Polymerase Chain Reaction

(PCR)

Polymerase Chain Reaction

Reao em Cadeia da Polimerase
(Kary Mullis, 1993)

Tpicos
PCR
Alvos
Denaturao
Primers
Anelamento
Ciclos
Requerimentos

DNA
Exemplo de padro de ligao.
Padro primrio
CCGAATGGGATGC
GGCTTACCCTACG

Padro complementar

DNA Molecule
Adenina

Timina
Guanina
Citosina

PCR = Polymerase Chain Reaction

ou
Reao em cadeia da Polimerase
ou
Reao de polimerizao em cadeia
ou
Polimerizao em cadeia do DNA
Tcnica de biologia molecular empregada para
obter-se amplificao exponencial de pequenas
quantidades de DNA in vitro, empregando elementos
do processo natural de replicao do DNA.
O conceito de amplificao do DNA no novo e
sempre foi utilizado, entretanto, a amplificao era
feita in vivo e no in vitro como na PCR.

PCR
PCR (Reao em Cadeia da Polimerase)
uma tcnica que amplifica uma
sequncia especfica de DNA, como
objetivo de torn-la abundante e
disponvel para diversas tcnicas de
biologia molecular.

PCR
Fazer in vitro o que ocorre in vivo
DNA polimerase termoestvel (Taq)
Termociclador

OS Alvos do PCR
Os alvos a serem considerados no PCR

so as regies que flanqueiam a

sequncia especfica de DNA a ser
amplificada, a qual pode ser um gene
inteiro ou somente uma regio
pequena.

PCR Targets
O nmero de bases nos alvos pode
variar.
TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA
O . . . . Representa o meio da sequncia
de DNA, e no h problemas em no
conhec-la para poder amplific-la.

PCR - Desnaturao
A desnaturao o primeiro passo do

PCR, no qual as fitas de DNA so

separadas atravs de aquecimento a
95C.

PCR Primers
Os primers so sequncias de 15 a 30
nucleotdeos, fita nica, que so usadas
para flanquearem as extremidades da
regio a ser amplificada. Marcam o
incio e o fim da sequncia-alvo.

PCR Primers
Um primer para cada extremidade da sua
sequncia alvo deve ser desenhado,
para que as fitas sejam copiadas
simultaneamente em ambas as
direes.

PCR Primers
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT
AATTGCCGGAATT . . . . . . . . . .>
e
<. . . . . . . . . . AAATTTGGCCAA
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT

PCR Primers
OS primers so colocados em excesso

na reao de PCR, para que eles se

liguem ao DNA alvo, ao invs das duas
fitas se ligarem de novo uma a outra.

PCR - Anelamento
O anelamento o processo atravs do qual
duas sequencias de nucleotdeos so ligadas
atravs da formao de pontes de
hidrognio. Na reao de PCR, o anelamento

se d atravs da ligao dos primers com o

DNA Alvo, a temperatura de 55C.

PCR Taq DNA Polimerase

O nome Taq vem de Thermus aquaticus,
a qual uma bactria encontrada
sobrevivendo a altas temperaturas em
geisers no Yellow Stone National Park.

PCR Taq DNA Polimerase

Essa bactria produz uma enzima DNA
polimerase, a qual amplifica o DNA a
partir do anelamento com os primers,
na presena de Mg, a altas
temperaturas.

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Cycles

PCR Ciclos
Desnaturao: 94- 95C
Anelamento: 55- 65C

Extenso: 72
Nmero de ciclos: 25-40

 Desnaturao do DNA molde (template) por aquecimento

Pareamento dos primers seqncia alvo fita simples
Extenso dos iniciadores pela DNA polimerase
termoestvel

PCR Ciclos

Primeiro ciclo da PCR

Aps sucessivos ciclos

PCR Ciclos

PCR Ciclos
Nmero de cpias da
Regio alvo de DNA

A = 2n
n = nmero de ciclos

PCR Requerimentos
Cloreto de Magnsio: .5-2.5mM

Tampo: pH 8.3-8.8
dNTPs: 20-200M

Primers: 0.1-0.5M
DNA Polimerase: 1-2.5 units
DNA Alvo: 1 g

OTIMIZAO DA PCR POR QU?

Otimizar a amplificao para:
Aumentar a quantidade de produto final
(eficincia)
Aumentar a especificidade, principalmente
quando h grande background
Melhorar a reprodutibilidade (de tubo para tubo e
de reao para reao)
Parmetros a serem considerados na otimizao:
Desenho dos primers
Condies de ciclagem
Concentrao dos reagentes
Composio do tampo

DESENHO DOS PRIMERS

Tamanho ideal:
- O tamanho ideal de um primer depende de seu
contedo de A+T e da Tm do primer oposto
- Deve ser complexo o suficiente para evitar o
pareamento em regies inespecficas
Usualmente oligonucleotdeos de ~20 bases (a
probablididade de uma sequncia especfica de
20 bases ocorrer em um genoma uma vez a
cada 420 bases)

TEMPERATURA DE
ANELAMENTO

MAIS
ESPECIFICIDADE
(menor
rendimento)

MENOS
ESPECIFICIDADE
(bandas
inespecficas)

Desenho dos primers

O pareamento especfico depende criticamente da
temperatura, alm de ser influenciado pela concentrao de
ctions, pelo tempo na temperatura de pareamento e outros
fatores
A temperatura de pareamento deve ser a mais alta possvel
Clculo da Tm (< 20 bases)
Tm = 4(G+C) + 2(A+T) oC Tanel = Tm 4oC

Desenho dos primers

RECOMENDAES:
Tamanho: 15 a 20 bases
Sequncia: 40-50% de G+C distribudos
aleatoriamente
Checar para formao de estruturas secundrias
internas
Evitar complementariedade entre os pares de
primers, principalmente na posio 3 (primerdimer ou dmeros de primers)*
Checar se o par de primers tem Tanel prximas
(no mximo, de 2 a 3C de diferena)

Touch down PCR melhora rendimento da PCR:

Exemplo: variar a temperatura de pareamento (Tanel)
entre 65oC e
55oC, reduzindo a temperatura em 1oC a cada 2
ciclos, durante 20
ciclos. Fazer mais 10 ciclos a 55oC
PCR Gradiente permite ajuste preciso da Tanel:
Exemplo: Correr uma srie de reaes com diferentes
Tanel no mesmo bloco considerando-se a
temperatura mdia de anelamento e a faixa de
variao 61oC 10oC
Nos ciclos iniciais da PCR a proporo primer-template
deve ser 107 (excesso de primer): para amostras
muito diludas (100 cpias de template ou menos) h
risco de formao de dmeros de primers (*).
Booster PCR inicia-se a reao com concentrao
menor de primer e aps alguns ciclos eleva-se a
concentrao

 Primers de um par devem ser usados na

mesma concentrao
Excesso de primers induz a formao
de produtos inespecficos e formao
de dmeros de primers

Condies de ciclagem
A durao da etapa de extenso (72C) deve ser
calculada em funo do tamanho do produto que
se deseja amplificar
Em geral utiliza-se 1 min/kb de produto mais do
que suficiente pois a extenso ter incio durante
a etapa de pareamento e durante a elevao da
temperatura at 72C

PCR convencional Three step

1- Denaturao inicial 2-3min a 95C
2 Denaturao, 15s a 95C
3 Paremento, 15s a xoC (x depende da
Tm)
4 - Extenso, x min a 72C
(x depende do tamanho do produto
1min/kb)
5 Voltar ao passo 2 por 29-39 ciclos
adicionais

Two step alta especificidade,

menor tempo de ciclagem Primer Tm > 65C
1- Denaturao inicial 2-3min a 95C
2 Denaturao, 15s a 95C
3 Paremento e Extenso simultneos, x min
a 68C x depende do tamanho do produto
(1min/kb)
4 Voltar ao passo 2 por 29-39 ciclos
adicionais

ons Mg2+ so necessrios para estimular

a enzima Taq DNA polimerase

Otimizao da [Mg2+]: Efeitos da variao de

Mg2+:

INIBIO DA PCR
Contaminantes da amostra de DNA podem inibir
fortemente a PCR
Inibidores da DNA polimerase:
- Fenol
- Proteinase K
- Agentes quelantes em excesso (EDTA)
- Elevadas concentraes de sal
- SDS

MTODOS QUE EMPREGAM A PCR:

RAPD Random amplified polymorphic DNA
AFLP Amplified fragment length polymorphism
Multiplex-PCR
PCR-RFLP
Long-PCR
RT-PCR (Reverse Transcriptase)
RT-PCR (Real Time) - quantitativo

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Centrifugar, extrair e descartar o plasma, com o cuidado de
No remover a faixa de clulas brancas.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Extrair cuidadosamente 200ul da regio de clulas brancas
E separar em tubos identificados

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Adicionar
Protease a
Cada tubo
Adicionar
Tampo de
Lise em cada
tubo

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Realizar
Homogeneizao
Criteriosa do
material

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Incubar os tubos
A 56C por pelo
Menos 10min.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Centrifugar os tubos
para retirar quaisquer
grumos

Adicionar etanol para lavagem

e centrifugar de novo.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Adicionar as amostras em colunas de afinidade e
centrifugar .

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Tubo com coluna
A coluna vai ser retirada
e adaptada em outro tubo
no qual ser feita a eluio
Coluna.

Esse eluato (flow

through) ser
Descartado.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

A coluna ser colocada em um novo tubo, aonde ser

Lavada mais duas vezes com tampo, para retirar quaisquer
Molculas que no estejam ligadas fortemente a coluna.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

A coluna com o tubo ento centrifugada
Mais uma vez, para remover excesso de
Tampo de Lavagem.
O prximo passo adicionar Tampo de
Eluio
Incuba-se por 30 minutos a 25C
O eluato da coluna ento guardado,
pois agora esse contm o DNA Alvo.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Ento pode-se preparar o mix de PCR.
Mix de PCR
10x Buffer - 10 l

MgCl - 6 l
dNTPs- 0.8 l

Primer forward - 2 l
Primer reverse - 2 l
Taq polimerase - 0.5 l
H2O estril - 73.7 l

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Adicionar ao mix de PCR a amostra de DNA em tubos
Especficos e colocar em termociclador.

Preparo do gel de agarose

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Anlise do produto de PCR.

DERIVAES DA PCR

RT-PCR PCR para RNA

Nested-PCR Iniciadores internos
PCR Multiplex Vrios iniciadores
LSSP-PCR PCR em baixa estringncia com um s
iniciador
PCR competitivo utilizao de um DNA conhecido
de concentrao conhecida que compete com o DNA
molde a ser identificado
PCR em Tempo Real (Real Time PCR)
visualizao da reao de PCR com possibilidade de
quantificao atravs de um termociclador acoplado
a um espectrofotmetro.

FATORES QUE INFLUENCIAM OS

RESULTADOS DE PCR

Tamanho e composio dos iniciadores

Temperatura de ligao
Concentrao do DNA molde
Concentrao de MgCl2
Nmero de ciclos
Presena de contaminantes
Eletroforese

Bibliografia
Alberts, Brown,Johnson, Lewis, Raff, Roberts,
Walter. Use of PCR in Forensic Science. 1998.
Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/
forensci_PCR.htm.l
Brown, John C. What The Heck Is PCR? 1995.
Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available
http://falcon.cc.ukans.edu/~jbrown/pcr.html
Photographs: Courtesy of UMC clinical lab and Tom
Wiggers.

Bibliografia
Ronald H. Holton, Ph.D.:
Molecular Diagnostics in the Clinical
Laboratory
Molecular Biology in the Clinical Laboratory
Molecular Pathology: Basic Methodologies
and Clinical Applications
Expanding applications of PCR, by Peter
Gwynne and Guy Page