitrila
Reviso da Literatura
30
Tabela 4. cont. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina em preparaes farmacuticas
referncia
mtodo
coluna
linearidade
amostra
(nm)
Fase A: tampo acetato de sdio pH 4,0: cido
actico: metanol: soluo de heptanesulfonato
Richard et al.
CLAE
(1984)
gradiente,
UV
254
colrio e solues
Bondapck
0,312
C18
mg/100mL
10
anti-spticas
para
lente de contato
CLAE - UV-VIS
(2007)
239
SB
Phenyl
51,2-
trietilamina pH 3,0
column
g/mL
178,5
pomada veterinria
Extrao em fase
slida
(EFS)
Bonazzi et al.
combinada
com
(1995)
espectrofotometria
SPE
C18
cremes
(para EFS)
derivada
Abad-Villar
al. (2006)
et
Eletroforese
capilares de
10 g/mL 20
capilar
slica fundida
mg/mL
colrio
Reviso da Literatura
31
Tabela 4. cont. Mtodos descritos na literatura para anlise de clorexidina em preparaes farmacuticas
referncia
mtodo
coluna
linearidade
amostra
(nm)
Cromatografia
3%
gs-lquida,
Miribel
et
al.
(1983)
espectrofotometria
de
massas
OV-101
on
0,2 2 mg/mL
creme e pomada
Chromosorb
ressonncia
W HP (gs)
magntica nuclear
soluo
BP (2005), EP
CLAE
254
(2005)
Nucleosil C18
metanol
irrigao,
enxagatrio bucal
CLAE
239
acetonitrila
Soluo B: acetonitrila
de
L1
creme oral
Reviso da Literatura
32
Reviso da literatura
33
Publicao
Controle de qualidade
35
4.1. Descrio
4.1.1. Descrio geral
Nome genrico: digluconato de clorexidina, registro nmero 02437 na DCB,
(Brasil, 2006).
Descrio: soluo aquosa amarelo-plido, lmpida e quase inodora com sabor
amargo (BRITISH, 2005; USP, 2007).
Nome qumico: 1,1(hexane-1,6-diyl)bis[5-(4-p-chlorophenyl)biguanide] di-Dgluconate (BRITISH, 2005).
Nomes: Chlorhexidine digluconate; Chlorheksidino digliukonato tirpalas;
Chlorhexidin-diglukont; Chlorhexidine, Gluconate de; Chlorhexidini Digluconatis
Solutio; Chlorhexidini Gluconas; Gluconato de clorhexidina (MARTINDALE, 2007).
Nome comercial: soluo aquosa de digluconato de clorexidina, Peridex,
PerioGard (USA); Oro-Clense, Peridex (Canad); Corsody, Chlorohex (Reino
Unido); Chlorhexamed (Alemanha); Savacol (Austrlia); PerioGard, Cariax,
Megatrat, Clorexidina (Brasil).
CAS: 18472-51-0
DCI: 0500
Categoria: Anti-sptico bis-biguanida.
Frmula qumica: C22H30Cl2N10.2C6H12O7
Massa molecular: 898
Faixa de fuso: Os cristais obtidos com a soluo de digluconato de clorexidina
fundem entre 132 C a 136 C (BRITISH, 2005; USP, 2007).
4.1.2. Substncia qumica de referncia
Foi utilizada soluo aquosa de digluconato de clorexidina padro secundrio,
gentilmente doada pela indstria Rioqumica Ltda, na pessoa da Dra. Greici Cristiani
Gomes Tozo, com teor rotulado de 20,98% e identificada pelo lote de nmero
07/1306, validade 13/06/2009.
4.1.3. Forma farmacutica
Foi utilizada soluo aquosa de digluconato de clorexidina, gentilmente doada
pelo Laboratrio de Cosmetologia da Universidade Estadual Paulista Jlio de
Mesquita Filho, na pessoa do Prof. Dr. Marcos Antonio Corra, sob nome comercial
Controle de qualidade
36
Controle de qualidade
37
Controle de qualidade
38
4.2.3. pH
4.2.3.1. Material
Foi utilizada soluo de digluconato de clorexidina padro secundrio e
soluo de digluconato de clorexidina amostra, descritas no item 4.1.2 e 4.1.3,
respectivamente. A anlise foi realizada em peagmetro especificado na lista de
equipamentos (p.xxv, item 2).
4.2.3.2. Resultados
O pH obtido com a soluo amostra foi 5,94 e com a soluo padro
secundrio foi 5,75, estando ambas as solues de acordo com a literatura
consultada, que especifica pH entre 5,5 e 7,0 (BP, 2005; USP, 2008) e tambm esto
de acordo entre si.
4.2.4. Determinao da faixa de fuso
O objetivo foi verificar se a soluo de digluconato de clorexidina a ser
incorporada nos sabonetes apresenta impurezas e se o material cumpre com o
requisito farmacopico.
4.2.4.1. Material
Foram utilizadas soluo padro secundrio de digluconato de clorexidina,
soluo amostra de digluconato de clorexidina, descritas nos itens 4.1.2 e 4.1.3
respectivamente, soluo de hidrxido de sdio 10 N, lcool 70%, papel de filtro,
soluo de amarelo titnio, conforme descritos em lista de materiais (p. xxv, item 3).
4.2.4.2. Mtodo
A 1,0 mL da soluo padro secundrio, foram adicionados 40 mL de gua
deionizada e isenta de gs carbnico. Foi adicionada soluo de hidrxido de sdio
10 N, at que produzisse cor vermelha em papel amarelo titnio, e 1,0 mL da soluo
de hidrxido de sdio foi adicionado em excesso. O precipitado foi filtrado e lavado
com gua at que as lavagens estivessem livres de lcalis. O resduo foi
recristalizado com lcool (70% v/v). Os cristais foram secos a 100 C - 105 C em
estufa por 1 hora, colocados em tubos capilares e introduzidos no equipamento para
verificao da faixa de fuso (BP, 2005; EP, 2005; USP, 2008).
Controle de qualidade
39
Controle de qualidade
40
Controle de qualidade
41
Figura 5. Sobreposio dos espectros obtidos com cristais da soluo amostra (azul) e
soluo padro secundrio de digluconato de clorexidina (vermelho), em pastilhas de KBr.
Controle de qualidade
42
grupamento responsvel
3470- 3380
2930-2800
em
freqncia
prxima
independente
da
estrutura
da
molcula
(SILVERSTEIN et al., 1994). Este mtodo tem fundamental importncia para ensaios
de identificao e de fins qualitativos, porm, para ensaios de doseamento sua
aplicao bem limitada (GIL, 2007).
4.2.7. Espectrofotometria na regio ultravioleta
4.2.7.1. Material
Foram utilizadas soluo padro secundrio e soluo amostra de digluconato
de clorexidina, descritas nos itens 4.1.2 e 4.1.3, respectivamente. Os solventes
utilizados foram de grau analtico.
Os espectros na regio de ultravioleta foram obtidos utilizando-se equipamento
descrito no item 6, p.xxv, e cubetas de quartzo com 1 cm de caminho ptico.
Controle de qualidade
43
4.2.7.2. Mtodo
A partir da soluo padro secundrio de digluconato de clorexidina 20% (p/v),
foi preparada soluo a 0,1%. Uma alquota de 500,0 L da soluo padro foi
transferida para balo volumtrico de 100 mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda
utilizando-se gua deionizada para obteno de soluo a 0,1% (soluo A).
4.2.7.2.1. Em gua deionizada
A partir da soluo A, uma alquota de 500,0 L, foi tranferida para balo
volumtrico de 25 mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda utilizando-se gua
deionizada para obteno de soluo a 0,002% (QUITETE et al., 2007).
4.2.7.2.2. Em etanol
A partir da soluo A, uma alquota de 500,0 L, foi transferida para balo
volumtrico de 25 mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda utilizando-se etanol
para obteno de soluo a 0,002%.
4.2.7.2.3. Em cido clordrico 0,1 M
A partir da soluo A, uma alquota de 500,0 L, foi transferida para balo
volumtrico de 25 mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda utilizando-se cido
clordrico 0,1 M para obteno de soluo a 0,002%.
4.2.7.2.4. Em hidrxido de sdio 0,1 M
A partir da soluo A, uma alquota de 500,0 L, foi transferida para balo
volumtrico de 25 mL, com auxlio de micropipeta, e foi diluda utilizando-se hidrxido
de sdio 0,1 M para obteno de soluo a 0,002%.
4.2.7.3. Resultados
Os espectros de absoro da soluo de digluconato de clorexidina na regio
de ultravioleta esto representados nas Figuras 6 a 9.
Controle de qualidade
44
Controle de qualidade
45
Figura 10. Espectro de absoro na regio de ultravioleta de 200 400 nm, da soluo
amostra de digluconato de clorexidina a 0,002% em etanol.
4.2.7.4. Discusso
Diante dos espectros obtidos com os diferentes solventes, optou-se por fazer a
identificao da soluo amostra de digluconato de clorexidina utilizando etanol como
solvente, pois alm de apresentar picos bem definidos, possui facilidade de aquisio,
baixo custo e poucos resduos. O ensaio de quantificao do digluconato de
Controle de qualidade
46
clorexidina no sabonete lquido, utilizou etanol uma vez que o ativo apresentou maior
absoro.
Os espectros obtidos com cido clordrico 0,1 M e hidrxido de sdio 0,1 M no
foram adequados para identificao da clorexidina, pois para estes solventes no
ocorreram sinais que permitissem caracterizar a substncia.
De acordo com os resultados obtidos nas anlises qualitativas das solues
padro secundrio e amostra de digluconato de clorexidina, concluiu-se que o
produto em estudo realmente a clorexidina pois no houve presena de
interferentes precipitveis por NaOH 10 N detectados nos testes de faixa de fuso e
espectroscopia no infravermelho e as anlises realizadas com a soluo tambm
cumpriram com os requisitos farmacopicos. Portanto, esta soluo apresentou-se
adequada para ser incorporada s formulaes desenvolvidas.
4.3. Anlise quantitativa da soluo de digluconato de clorexidina
4.3.1. Ensaio microbiolgico
O objetivo deste estudo foi realizar o desenvolvimento e a validao de ensaio
de quantificao de soluo de digluconato de clorexidina, utilizando o ensaio
microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar.
4.3.1.1. Material e mtodo
A partir de parmetros especificados em ensaios com agentes antimicrobianos
como esparfloxacino (MARONA e SCHAPOVAL, 1998), gatifloxacino (SALGADO et
al., 2006), lomefloxacino (GOMES e SALGADO 2006), foram realizados testes
preliminares para padronizar as condies a serem empregadas. Os parmetros
estudados encontram-se na Tabela 6.
Controle de qualidade
47
Descrio
Bacillus subtilis ATCC 9372
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Meios de cultura
Diluente
gua deionizada
Concentrao da soluo padro 1,0; 2,0 e 4,0%
1,5; 3,0 e 6,0%
0,25; 1,0 e 4,0%
0,5; 1,5 e 4,5%
0,33; 1,0 e 2,0%
Concentrao do inculo
0,5% e 1,0%
Descrio
Microrganismo
Meio de cultura
Diluente
gua deionizada
1,0%
Temperatura de incubao
35 1 C
Tempo de incubao
20 horas
Controle de qualidade
48
Controle de qualidade
49
o template em cada placa, cujos orifcios foram preenchidos com 200,0 L das
solues descritas nos itens 4.3.1.3 e 4.3.1.4, como apresentado na Figura 11. As
placas foram incubadas a 35 1 C e aps 20 horas foram realizadas as medidas dos
dimetros dos halos de inibio do crescimento bacteriano, com auxlio de
paqumetro digital. Todo o procedimento foi realizado em capela de fluxo laminar.
Foram preparadas 12 placas.
P1
A1
A3
P3
P2
A2
Figura 11. Esquema do ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar, delineamento
3 x 3, demonstrando a disposio das solues-padro (P) e amostra (A) na placa de Petri,
donde P1 (0,5%); P2 (1,5%); P3 (4,5%) e A1 (0,5%); A2 (1,5%) e A3 (4,5%).
4.3.1.8. Resultados
Os resultados dos valores dos dimetros dos halos de inibio do crescimento
bacteriano, obtidos para as solues de diferentes concentraes de soluo padro
secundrio e soluo amostra de digluconato de clorexidina esto na Tabela 8.
Controle de qualidade
50
Tabela 8. Valores dos dimetros dos halos de inibio de crescimento obtidos com a
soluo de digluconato de clorexidina, no ensaio microbiolgico pelo mtodo de
difuso em gar
concentrao
dimetro mdio
(%)
inibio (mm)*
e.p.m. **
DPR%***
19,32 19,31
P1
0,5
19,28 19,27
19,30 0,0079
0,09
20,81 0,0084
0,09
22,37 0,0087
0,09
19,24 0,0070
0,08
20,78 0,0088
0,09
22,30 0,0048
0,05
19,30 19,31
20,81 20,79
P2
1,5
20,79 20,83
20,84 20,82
22,33 22,37
P3
4,5
22,39 22,38
22,36 22,38
19,24 19,27
A1
0,5
19,23 19,23
19,22 19,24
20,78 20,79
A2
1,5
20,80 20,81
20,75 20,77
22,30 22,29
A3
4,5
22,32 22,31
22,30 22,29
(*) cada valor do halo de inibio corresponde mdia de 6 determinaes; (**) e.p.m. - erro
padro da mdia e (***) DPR% - desvio padro relativo percentual
4.3.1.9. Clculos
4.3.1.9.1. Curva analtica
A reta foi construda em grfico logaritmo da concentrao versus dimetro dos
halos de inibio, com as mdias dos dimetros de cada uma das concentraes da
Controle de qualidade
51
y = 1,3972Ln(x) + 20,26
R2 = 0,9999
23,0
22,5
y = 1,3942Ln(x) + 20,209
R2 = 1
22,0
21,5
p
a
21,0
Log. (a)
20,5
Log. (p)
20,0
19,5
19,0
0,1
10
log da concentrao
Figura 13. Resultado do ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso em gar, da soluo
de digluconato de clorexidina em concentraes de 0,5; 1,5 e 4,5% utilizando S. aureus.
Controle de qualidade
52
Equao de HEWITT
T/R (%) = Antilog M x 100
M = F/b
Em que:
Equao 1
b = E/I
F = 1/3{(A1+A2+A3) (P1+P2+P3)}
I = logaritmo da razo das doses
E = {A3+P3) (A1+P1)}
teor de digluconato de
clorexidina (%)
1
92,54
92,59
92,61
DPR
(%)***
92,57 0,03
0,05
(*) cada valor encontrado a mdia de duas leituras, (**) e.p.m., erro padro da
mdia, (***) DPR%, desvio padro relativo percentual.
Controle de qualidade
53
Tabela 10. Anlise da varincia dos dados obtidos no ensaio microbiolgico com a
soluo de digluconato de clorexidina, pelo mtodo de difuso em gar
Fontes de variao
GL
SG
QM
F calc
F tab
Preparao
0,025
0,025
67,1*
4,24
Regresso
56,427
56,427
Desvio de paralelismo
0,00007 0,00007
0,182
4,24
Quadrtico
0,00009 0,00009
0,243
4,24
Diferena de quadrtico
0,00222 0,00222
6,075*
4,24
Desvio de linearidade
0,002
0,001
3,159
3,38
Entre doses
56,454
11,291
30867,7*
2,6
Entre placas
0,00166 0,00033
0,905
2,6
Dentro (erro)
25
0,00914 0,00037
........
.....
Total
35
.........
.....
56,46
.......
154264,9* 4,24
Controle de qualidade
54
volume de soluo
concentrao
soluo amostra
padro secundrio
terica de
adicionada (L)
adicionada (L)
amostra + padro
(20%)
(20%)
( %)
Recuperao 1
Amostra a 0,5%
250
500
1,5
Amostra a 1,5%
750
500
2,5
Amostra a 4,5%
2250
500
5,5
Recuperao 2
Amostra a 0,5%
250
1000
2,5
Amostra a 1,5%
750
1000
3,5
Amostra a 4,5%
2250
1000
6,5
Recuperao 3
Amostra a 0,5%
250
1500
3,5
Amostra a 1,5%
750
1500
4,5
Amostra a 4,5%
2250
1500
7,5
Controle de qualidade
55
Em que:
Equao 2
recuperao (%)
recuperao
mdia (%)
de padro adicionada
Recuperao 1
5,00
98,6
Recuperao 2
10,00
98,0
Recuperao 3
15,00
100,5
99,03
4.3.1.12. Discusso
O ensaio microbiolgico um mtodo fsico em que um microrganismo
utilizado como revelador. Emprega-se meio de cultura slido inoculado, distribudo em
placas, em sistema de bicamada, onde a substncia teste se difunde (PINTO et al.,
2003).
A fim de assegurar a validade do ensaio microbiolgico pelo mtodo de difuso
em gar na determinao da potncia de soluo de digluconato de clorexidina,
foram utilizadas trs concentraes diferentes para a amostra, idnticas s da
Controle de qualidade
56
Controle de qualidade
57
4.3.1.13. Concluso
Diante dos resultados encontrados, o mtodo proposto consiste de uma
tcnica simples, sem exigir grande infra-estrutura e que permite indicar a potncia do
produto uma vez que apresenta sensibilidade, linearidade, preciso e exatido
adequadas, de acordo com a F. Bras. (1998) e BRASIL (2003).
59
Nome INCI
Cocoamidopropilbetana
Cocamidopropyl betaine
Digluconato de clorexidina
Digluconate chlorhexidine
25%
3%
Digluconato de clorexidina
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
60
25%
Cocoamidopropilbetana
5%
3%
Digluconato de clorexidina
gua (q.s.p.)
100%
25%
3%
Digluconato de clorexidina
gua (q.s.p.)
100%
25%
Cocoamidopropilbetana
5%
3%
Digluconato de clorexidina
gua (q.s.p.)
100%
5.1.3. Mtodos
Foram preparados 50 g de cada formulao.
Formulao 1. L.E.S.S., amida 90, gua e soluo de digluconato de clorexidina
foram adicionados em bquer de vidro, com agitao manual com auxlio de basto
de vidro.
Como o digluconato de clorexidina est em soluo a 20%, foi necessrio
correo da concentrao, ou seja, 1% de digluconato de clorexidina corresponde a
2,5 g de soluo de digluconato de clorexidina a 20%; 2% de digluconato de
clorexidina correspondem a 5,0 g de soluo de digluconato de clorexidina a 20%; 3%
de digluconato de clorexidina correspondem a 7,5 g de soluo de digluconato de
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
61
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
62
5.2.1.1. Discusso
5.2.1.1.1. Formulaes
Apesar de a clorexidina ser considerada um excelente agente anti-sptico, seu
carter catinico traz ressalvas sua associao a sistemas com carter aninico
como os sabes e os detergentes sintticos. A manifestao deste tipo de interao
pode ser normalmente visualizada por uma simples turvao do sistema, at
situaes em que o sistema perde a homogeneidade e pode-se detectar visualmente
ntida precipitao. Em tais situaes, o principal questionamento diz respeito ao
poder anti-sptico. Como os sabonetes lquidos atuais so baseados em
concentraes significativas de detergentes aninicos, e considerando-se a possvel
interao do detergente com a clorexidina, a possibilidade de interao com
manifestada turvao e ou precipitao constitui-se em uma realidade que somente
pode ser contornada pelos ajustes de concentrao da clorexidina e ou pela incluso
de matrias-primas capazes de sustentarem homogeneidade do sistema e
manuteno da possvel transparncia. Os ajustes quantitativos da clorexidina
podem, do ponto de vista tcnico, ser realizados com bastante facilidade. Porm, isto
no garante a manuteno da atividade antibacteriana e antifngica.
A adio de tensoativo anftero pode contribuir para manuteno da atividade
da substncia ativa, uma vez que contribui para minimizar a interao do complexo
aninico-catinico formado entre a substncia ativa e o tensoativo utilizado, mas esta
atividade ser averiguada posteriormente no ensaio de determinao da atividade
antimicrobiana dos sabonetes lquidos preparados.
Os tensoativos sarcosinatos so agentes de limpeza com boa substantividade
para pele e cabelo, sendo usados em xampus e vrios tipos de produtos para limpeza
das mos (RIEGER, 1993).
A associao da clorexidina com o tensoativo sarcosinato pode resultar em um
complexo inativo, mas solvel no excesso de tensoativo aninico ou ento a
clorexidina permanece ativa em combinao com o sarcosinato (HART, LEVY, 1977).
5.2.1.1.2. Formulao 1
O LESS tensoativo aninico e por isso incompatvel com a clorexidina
causando a turvao no sabonete; j a dietanolamida do cido graxo de coco (amida
90) um tensoativo no inico, importante para manuteno de viscosidade,
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
63
64
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
65
1a
20
1b
547
1c
590
1d
499
2a
9859
2b
220
2c
219
2d
109
3a
3b
3c
38
3d
1231
4a
4b
10
4c
159
4d
1080
5.2.3.2. Discusso
A diferena entre as viscosidades deve-se presena da clorexidina nas
diferentes formulaes, em diferentes concentraes.
Na formulao 1, o aumento de viscosidade nas preparaes com 1% e 2% de
digluconato de clorexidina devido ao sistema micelar do tensoativo que intumesce
suas micelas, e ao adicionar maior quantidade de clorexidina, o sistema permanece
estvel porque as micelas no incham mais por j terem atingido sua estabilidade
(WILLIAMS, SCHIMITT, 1996).
Na formulao 2 ocorrem as mesmas interaes observadas na formulao 1,
entretanto a presena de cocoamidopropilbetana aumenta o tamanho das micelas,
favorecendo a organizao do sistema e, consequentemente, o aumento de
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
66
67
resultados
obtidos
na
anlise
microbiolgicao
das
formulaes
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
68
5.3.3. Discusso
Em produtos no estreis aceitvel a presena de carga microbiana dentro
dos limites recomendados pela RDC 481 de 23 de setembro de 1999, da ANVISA,
mas com ausncia de determinadas cepas patognicas. O controle de qualidade
microbiolgico destes produtos assegura que a carga microbiana presente no
comprometa sua qualidade final, e nem coloque em risco a sade do consumidor.
Para produtos farmacuticos, o nmero total de microrganismos presentes
deve ser inferior a 102 a 103 UFC/g (mL) ou, no mximo, 5 x 102 a 5 x 103 UFC/g (mL)
de amostra e no apresentar S. aureus, P. aeruginosa, Salmonella spp e E. coli. Para
produtos cosmticos, h uma classificao, na qual produtos cosmticos tipo I (para
rea dos olhos, para bebs e para peles com acnes), o limite 102 ou, no mximo,
5 x 102 UFC/g (mL) de microrganismos totais aerbicos e no caso de talcos, ausncia
de clostrdios sulfito-redutores; e para produtos do tipo II (produtos para demais reas
do corpo), 103 ou, no mximo, 5 x 103 UFC/g (mL) de amostra. Para os dois tipos
exigida a ausncia de S. aureus, P. aeruginosa, Salmonella spp e E. coli (F. Bras.,
1988; BRASIL, 1999; PINTO et al., 2003; ANDRADE et al., 2005).
A contagem do nmero total de microrganismos foi realizada pela tcnica de
pour plate por proporcionar crescimento de microrganismos aerbios e anaerbios.
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
70
aeruginosa,
Salmonella
spp,
Staphylococcus
epidermidis,
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
71
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
72
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
73
1%
4%
2%
CHX
1%
Sab
base
3%
Figura 14. Esquema da disposio dos sabonetes lquidos contendo digluconato de clorexidina,
sabonete lquido base (sem o ativo) e a soluo de digluconato de clorexidina a 1%, na placa
de Petri para o ensaio de atividade antimicrobiana pelo mtodo de difuso em gar.
6.2.2. Resultados
A Tabela 19 apresenta os resultados obtidos no ensaio de atividade
antimicrobiana pelo mtodo de difuso em gar.
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
74
P. aeruginosa
E. coli
Salmonella
S. epidermidis
E. faecalis
C. albicans
spp
Sab. 1
1a
1b
1c
1d
CHX 1%
18,57 0,03
14,20 0,01
12,72 0,03
14,90 0,02
20,09 0,02
29,15 0,01
8,30 0,03
Sab. 2
2a
2b
2c
2d
CHX 1%
18,53 0,04
14,18 0,03
12,80 0,04
14,92 0,03
20,12 0,02
29,26 0,03
8,14 0,02
Sab. 3
21,32 0,03
20,24 0,03
29,24 0,03
3a
17,35 0,02
22,57 0,04
23,91 0,03
3b
15,60 0,02
16,49 0,03
18,04 0,04
3c
3d
CHX 1%
18,55 0,02
14,15 0,02
12,88 0,01
14,80 0,02
20,14 0,04
29,27 0,02
8,36 0,03
Sab. 4
21,90 0,02
16,30 0,02
19,80 0,02
28,32 0,04
4a
17,80 0,02
15,90 0,03
18,16 0,04
22,74 0,03
4b
13,60 0,03
12,60 0,02
10,65 0,03
17,10 0,04
4c
4d
CHX 1%
18,48 0,03
14,11 0,03
12,50 0,03
14,96 0,02
20,20 0,03
29,20 0,05
8,28 0,02
(Sab. 1), Sabonete base, sem adio de digluconato de clorexidina; (Sab. 2), Sabonete base, sem adio
de digluconato de clorexidina; (Sab. 3), Sabonete base, sem adio de digluconato de clorexidina, (Sab.
4), Sabonete base, sem adio de digluconato de clorexidina; (-), indica ausncia de halo de inibio;
(CHX 1%), soluo de digluconato de clorexidina a 1%; os nmeros indicam a formulao; as letras
indicam a concentrao de clorexidina, ou seja, a, 1%; b, 2%; c, 3% e d, 4% de clorexidina presente em
cada formulao. Os valores so mdias de trs determinaes.
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
75
1
2
Figura 15. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a S. aureus (a) e E.
faecalis (b), em que: 1, sabonetes base e formulao 1 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina;
2, sabonetes base e formulao 2 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 3, sabonetes base e
formulao 3 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 4, sabonetes base e formulao 4
contendo %1, 2%, 3% e 4% de clorexidina e em todos h soluo de digluconato de clorexidina a
1% conforme esquema apresentado na Figura 14.
Figura 16. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a E. coli (c) e C. albicans (d), em
que: 1, sabonetes base e formulao 1 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 2, sabonetes base e e e
formulao 2 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 3, sabonetes base e formulao 3 contendo %,
1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 4, sabonetes base e formulao 4 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de de
clorexidina e em todos h soluo de digluconato de clorexidina a 1% conforme esquema apresentado na
Figura 14.
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
76
2
1
Figura 17. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a Salmonella spp (e)
e P. aeruginosa (f), em que: 1, sabonetes base e da formulao 1 contendo 1%, 2%, 3% e 4%
de clorexidina; 2, sabonetes base e da formulao 2 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina;
3, sabonetes base e da formulao 3 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 4, sabonetes
base e da formulao 4 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina e em todos h soluo de
digluconato de clorexidina a 1% conforme esquema apresentado na Figura 14.
Figura 18. Ensaio de atividade antimicrobiana por difuso em gar frente a S. epidermidis (g),
em que: 1, sabonetes base e da formulao 1 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 2,
sabonetes base e da formulao 2 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 3, sabonetes
base e da formulao 3 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina; 4, sabonetes base e da
formulao 4 contendo 1%, 2%, 3% e 4% de clorexidina e em todos h soluo de digluconato
de clorexidina a 1% conforme esquema apresentado na Figura 14.
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
77
6.2.3. Discusso
A escolha do produto ideal com a finalidade de impedir ou inibir o crescimento
microbiano tem sido motivo de grande preocupao entre os profissionais da sade,
especialmente, considerando a diversidade de produtos, grande oferta de mercado e
variaes de orientaes quanto s indicaes e ao uso (ANDRADE et al., 2007). Os
produtos com este objetivo devem apresentar amplo espectro de ao, menor
toxicidade, menor custo e menor indcio de resistncia bacteriana (ALVARENGA et
al., 2007). Alguns so ativos contra um grande nmero de microrganismos, enquanto
outros podem ser ativos contra poucas espcies. Entretanto, no h um
antimicrobiano ideal para todas as finalidades, por isso se faz necessrio o estudo de
vantagens e desvantagens de certo antimicrobiano em cada situao em que seu uso
se faz til (PELCZAR et al., 1997).
A clorexidina um anti-sptico com largo espectro de ao como j foi dito na
introduo deste trabalho e diversos estudos tm sido realizados a fim de verificar sua
atividade antimicrobiana (GOMES et al., 2001; SASSONE et al., 2003; ESTRELA et al.,
2004; SEABRA et al., 2005; MOREIRA, WANDERLEY-CRUZ, 2005; TANOMARU et al.,
2005; BUXBAUM et al., 2006; TANOMARU et al., 2007).
Os sabonetes foram preparados sem adio de conservantes para que no
houvesse interferncia nos resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana.
No ensaio de atividade antimicrobiana pelo mtodo de difuso em gar, as
formulaes 1 e 2, que contm laurilter sulfato de sdio, no apresentaram halo de
inibio de crescimento frente aos microrganismos testados, provavelmente por no
conseguirem se difundir no gar devido viscosidade destas formulaes com maiores
concentraes de clorexidina, pode ter havido interferncia entre a carga do tensoativo
e o pH do meio de cultura slido, entre a concentrao de clorexidina e o pH do meio
de cultura slido e entre o tensoativo e a clorexidina, formando um complexo aninicocatinico que impediu a difuso da clorexidina no gar.
A soluo aquosa de digluconato de clorexidina a 1% formou halo de inibio de
crescimento
demostrando
que
tal
substncia
possui
atividade
sobre
estes
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Flvia Anglica Msquio Fiorentino
78
79
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80
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82
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
Figura 19. Esquema da realizao do ensaio de atividade antimicrobiana pelo mtodo de microdiluio
150 L de sabonete lquido sem clorexidina (controle negativo)
150 L de sabonete lquido com 1% de clorexidina (controle negativo)
150 L de sabonete lquido com 2% de clorexidina (controle negativo)
150 L de sabonete lquido com 3% de clorexidina (controle negativo)
150 L de sabonete lquido com 4% de clorexidina (controle negativo)
150 L de caldo BHI (controle negativo)
100 L de caldo BHI e 50 L de microrganismo (controle positivo)
100 L de soluo de clorexidina a 1% e 50 L de microrganismo
100 L de sabonete lquido sem clorexidina e 50 L de caldo BHI
100 L de sabonete lquido com 1% de clorexidina e 50 L de caldo BHI
100 L de sabonete lquido com 2% de clorexidina e 50 L de caldo BHI
100 L de sabonete lquido com 3% de clorexidina e 50 L de caldo BHI
100 L de sabonete lquido com 4% de clorexidina e 50 L de caldo BHI
90 L de caldo BHI + 10 L de sabonete com 1% de clorexidina e diluies + 50 L de
microrganismo
90 L de caldo BHI + 10 L de sabonete com 2% de clorexidina e diluies + 50 L de
microrganismo
90 L de caldo BHI + 10 L de sabonete com 3% de clorexidina e diluies + 50 L de
microrganismo
90 L de caldo BHI + 10 L de sabonete com 4% de clorexidina e diluies + 50 L de
microrganismo
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Flvia Anglica Msquio Fiorentino
83
Sab. 1 *
Sab. 2 **
Sab. 3 ***
Sab. 4 ****
4 10-1
6.3.1.4. Leituras
Depois de 24 horas de incubao, foram realizadas leituras visuais, antes e
aps a adio de corante resazurina.
Aps a leitura visual, foi realizada subcultura de cada poo da microplaca em
placas de Petri contendo gar BHI, por meio de hastes estreis. As placas foram
incubadas por 24 horas a 35 C 1 C, a fim de determinar se a concentrao
inibitria mnima (CIM) apresentou efeito bactericida ou bacteriosttico.
A resazurina, um corante (fenoxazin-3-ona) indicador de xido-reduo, tem
sido empregada para avaliar a viabilidade bacteriana, (PALOMINO et al., 2002;
MONTEJANO et al., 2005).
A soluo de resazurina foi preparada na concentrao de 0,1 g/mL de gua
destilada estril. Em todos os orifcios da microplaca, foram adicionados 30 L de
corante. Aps leitura visual, a microplaca foi reincubada a 35 C 1 C por 2 horas,
mantendo-as at 24 h para confirmao dos resultados. Em seguida, foi realizada
leitura visual final.
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84
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
++
++
++
++
++
++
++
++
++
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++
++
++
++
++
++
++
Salmonella spp
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++
++
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++
S. epidermidis
++
++
++
++
++
E. coli
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++
++
++
++
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E. faecalis
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++
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++
++
C. albicans
++
++
++
++
++
++
++
++
++
Microrganismos
P. aeruginosa
S. aureus
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
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85
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
P. aeruginosa
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++
++
++
++
++
++
++
++
S. aureus
++
++
++
++
++
++
++
++
++
Salmonella spp
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++
++
++
++
++
++
++
++
S. epidermidis
E. coli
++
++
++
++
++
++
++
++
++
E. faecalis
++
++
++
++
++
++
++
++
++
C. albicans
++
++
++
++
++
++
++
++
++
Microrganismos
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
P. aeruginosa
++
++
++
++
++
++
++
++
S. aureus
++
++
++
++
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Salmonella spp
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++
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++
++
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++
S. epidermidis
++
++
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++
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E. coli
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++
++
++
++
++
++
++
++
E. faecalis
++
++
++
++
++
++
++
++
++
C. albicans
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
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86
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
Salmonella spp
++
++
++
++
++
++
++
++
++
S. epidermidis
++
++
++
++
++
E. coli
++
++
++
++
++
++
++
++
++
E. faecalis
++
++
++
++
++
++
++
++
++
C. albicans
++
++
++
++
++
++
++
Microrganismos
P. aeruginosa
S. aureus
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
-1
-2
2x10
2x10
P. aeruginosa
++
++
++
++
++
++
++
++
++
S. aureus
Salmonella spp
++
++
++
++
++
++
++
++
++
S. epidermidis
++
++
++
++
++
E. coli
++
++
++
++
++
++
++
E. faecalis
++
++
++
++
++
++
++
C. albicans
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
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Microrganismos
P. aeruginosa
++
++
++
++
++
++
++
++
++
S. aureus
Salmonella spp
++
++
++
++
++
++
++
++
++
S. epidermidis
E. coli
++
++
++
++
++
++
++
++
E. faecalis
++
++
++
++
++
++
++
++
C. albicans
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
Microrganismos
P. aeruginosa
++
++
++
++
++
++
++
++
S. aureus
++
++
++
++
Salmonella spp
++
++
++
++
++
++
++
++
++
S. epidermidis
++
++
E. coli
++
++
++
E. faecalis
++
++
++
++
++
++
++
++
++
C. albicans
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
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Microrganismos
P. aeruginosa
++
++
++
++
++
++
++
S. aureus
++
++
++
Salmonella spp
++
++
++
++
++
++
++
++
++
S. epidermidis
E. coli
++
++
E. faecalis
++
++
++
++
++
++
++
++
++
C. albicans
++
++
++
++
++
++
++
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
++
++
++
++
++
++
++
++
++
S. aureus
Salmonella spp
++
++
++
++
++
++
++
++
S. epidermidis
++
++
E. coli
E. faecalis
C. albicans
P. aeruginosa
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
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Flvia Anglica Msquio Fiorentino
89
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
Salmonella spp
++
++
++
++
++
++
++
++
++
S. epidermidis
++
++
E. coli
++
++
++
++
++
E. faecalis
++
++
++
++
C. albicans
P. aeruginosa
S. aureus
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
Microrganismos
P. aeruginosa
S. aureus
Salmonella spp
++
++
++
++
++
++
++
++
++
S. epidermidis
E. coli
E. faecalis
C. albicans
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
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Flvia Anglica Msquio Fiorentino
90
Microrganismos
P. aeruginosa
S. aureus
Salmonella spp
++
++
++
++
++
++
++
++
++
S. epidermidis
E. coli
E. faecalis
C. albicans
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
++
++
++
++
++
++
++
S. aureus
++
++
++
++
Salmonella spp
++
++
++
++
++
++
++
++
S. epidermidis
++
++
E. coli
E. faecalis
C. albicans
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
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Flvia Anglica Msquio Fiorentino
91
++
++
++
++
++
++
++
++
++
S. aureus
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Salmonella spp
++
++
++
++
++
++
++
++
S. epidermidis
++
++
++
E. coli
++
++
++
++
++
E. faecalis
++
++
C. albicans
P. aeruginosa
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
++
++
++
++
S. aureus
++
++
++
Salmonella spp
++
++
++
++
++
S. epidermidis
E. coli
E. faecalis
C. albicans
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
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92
S. aureus
Salmonella spp
S. epidermidis
E. coli
E. faecalis
C. albicans
(++) crescimento uniforme microbiano em toda a estria do repique; (+) crescimento com
algumas colnias de microrganismo na estria do repique; (-) ausncia de crescimento
microbiano na estria do repique.
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93
Figura 20. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando P. aeruginosa. A1, A2, contm
sabonete sem clorexidina; B1, B2, sabonete com 1% de clorexidina; C1, C2, sabonete com 2% de
clorexidina; D1, D2, sabonete com 3% de clorexidina; E1, E2, sabonete com 4% de clorexidina; F1, F2,
meio de cultura; G1, G2, controle positivo; H1 e H2, soluo de clorexidina a 1% e microrganismo; A3,
B3, sabonete sem clorexidina e meio de cultura; C3, D3, sabonete com 1% de clorexidina e meio de
cultura; E3, F3, sabonete com 2% de clorexidina; G3, sabonete com 3% de clorexidina e meio de
cultura; H3, sabonete com 4% de clorexidina e meio de cultura. A4, B4, sabonete com 1% de
clorexidina, meio de cultura e microrganismo e nos demais poos destas fileiras, as diluies seriadas
1:10 do sabonete, meio de cultura e microrganismo; C4, D4, sabonete com 2% de clorexidina, meio de
cultura e microrganismo e nos demais poos dessa fileira, as diluies seriadas 1:10 do sabonete,
meio de cultura e microrganismo; E4, F4, sabonete com 3% de clorexidina, meio de cultura e
microrganismo e nos demais poos dessa fileira, as diluies seriadas 1:10 do sabonete, meio de
cultura e microrganismo; G4, H4, sabonete com 4% de clorexidina, meio de cultura e microrganismo e
nos demais poos dessa fileira, as diluies seriadas 1:10 do sabonete, meio de cultura e
microrganismo.
Figura 21. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando P. aeruginosa. A distribuio dos
sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 20.
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Flvia Anglica Msquio Fiorentino
94
Figura 22. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando S. aureus. A distribuio dos
sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 20.
Figura 23. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando S. aureus. A distribuio dos
sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 20.
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
95
Figura 24. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando Salmonella spp. A
distribuio dos sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 19, entretanto,
houve uma modificao em G1 e G2, que contm soluo de clorexidina a 1%, meio de
cultura e microrganismo e em H1 e H2, que contm meio de cultura e microrganismo.
Figura 25. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando Salmonella spp. A distribuio
dos sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
96
Figura 26. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando S. epidermidis. A distribuio
dos sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.
Figura 27. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando S. epidermidis. A distribuio
dos sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
97
Figura 28. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando E. faecalis. A distribuio dos
sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.
Figura 29. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando E. faecalis. A distribuio dos
sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
98
Figura 30. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando E. coli. A distribuio dos
sabonetes e das diluies dos sabonetes igual apresentada na Figura 24.
Figura 31. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando E. coli. A distribuio dos
sabonetes e das diluies dos sabonetes igual apresentada na Figura 24.
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
99
Figura 32. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 1 (a) e formulao 2 (b), empregando C. albicans. A distribuio
dos sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.
Figura 33. Ensaio de atividade antimicrobiana em meio lquido tcnica de microdiluio dos
sabonetes da formulao 3 (c) e formulao 4 (d), empregando C. albicans. A distribuio dos
sabonetes e das diluies igual apresentada na Figura 24.
6.3.3. Discusso
A determinao da CIM um mtodo quantitativo que analisa a menor
concentrao do composto testado capaz de inibir o crescimento visvel do
microrganismo em estudo. A concentrao bactericida mnima (CBM) e concentrao
fungicida mnima (CFM), tambm so mtodos quantitativos em que se analisa a
menor concentrao do composto testado capaz de matar 99,9% da populao
bacteriana e fngica, respectivamente (COLLINS, LYNE, 2004).
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
100
Formulaes*
1a
P.
aeruginosa
-
aureus
1
spp
epidermidis
-3
10
-8
2x10
-8
3x10
-4
-6
3x10
-6
2x10
1c
3x10
1d
4x10
4x10
4x10
2a
10
-8
-8
2x10
-5
3x10
2b
2x10
2c
3x10
-7
-8
-5
-5
2d
4x10
4x10
3a
10
-3
10
3b
2x10
-4
2x10
3c
3x10
-8
3x10
3d
-8
3x10
4x10
-4
4x10
4a
10
4b
2x10
4c
3x10
4d
4x10
-4
-3
-3
2x10
-8
3x10
-4
3x10
-8
4x10
-8
-3
-4
4x10
3x10
-8
3x10
4x10
-8
4x10
-8
4x10
2x10
-4
3x10
-3
-8
-8
-8
-4
3x10
-6
-8
4x10
4x10
10
-8
-5
-8
2x10
-8
3x10
4x10
-8
-8
2x10
-8
3x10
-4
4x10
4x10
-8
4x10
-8
-6
2x10
-8
2x10
3x10
10
-2
2x10
-8
10
albicans
-2
2x10
4x10
-1
-2
-6
4x10
-3
10
2x10
-1
faecalis
-1
-3
1b
C.
-6
-8
3x10
-8
4x10
-8
4x10
10
2x10
-8
-1
-1
-8
3x10
-8
3x10
-4
4x10
-8
-4
4x10
-4
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
101
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
102
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
103
104
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
105
Gram-positivos
testados
houve
melhora
da
atividade
106
____________________________________________________________________________
Flvia Anglica Msquio Fiorentino
108
Teste de eficcia
3%
de
digluconato
de
clorexidina,
frente
culturas
puras
de
os
microrganismos
foram
levados
estufa,
onde
as
bactrias
Teste de eficcia
109
Teste de eficcia
110
111
Teste de eficcia
para o fungo foi 7 dias. Aps o crescimento, o nmero de UFC foi determinado
(Figura 34).
1g/amostra
CONTROLE
-1
Homogeneizao
10
manual
1 mL
1mL
-1
10
-2
10
1mL
-3
10
1mL
Semeadura em
superfcie
Teste de eficcia
112
113
Teste de eficcia
Homogeinizao
manual
Estocagem em temperatura
ambiente at o final do teste
1mL
1g
Diluio seriada
decimal
-3
10
-5
10
-2
9mL diluente
Amostra
10
0,5 mL
1mL
0,5 mL
0,5mL
Semeadura
em
superfcie
Figura 35: Esquema da execuo das anlises microbiolgicas do sabonete lquido contendo
digluconato de clorexidina durante o teste desafio.
7.8. Resultados
7.8.1. Avaliao da neutralizao na inibio da atividade antimicrobiana
Os resultados da avaliao da neutralizao do sabonete lquido contendo 3%
de digluconato de clorexidina e do sabonete isento do anti-sptico esto
apresentados nas Tabelas 38 a 42, frente aos microrganismos em anlise.
114
Teste de eficcia
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
Controle
SL
56
91
165
203
296
388
502
598
686
142
SL CHX
41
86
101
137
248
302
412
587
625
142
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
Controle
SL
46
103
185
241
313
388
410
473
566
240
SL CHX
82
164
223
297
362
368
418
528
240
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
-7
-8
-9
10
10
10
10
-10
10
-11
10
-12
Cont
10
SL
21
54
87
125
169
199
222
269
294
311
323
256
SL
98
127
156
256
256
CHX
115
Teste de eficcia
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
Controle
SL
218
234
256
283
294
319
349
362
399
272
SL CHX
78
92
128
232
264
301
330
342
365
272
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
Controle
SL
84
103
164
206
288
359
496
562
603
278
SL CHX
63
96
122
189
247
301
397
476
562
278
0h
2h
6h
12h
24h 48h
7d
14d 21d
28d
SL
SL CHX
Controle
6,0
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
116
Teste de eficcia
Figura 36. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de P. aeruginosa
sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no sabonete lquido
isento de digluconato de clorexidina (pontilhado) e contendo digluconato de clorexidina
(cheio).
Tabela 44. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes sem e com digluconato de clorexidina, utilizando P. aeruginosa
Sistema
Equao da reta
conservante
Valor D
Coeficiente de correlao
(h)
(R)
SL
y = -0,121x + 6,19
8,1
0,984
SL CHX
y = -0,2411x + 6,166
4,06
0,981
117
Teste de eficcia
Tabela 45. Log de UFC/g de E. coli, nas formulaes de sabonete lquido com e sem
a presena da clorexidina, em funo do tempo
Sistema Conservante
0h
2h
6h
SL
6,0
5,5
4,47
7d
4,3
SL CHX
Controle
6,0
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
Figura 37. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de E. coli
sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no sabonete lquido
isento de digluconato de clorexidina (pontilhado) e contendo digluconato de clorexidina (cheio).
118
Teste de eficcia
Tabela 46. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes sem e com digluconato de clorexidina, utilizando E. coli
Sistema
Equao da reta
Valor D
Coeficiente de correlao
(h)
(R)
conservante
SL
y = -0,2386x + 6,1538
4,06
0,970
SL CHX
y = -0,4992x + 6,4233
1,95
0,974
0h
2h
6h
7d
4,90 4,30
SL CHX
4,47
Controle
6,0
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
SL
119
Teste de eficcia
Figura 38. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de S. aureus
sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no sabonete lquido
isento de digluconato de clorexidina (pontilhado) e contendo digluconato de clorexidina (cheio).
Tabela 48. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes sem e com digluconato de clorexidina, utilizando S. aureus
Sistema
Equao da reta
Valor D
Coeficiente de correlao
(h)
(R)
conservante
SL
y = - 0,7054x + 4,3943
1,40
0,981
SL CHX
y = - 2,345x + 4,69
0,43
0h
2h
6h
7d
4,90 4,47
SL CHX
4,60
Controle
6,0
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
SL
120
Teste de eficcia
Figura 39. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de C. albicans
sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no sabonete lquido
isento de digluconato de clorexidina (pontilhado) e com digluconato de clorexidina (cheio).
Tabela 50. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
as formulaes sem e com digluconato de clorexidina, utilizando C. albicans
Sistema
Equao da reta
Valor D
Coeficiente de correlao
(h)
(R)
conservante
SL
y = - 0,8596x + 5,4157
1,12
0,968
SL CHX
y = - 2,3x + 4,6
0,43
48h
7d
SL CHX
Controle
6,0
ND
ND
ND
ND
ND
ND
SL
0h
2h
ND
6h
ND
12h
ND
24h
121
Teste de eficcia
Figura 40. Representao grfica da regresso linear da relao entre o log de A. niger
sobreviventes em funo do tempo de inoculao da carga microbiana, no sabonete lquido
isento de digluconato de clorexidina (azul) e contendo digluconato de clorexidina (vermelho).
Tabela 52. Equao da reta, coeficiente de correlao (R) e valores (D), obtidos para
a formulao sem digluconato de clorexidina e para a formulao com digluconato de
clorexidina, utilizando A. niger
Sistema
Equao da reta
conservante
Valor D
Coeficiente de correlao
(h)
(R)
SL
y = -0,1162x + 6,1302
8,3
0,962
SL CHX
y = -0,2365x + 6,2293
4,1
0,958
Teste de eficcia
122
7.9. Discusso
Nos anos de 1980 surgiram os testes de eficcia conservante ou teste desafio
ou ainda challenge test, que possibilitam a anlise da eficcia do sistema conservante
em formulaes especficas (BP, 2003).
Nestes testes, o produto contaminado propositalmente com uma carga
microbiana especfica do microrganismo-teste. O monitoramento realizado quanto
presena de sobreviventes em intervalos de tempo, pela contagem das unidades
formadoras de colnias (UFC) em placas de Petri de acordo com metodologias
internacionalmente recomendadas, para garantir um produto microbiologicamente
seguro e estvel (ORTH, MILSTERIN, 1989; NICOLETTI et al., 1997; BP, 2003).
Os mtodos convencionais baseiam-se na porcentagem de reduo da carga
microbiana analisada em diferentes tempos. A carga microbiana expressa em
logaritmo decimal (log) de UFC, a qual obtida em intervalos de tempos variveis,
dependendo do mtodo oficial aplicado (CRMIEUX et al., 2005).
Os mtodos rpidos se baseiam na inoculao proposital de microrganismos e
avaliao da morte celular em intervalos de tempo subsequentes, diferenciando do
mtodo convencional quanto frequncia da avaliao das cargas microbianas. No
mtodo convencional o perodo de avaliao de 28 dias, enquanto que no mtodo
rpido de 48 horas (CRMIEUX et al., 2005).
Para a realizao deste teste, culturas puras ou misturas de cultura de
microrganismos podem ser empregadas, no entanto, as culturas puras so mais
apropriadas, pois permitem conhecer as taxas de morte de cada microrganismo e
determinar o perfil de resistncia para determinada formulao (ORTH, 1993),
enquanto que a mistura de culturas pode refletir mais corretamente o perfil de
contaminao normal de um produto (BRANNAN, 1997). Ainda de acordo com estes
autores, os microrganismos utilizados para o teste devem representar as espcies de
bactrias Gram-positivas como, por exemplo, S. aureus; Gram-negativas com
diversas capacidades metablicas como P. aeruginosa; bactria do grupo coliforme
como E. coli; C. albicans como levedura e fungos como Aspergillus niger.
Os testes de eficcia de conservante so executados a fim de determinar o tipo
e a concentrao mnima do conservante necessria para que produtos no estreis
acondicionados em recipientes de mltiplo uso e com base aquosa permaneam
conservados e mantenham a estabilidade (ORTH, STEINBERG, 2003), alm de
fazerem parte dos testes de segurana do produto por avaliar a qualidade
123
Teste de eficcia
microbiolgica durante sua vida til, inclusive nas condies de uso (RODRIGUES,
SAITO, 1991).
Conservantes antimicrobianos no devem ser empregados para substituir as
boas prticas de fabricao (BP, 2003; USP, 2006), entretanto, no devem permitir a
proliferao microbiana, para que no haja comprometimento do produto, de sua
ao e da segurana do paciente (RODRIGUES, SAITO, 1991). A eficcia do
conservante deve ser demonstrada em produtos tpicos de mltiplas doses, de uso
oral, oftlmico, nasal e fluidos de dilise (USP, 2006). De acordo com Siqueira (2004),
o teste de eficcia de conservante deve tambm ser realizado para a embalagem do
produto, uma vez que o material de acondicionamento pode dificultar ou facilitar a
entrada de microrganismos no produto.
Para que o produto seja aceito pelo mtodo convencional descrito na
farmacopia britnica (2003), necessrio que haja queda de 2 log da carga
bacteriana inicialmente inoculada em 48 horas, reduo de 3 log da carga inicial de
bactria em 7 dias e no deve haver proliferao microbiana at o perodo final de
realizao do teste. Em relao aos fungos, deve haver reduo de 2 log da carga
inicialmente inoculada em 14 dias e no deve haver aumento da populao fngica
at o perodo final do teste. De acordo com a farmacopia americana (2006), deve
haver reduo de pelo menos 2 log em 14 dias da carga bacteriana inicialmente
inoculada e no deve haver aumento de microrganismos at o final do teste. Quanto
aos fungos, no deve haver aumento de microrganismos contatos no incio do teste,
no 14 dia e no perodo final do teste.
Teste de eficcia
124
Teste de eficcia
125
Teste de eficcia
126
Anlise quantitativa
128
Anlise quantitativa
129
130
Anlise quantitativa
Concentrao
Absorvncia
estoque de digluconato
final
(ABS)
de clorexidina 0,1%
(%)
20
0,0002
0,082
17,205
40
0,0004
0,173
32,857
60
0,0006
0,261
45,172
80
0,0008
0,347
55,022
100
0,0010
0,428
62,674
120
0,0012
0,501
68,449
140
0,0014
0,588
74,177
160
0,0016
0,662
78,222
180
0,0018
0,762
82,701
10
200
0,0020
0,839
85,512
11
220
0,0022
0,905
87,554
12
240
0,0024
0,985
89,648
13
260
0,0026
1,096
91,983
14
280
0,0028
1,185
93,468
15
300
0,0030
1,279
94,739
16
320
0,0032
1,368
95,714
17
340
0,0034
1,439
96,360
18
360
0,0036
1,526
97,021
100-T%
131
Anlise quantitativa
100
90
80
100-T%
70
60
50
40
30
20
10
0
0,0001
0,001
0,01
Concentrao (%)
Concentrao final
(%)
100
0,0010
120
0,0012
140
0,0014
160
0,0016
180
0,0018
200
0,0020
132
Anlise quantitativa
digluconato de clorexidina
(%)
Absorvncia a 260
nm
Absorvncia
mdia
DPR%**
e.p.m. *
0,427
1
0,0010
0,422
0,425
0,425
0,0015
0,59
0,523
2
0,0012
0,522
0,524
0,527
0,0015
0,50
0,613
3
0,0014
0,617
0,617
0,620
0,0020
0,57
0,714
4
0,0016
0,707
0,708
0,704
0,0030
0,72
0,790
5
0,0018
0,791
0,790
0,789
0,0006
0,13
0,889
6
0,0020
0,884
0,887
0,888
0,0015
0,30
133
Anlise quantitativa
Absorvncia
1,000
0,800
0,600
y = 457,33x - 0,0276
R2 = 0,9993
0,400
0,200
0,000
0
0,0005
0,001
0,0015
0,002
0,0025
Concentrao (%)
varincia
Fcalc
Ftab
0,43952
0,08790
732,53*
3,11
0,43893
0,43893
3657,73*
4,75
desvio de linearidade
0,00059
0,00015
1,23
3,26
RESDUO
12
0,00012
0,00001
TOTAL
17
0,43964
Fontes de variao
GL
ENTRE doses
regresso linear
quadrados
134
Anlise quantitativa
Equao 3
Em que: A = absorvncia
c = concentrao molar
b = caminho ptico da cubeta (cm)
Tabela 57. Parmetros analticos utilizados na determinao de digluconato de
clorexidina pelo mtodo espectrofotomtrico na regio de ultravioleta a 260 nm,
utilizando etanol como solvente
Parmetros
Resultados
(nm)
260
(L/M.cm)
276202540783,52
0,001 0,002
Equao: y = ax + b
a
457,33
0,0276
r (coeficiente de correlao)
0,9997
135
Anlise quantitativa
mL, com auxlio de micropipeta, e seu volume foi completado com etanol, obtendose concentrao final de 0,002%. As solues foram preparadas em seis rplicas.
As leituras foram realizadas em espectrofotmetro a 260 nm, utilizando
cubeta de quartzo com 1 cm de caminho ptico e sabonete lquido isento de
clorexidina e etanol como branco.
O clculo do teor de digluconato de clorexidina no sabonete lquido foi feito
uilizando-se a Equao 4.
CA = AA . CSP / ASP
Equao 4
Equao 5
136
Anlise quantitativa
Teor mdio
lquido* (%)
e.p.m.
2,91
II
2,87
III
2,90
2,89 0,0921
DPR%
0,7877
137
Anlise quantitativa
Tabela 59. Preparo das solues para o teste de recuperao de sabonete lquido
de digluconato de clorexidina pelo mtodo espectrofotomtrico na regio de
ultravioleta a 260 nm, utilizando etanol como solvente
Vol. Sol. da amostra Vol. Sol padro sec. CHX Concentrao final
0,012% (L)
0,1%
(%)
1000,0
0,0012
R1
1000,0
20,0
0,0014
R2
1000,0
40,0
0,0016
R3
1000,0
60,0
0,0018
120,0
0,0012
Equao 6
138
Anlise quantitativa
Concentrao
adicionado
(%)
final
(%)
Digluconato
CHX
encontrado
(%)
mdia (%)
(%)
100,12
1,21
(%)*
R1
0,0002
0,0012
0,00139
101,41
R2
0,0004
0,0014
0,00158
99,01
R3
0,0006
0,0016
0,00178
99,93
8.5. Validao
A validao do mtodo espectrofotomtrico de ultravioleta para sabonete
lquido contendo digluconato de clorexidina foi realizada de acordo com o guia
publicado pela ANVISA (BRASIL, 2003).
8.5.1. Linearidade
Os resultados obtidos na construo da curva analtica, descrita no item 8.1.2,
foram analisados para obteno da equao da reta pelo mtodo dos mnimos
quadrados e a linearidade foi verificada pela ANOVA.
8.5.2. Preciso
A preciso foi avaliada pelos ensaios para determinao de digluconato de
clorexidina em sabonete lquido, durante trs dias consecutivos e o desvio padro
relativo (DPR%) dos dados foi calculado estatisticamente. Os resultados desta
anlise esto descritos no item 8.3.3, na Tabela 58.
A preciso foi avaliada pelos ensaios de repetibilidade (intradia e interdia) e
reprodutibilidade, realizados em trs dias diferentes, nos quais foram analisadas seis
amostras preparadas em cada dia. O teor de digluconato de clorexidina encontrado
no sabonete lquido foi em mdia 2,89%. O desvio padro relativo das absorvncias
nas leituras foi de 1,07 e 1,05% no ensaio intradia e interdia (intermediria),
respectivamente.
139
Anlise quantitativa
0,879; 0,891
0,886 0,0028
0,76
0,886; 0,890
0,67
0,874; 0,863
2
0,874; 0,869
0,872 0,0021
0,58
0,876; 0,876
DPR, desvio padro relativo; e.p.m., erro padro da mdia
140
Anlise quantitativa
8.5.5. Robustez
A robustez do mtodo foi determinada pela comparao dos resultados
obtidos pela variao de parmetros operacionais como a modificao no
comprimento de onda para leitura dos valores de absorvncias. Desse modo,
utilizaram-se comprimentos de 260 nm e 255 nm (Tabela 62).
Tabela 62. Valores obtidos para a robustez do mtodo espectrofotomtrico na regio
de ultravioleta a 260 nm para o sabonete lquido contendo digluconato de
clorexidina, utilizando etanol como solvente
Absorvncia
Absorvncia mdia
DPR
DPR (%)
e.p.m.
(%)
total
0,876 0,0012
0,37
0,875; 0,876
= 260 nm
0,872; 0,881
0,875; 0,880
0,38
0,875; 0,869
nm
255
0,865; 0,872
0,870 0,0014
0,38
0,869; 0,869
, comprimento de onda; e.p.m., erro padro da mdia; DPR, desvio padro relativo
8.6. Discusso
A espectrofotometria uma das tcnicas mais utilizadas em anlise
quantitativa, por ter facilidade de manuseio, custo relativamente baixo, boa
sensibilidade, exatido, robustez, seletividade moderada e ampla aplicabilidade.
141
Anlise quantitativa
quantitativos
utilizando
espectrofotometria
de
absoro
so
Anlise quantitativa
142
9. DISCUSSO GERAL
Discusso geral
144
Discusso geral
145
preparaes farmacuticas e tambm possibilita observao de p-cloroanilina e 1cloro-4-nitrobenzeno, mas suas quantificaes no so exatas.
Em preparaes farmacuticas, a CLAE o mtodo mais utilizado, porm
necessita de extrao da clorexidina dos produtos que em alguns casos demorada.
O mtodo proposto por Miribel e colaboradores (1983) necessitou de diversos
passos, e, espectrometria de massas e ressonncia magntica foram realizadas para
verificar se a estrutura qumica era realmente da clorexidina. Os mtodos propostos
por Gavlick (1992) e Bauer e colaboradores (1984) permitem quantificao de
clorexidina e cloroanilina.
No foi encontrado na literatura mtodo de anlise para sabonete lquido
contendo digluconato de clorexidina e anlise quantitativa pelo ensaio microbiolgico
por difuso em gar para soluo de digluconato de clorexidina. Em virtude destes
motivos, estes mtodos foram desenvolvidos e validados.
A soluo de digluconato de clorexidina utilizada neste trabalho cumpriu com
os testes de identificao, uma vez que estava de acordo com os parmetros
farmacopicos exigidos e de acordo com a soluo padro secundrio.
O mtodo analtico de doseamento microbiolgico da soluo de digluconato
de clorexidina por difuso em gar mostrou-se uma tcnica eficiente, com pouco
custo e facilidade de execuo. Foi possvel validar este mtodo, utilizando-se
anlises de varincia, no qual a soluo apresentou potncia de 92,58% frente ao
microrganismo S. aureus.
As formulaes de sabonetes lquidos desenvolvidas demonstraram diferentes
caractersticas fsicas, quando observadas visualmente, confirmando o fato de haver
precipitao e turvao das preparaes contendo tensoativo aninico lauril.
Em relao viscosidade, tambm foi observado que, com aumento da
concentrao de clorexidina nos produtos, houve aumento da viscosidade, at o
ponto em que o sistema micelar do tensoativo suportou a quantidade de clorexidina
presente e conseguiu manter o sistema, como observado nas formulaes I e II
contendo 1% e 2% de clorexidina. No entanto, ao adicionar quantidade maior de
clorexidina, o sistema micelar no mais conseguiu estabilizar o sistema, acarretando
perda da viscosidade, como observado nas formulaes I e II contendo 3% e 4% de
clorexidina.
Em relao ao tensoativo aninico sarcosinato, houve uma melhor estabilidade
do sistema sem a presena de turvao e precipitao, demonstrando que este
Discusso geral
146
detergente embora seja tambm aninico, foi estruturalmente mais compatvel com a
clorexidina.
De acordo com resultados dos ensaios de atividade antimicrobiana pelo
mtodo de difuso em gar foi verificado que as formulaes 1 e 2 contendo
tensoativo aninico lauril no apresentaram atividade antimicrobiana. Entretanto,
quando analisadas pelo mtodo da microdiluio em caldo, houve atividade para
alguns dos microrganismos analisados, demonstrando que a incompatibilidade deste
produto com a clorexidina tcnica.
O fato de no ter havido resposta antimicrobiana pelo mtodo de difuso em
gar para as formulaes 1 e 2, pode ser devido interao entre o tensoativo
aninico lauril e o meio de cultura slido, entre o excesso de clorexidina e o meio de
cultura slido, dificuldade de difuso por causa do excesso de viscosidade nas
formulaes com maiores quantidades de clorexidina e pela formao do complexo
aninico-catinico formado entre a clorexidina e tensoativo lauril, que pode ter
dificulatado a difuso da clorexidina no gar.
O fato de ter havido halo de inibio de crescimento microbiano menor para as
formulaes 3 e 4 com maiores concentraes de clorexidina, quando analisadas
pelo mtodo de difuso em gar, possivelmente ocorreu porque houve maior
interao do excesso de clorexidina com o meio de cultura slido, devido
viscosidade das formulaes com maiores concentraes de clorexidina e pode ter
havido formao de complexo aninico-catinico entre o tensoativo sarcosinato e o
excesso de clorexidina, que dificultou a difuso no gar.
O tensoativo sarcosinato pode ter interagido menos com o meio de cultura
slido e isto possibilitou a difuso do mesmo no gar e houve formao do halo de
inibio de crescimento, pois como j foi visto anteriormente neste trabalho, este
tensoativo possui atividade antimicrobiana superior a do tensoativo lauril. Entre os
microrganismos testados, os Gram-positivos foram mais sensveis.
Quando as formulaes 3 e 4 foram analisadas pelo mtodo de diluio em
caldo foi verificado que com o aumento da concentrao da clorexidina nas
formulaes houve melhora da resposta antimicrobiana, demonstrando que no
houve interaes entre as formulaes e o meio de cultura lquido.
O mtodo de microdiluio em caldo foi melhor em relao tcnica de difuso
em gar, pois a viscosidade das formulaes, as interaes entre o tensoativo e o
meio de cultura e a maior quantidade de clorexidina nas formulaes no interferiram
Discusso geral
147
Discusso geral
148
10. CONCLUSES
Concluses
150
151
Concluses
foi 8,3 horas e para o sabonete com a clorexidina foi 4,1 horas. Para S. aureus o valor
D encontrado para o sabonete sem a clorexidina foi 1,4 horas e para o sabonete com
a clorexidina foi 0,43 horas e para C. albicans, o valor D encontrado para o sabonete
sem a clorexidina foi 1,1 horas e para o sabonete com a clorexidina foi 0,43 horas.
Foi possvel desenvolver e validar o mtodo de anlise quantitativa de
sabonete
lquido
contendo
digluconato
de
clorexidina,
pela
tcnica
de
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