Fig. 1.

Esquema que muestra el derramamiento de lquido cefalorraqudeo de CNS

tDNA malignidades. Las clulas del tumor primario de tumores cerebrales y de la
mdula espinal derram ADN en el LCR que baa el CNS. El ADN purificado a
partir de la CSF es analizada para el tumor-mutaciones especficas.
Identificacin de mutaciones somticas.
Al menos una mutacin identificada en cada uno de los 35 tumores analizados
utilizando un enfoque escalonado [secuenciacin selectiva seguida por todo
exome sequencing (WES)] se describe en materiales y mtodos.
Con el enfoque de secuenciacin selectiva, se identificaron mutaciones en 13
tumores. Las mutaciones en estas muestras se produjo en TP53 (protena tumoral
p53; n = 5), Idh1 (isocitrato deshidrogenasa 1; n = 2), o el promotor de TERT
(transcriptasa inversa de la telomerasa; n = 6) (Tabla S2). En los restantes 22
tumores, WES fue utilizado para identificar al menos una mutacin por cada
conjunto de datos de muestra (S1). Los genes mutados en estas muestras
incluyen controladores, conocido como NF2, PIK3R1, PTCH1 y PTEN (18). Las
fracciones de alelos mutados en los tumores eran generalmente altos, con un
promedio de 46% (con una SD de 18%). Este hallazgo es compatible con el
esperado desarrollo temprano del controlador de mutaciones gnicas durante la
evolucin del tumor y la presencia de clulas no neoplasica en todos los tumores,
incluso macro diseccionado como las muestras utilizadas aqu. Todas las
mutaciones identificadas fueron confirmados para estar ausente en el ADN de
Igualada (no canceroso) de clulas normales de cada paciente.
La presencia de una de las mutaciones detectadas en cada tumor del paciente se
evalu en el LCR del mismo paciente mediante un mtodo basado en la
secuenciacin sensibles. Este mtodo detecta mutaciones con el alelo fracciones
tan bajo como 0.01% (8, 19). Un promedio de 4.8 mL de LCR (SD 2.6) fue
recolectado en 35 pacientes (Tabla S2).
El ADN puede ser purificados de todas las muestras de LCR, aunque las
cantidades varan considerablemente (promedio de 417 ng; SD de 553 ng) (Tabla
S2). Los cebadores fueron diseados para amplificar cada una de las 35
mutaciones como se ha descrito anteriormente (8, 19). Utilizando esta tecnologa,
encontramos que el 74% de 35 muestras de LCR contenan niveles detectables de
ADN tumoral. La detectabilidad de tumor en el ADN presente en el LCR no se
correlacion con las caractersticas demogrficas, la duracin de los sntomas, la
presencia de hidrocefalia, mejora de contraste en imgenes o mutacin tipo tabla (
S3). La fraccin de alelos mutantes en el LCR fue, como era de esperar, en
general, inferiores a la fraccin en los tumores primarios, y tambin era mucho

ms variable que en los tumores primarios. El promedio de fraccin alelo mutante

detectables en el LCR fue de 12,2% (intervalo = 0,1-77%).

Relacin entre las mutaciones y las caractersticas clnicas.

La gran variacin en el alelo mutante fraccin entre las muestras de LCR sugiere
que podra haber algn factor biolgico o anatmicas subyacentes de las
diferencias. Los tumores fueron distribuidos entre el cerebro y la mdula espinal
(Tabla 1), y tumores que surgen en ambos rganos fueron detectados en
frecuencias similares (P = 0,16; prueba de t). De grado alto (grados III y IV de la
OMS) de los tumores eran ms propensos a tener MCA-tDNA detectables de
lesiones de bajo grado (P = 0,004) (Tabla S3), que se pone de manifiesto por el
hecho de que todos menos uno de alto grado
tumor (18 de 19) fue detectado. Los niveles de MCA-tDNA tambin fueron
mayores en lesiones de alto grado, que en lesiones de bajo grado (alelo mutante
fracciones de 16,3 21,2% vs. 2,8 6,8%). Dieciocho de los 19 (95%) de alto
grado (grado III o IV de la OMS) de los tumores presentaban niveles detectables
de MCA-tDNA. Sin embargo, el tamao del tumor no fue un factor significativo en
la prediccin de MCA-tDNA detectabilidad o nivel (P = 0,41) (Tabla S3).
Otro factor importante asociado con CSF-tDNA niveles era la ubicacin anatmica.
Las IRM se examinan para comprobar la presencia de realce con contraste
adyacente a un gran espacio de LCR (Tabla 1). Se proporcionan ejemplos
representativos en la Fig. S1. Los pacientes con lesiones adyacentes a un
depsito de LCR en el cerebro o la mdula espinal fueron mucho ms propensos a
tener niveles detectables de MCA-tDNA que aquellos con el resto de las lesiones.
Dichos embalses incluidas las superficies corticales y los ventrculos as como la
basal y otras cisternas. En consecuencia, el 86% de los 28 casos en los que los
tumores eran adyacente a un depsito de CSF tenan niveles detectables de MCAtDNA. Estos casos incluan los 13 los gliomas de grado alto, los 3 y los 5, los
ependimomas meduloblastomas que estuvieron en contacto con el lquido
cefalorraqudeo. Los cuatro tumores en contacto con LCR que no eran detectables
eran todos los gliomas de bajo grado. Adems, cero de cinco pacientes cuyos
tumores eran totalmente encapsulada por el parnquima cerebral o de la mdula
espinal tenan niveles detectables de MCA-tDNA (P < 0,001) (Tabla S2). En la
regresin logstica multivariada , slo la ubicacin de los tumores con respecto al
LCR y el grado tumoral fueron estadsticamente significativas (Tabla S4).

Genoma completo de secuenciacin de ADN de la CSF.

Los resultados descritos anteriormente se encontraron despus de identificar al

menos una mutacin en el tumor primario de cada paciente. En cuatro pacientes
con cualquiera de tallo cerebral o tumor intramedular, tambin probamos si CSFtDNA puede ser detectado directamente en su LCR por Wes sin conocimiento
previo del tumor genotipo. Estas cuatro muestras fueron seleccionados sobre la
base de la crtica y muy sensible en la ubicacin de los tumores, haciendo ciruga
traicionero. Descubrimos que dos de los cuatro casos analizados tenan niveles de
MCA-tDNA que eran comparables con los niveles identificados mediante
secuenciacin Safe-Seqsingleamplicon (S) cuando la misma mutacin fue
evaluado (Tabla 2). Ambos casos detectables tenan ms de un 10% alelo mutante
fracciones en el LCR solo amplicn
medido por secuenciacin. En contraste, los dos casos en los que no pudo
identificar a WES MCA-tDNA haba alelo mutante fracciones <1% evaluadas por
single-amplicn de secuenciacin. Como controles, tambin realizamos WES
coincidentes en los tejidos normales y de los tejidos tumorales.

Las mutaciones se encontraron en los tumores a una frecuencia alta,

pero estaban ausentes en tejidos normales.
DISCUSION
Tcnicas mnimamente invasivas para monitorizar la carga de
enfermedad ha sido un reto para muchas enfermedades del sistema
nervioso central, incluyendo el cncer.
Este reto resulta de importancia por los altos riesgos asociados con
procedimientos neuroquirrgicos y las limitaciones reconocidas de
tcnicas de imagen actuales. En pacientes con cncer, no hay manera
fiable de analizar los efectos del tratamiento fuera de la recurrencia del
tumor, haciendo que muchos pacientes se sometan a cirugas repetidas
innecesarias.
Por ejemplo, en ~ 30% de los pacientes con glioblastoma que se
someten una reseccin de repeticin para la recurrencia de presuncin,
examen patolgico de la pieza resecada revela la necrosis, la
cicatrizacin, u otros efectos relacionados con el tratamiento en lugar de
la enfermedad recurrente (20). Por el contrario, mientras que los
pacientes estn esperando o se recuperan de la ciruga para las lesiones
sospechosas, la quimioterapia o la radioterapia no se puede administrar,
proporcionando tiempo para el tumor sin disminuir su crecimiento. Por
ltimo, los pacientes a menudo se mantienen en medicamentos

ineficaces regmenes definitivos hasta que los signos de la progresin

tumoral aparecen en las imgenes. Este retraso en la deteccin descarta
la posibilidad de oportunidades para someterse a nuevas terapias
dirigidas que podran ser eficaces para su enfermedad (21).
Los costos de la salud de stos oportunidades perdidas se
incrementarn con los avances esperados en modalidades teraputicas.
Dada la necesidad de marcadores sensibles y especficos para
supervisar la dinmica del tumor, nos preguntamos si el ADN derivado
del tumor podra ser encontrado en el LCR de pacientes con tumores
primarios del SNC. Este estudio fue estimulado por nuestra incapacidad
para la deteccin coherente en el cfDNA el plasma de estos pacientes
(8) e inspirada en las manifestaciones anteriores que el ADN derivado
del tumor se puede encontrar en los lquidos situados en la proximidad
de las lesiones neoplsicas. Por ejemplo, un piloto reciente estudio de
Pan et al. (22) sugiere que el ADN derivado del tumor puede ser
detectado en el lquido cefalorraqudeo de los individuos cuyos tumores
primarios han hecho metstasis en el cerebro. Aunque la puncin lumbar
para obtener LCR no es un procedimiento no invasivo, que califica como
mnimamente invasiva y en la actualidad se lleva a cabo de forma
rutinaria a seguir algunos pacientes con tumores cerebrales, en
particular aquellos con meduloblastomas (23, 24). Por desgracia, el
examen de estas muestras de LCR por La citologa es por lo general de
uso limitado, con una sensibilidad relativamente bajas logrado incluso el
uso de grandes volmenes de CSF (25, 26). Slo 1 de 35 pacientes
evaluados en nuestro estudio tenan estudios citolgicos concomitantes
de LCR, lo que impide la comparacin directa. Los resultados de este
estudio sugieren que las tasas de ADN obtenido de tumores encontrados
en el LCR
(74%) la aproximacin de cerca los niveles encontrados en los fluidos
corporales adyacentes a otros tipos de tumores. Por ejemplo, la orina en
el cncer de vejiga estaba encontrado que tienen ADN derivado del
tumor en 70% de los casos, mientras esputo en cncer de pulmn fue
positiva en el 79% de los casos (27, 28).
Aunque la tasa de deteccin observado en este estudio no era 100%, su
sensibilidad fue comparable con o superior a otra pruebas no invasivas
de tumores malignos en general. Por otra parte y como se seala ms
adelante, era particularmente sensible para los tumores que hace tope
un depsito CSF o superficie cortical. Por ltimo, a partir de una

tecnolgica punto de vista, la fraccin media de ADN mutante (12,2%)

super con creces el lmite de deteccin de la secuenciacin ensayo
usado (0,01%). Este ensayo se puede realizar con cualquier disponible
en el mercado de instrumentos de secuenciacin de nueva generacin
un costo relativamente pequeo.
Nuestro estudio revel una asociacin significativa entre la ubicacin y
el tipo del tumor y la presencia de CSF-tDNA. En particular, hemos sido
capaces de detectar todo el grado 13 de la OMS III o IV gliomas (tambin
conocidos
como
astrocitoma
anaplsico
y
el
glioblastoma,
respectivamente), los 5 meduloblastomas, y los 3 ependimiomas que
hace tope un depsito CSF o superficie cortical. Es en estos agresivos
tumores en los que la necesidad de un slido biomarcador es ms
desesperado.
Tambin estn surgiendo datos que algunos tumores cerebrales, en
particular aquellos con genotipos susceptibles a las terapias dirigidas,
puede haber capaz de ser tratados principalmente con terapias mdicas,
obviando de ese modo la necesidad de ciruga en su caso no invasivo de
diagnstico herramientas estaban disponibles (29-32). Tambin vale la
pena sealar que la reseccin quirurgica casi siempre crea una abertura
que se extiende desde la la superficie para el tumor profundo. Este
pasaje normalmente persiste y puede permitir tDNA de cualquier tumor
residual o recurrente para entrar en el LCR. Incluso sin tales aberturas
inducida quirrgicamente, la gran mayora de los meduloblastomas y
ependimomas vayan surgiendo dentro o comunicarse con un depsito
ventricular, hacindolos bien adaptado para la monitorizacin del LCR
(24-26, 33, 34). Los estudios futuros se se requerir la comparacin
directa de CSF-tDNA con la citologa de LCR.
En lugar de reemplazar la citologa, prevemos que va a CSF-tDNA ser
usado en combinacin con l y otros biomarcadores bajos.
Esto podra incrementar sustancialmente la precisin de las
estimaciones de la carga tumoral en varios puntos durante la gestin de
los pacientes.
Dada la naturaleza invasiva y riesgosa de las intervenciones quirrgicas
enel cerebro y la mdula espinal, sera til poder identificar una proceso
neoplsico sin llevar a cabo la ciruga. Nuestros resultados proporcionan
una visin de las posibilidades de este tipo de diagnstico en el futuro.
Se evaluaron cuatro pacientes: un paciente con un tumor en

el cerebro medio, un paciente con un tumor en la protuberancia, y dos

pacientes con un tumor en la mdula espinal. El uso de agua y
saneamiento ambiental, hemos sido capaces de detectar CSF-t ADN en
dos de los cuatro casos mediante la comparacin de los datos con los
obtenidos por secuenciacin dirigida con SEQs segura. Los resultados
fueron consistentes con lo esperado, en que las fracciones de mutantes
puesto de manifiesto por la secuenciacin de todo el genoma estaban de
acuerdo con las identificadas por secuenciacin dirigida (Tabla 2). Otros
casos necesita ser evaluada para dilucidar el potencial de este enfoque
en pacientes en los que las biopsias son un reto, pero nuestros
resultados muestran que el anlisis de todo el genoma del ADN de CSF
es factible en por lo menos en algunos casos.
A pesar de los resultados descritos anteriormente son prometedores,
advertimos que se trata de un estudio exploratorio diseado
principalmente para determinar si era posible detectar CSF-t ADN en
pacientes con primaria tumores del SNC. Un objetivo secundario fue
documentar la anatoma y las caractersticas patolgicas de los tumores
que arrojan
ADN en el LCR. La limitacin tcnica ms importante de nuestra estudio
es que las muestras de LCR se obtuvieron en el momento de la ciruga, y
que a menudo eran de los ventrculos en lugar de a partir de una lumbar
puncin. CSF ha demostrado a circular rpidamente por todos los
ventrculos y embalses de la columna (39, 40). Es, por lo tanto, es muy
probable que el ADN en el lquido cefalorraqudeo obtenido a travs de
la puncin lumbar ser similar a la de los ventrculos, aunque el lquido
obtenido de la puncin lumbar es ms lejos del sitio de malignidad.
Una consideracin adicional es que, en individuos con una masa
voluminosa que obstruye el flujo del fluido espinal o eleva la presin
intracraneal, una puncin lumbar podra no ser seguro. Sin embargo,
estos pacientes casi siempre requieren la descompresin quirrgica para
reducir la masa efecto generado por el tumor, y se podra obtener de
manera segura CSF despus de abrir la duramadre. El mtodo exacto y
la ubicacin de la peste porcina clsica tendr que ser individualizada de
muestreo en pacientes con neoplasias del sistema nervioso central, y
que se basarn en un nmero de factores, incluyendo la localizacin del
tumor, la facilidad de toma de muestras de LCR y caractersticas
clnicas.
Por ejemplo, los pacientes pueden experimentar inicialmente MCA
muestreo desde un espacio intracraneal en el momento de la ciruga
para determinar los niveles basales de CSF-tDNA, pero podran ser

punciones lumbares longitudinalmente utilizado para monitorear los

niveles de CSF-tDNA.
Ahora que se ha documentado que la mayora tumores cerebrales
primarios tDNA liberacin en el LCR, el escenario est listo para un
estudio longitudinal de la utilizacin clnica de este biomarcador.
Nuestros resultados sugerir directrices especficas para un estudio de
seguimiento de este, los ptimos pacientes a seguir seran aquellos con
meduloblastomas, ependimomas, o gliomas de alto grado que lindan
con un espacio CSF, debido a que el ensayo de CSF-tDNA es
particularmente sensible en tales casos y estos tipos de tumores son
relativamente comunes. CSF-tDNA deben ser evaluados durante la
operacin para establecer una lnea de base, y una puncin lumbar
concomitante debe realizarse cuando posibles para garantizar la
concordancia entre las dos muestras de fluido.
Las evaluaciones posteriores de LCR obtenidos a travs de la puncin
lumbar o de un depsito implantado debe compararse con otro
caractersticas clnicas y de laboratorio, con el objetivo de determinar la
uso de CSF-tDNA para detectar la enfermedad residual mnima. Por
ejemplo, pacientes cuya masa persiste en la RM-CSF, pero es tDNA
indetectable se hubiera salvado de una segunda biopsia.
Alternativamente, pacientes en los que la enfermedad residual es
evidente en CSF-tDNA anlisis, pero equvoca en el anlisis de imgenes
pueden ser bien servidos por terapia adicional. En el futuro, es probable
que la mayor parte del cerebro tumores sern evaluados de forma
rutinaria para las mutaciones en varios genes de inters para ambos
propsitos pronsticas y teraputicas (41- 43). La disponibilidad de estos
datos de secuenciacin debe hacer el mtodo descrito aqu ms rentable
y ms fcil de implementar.
Materiales y mtodos
Las muestras de los pacientes. Todas las muestras se recogieron
despus de la aprobacin se obtuvo de la Junta de Revisin Institucional
de Johns Hopkins y el consentimiento informado se previsto. Whole
sangre y LCR se recogieron en el momento de la ciruga antes de
manipulacin quirrgica del tumor. Un pellet WBC se prepar a partir del
muestra de sangre despus de la lisis hipotnica de los glbulos rojos
por centrifugacin a 200 x g. CSFse congel en su totalidad a -80 C
hasta la purificacin de ADN, y la totalidad
Se utiliz volumen de LCR (clulas ms fluido) para la purificacin de
ADN. La cantidad de

CSF utilizado un promedio de 4.8 ml (rango = 0,75 a 10 ml). Cuando el

tejido tumoral fresco estaba disponible a partir de muestras quirrgicas,
se congel inmediatamente a -80 C. Cuando el tejido congelado no
estaba disponible, fijado en formol e incluidos en parafina tejidos se
utilizan para la purificacin de ADN. En cualquiera de los casos (fresco
congelado o fijado con formalina, embebido en parafina), los tumores
fueron microdissected para asegurar celularidad neoplsica superior a
50%. Se purific el ADN de la clula blanco pellet, CSF, y tumor
utilizando un Kit ALLPrep (Qiagen). Anlisis estadstico. Las
caractersticas clnicas fueron comparados entre el LCR muestras con y
sin detectable CSF-tDNA con la prueba t o exacta de Fisher prueba. Los
coeficientes de correlacin entre los resultados se estimaron utilizando
Pearson las estadsticas de correlacin. Un modelo de regresin logstica
se utiliz para estimar las probabilidades de deteccin de CSF-t ADN en
diferentes condiciones. Todos los valores de p son dos lados, y todos los
anlisis se realizaron utilizando el software SAS (versin 9.2; SAS
Institute).
Tumor mutacional de perfiles. Se utiliz un procedimiento por etapas
para determinar una mutacin somtica dentro de cada tumor.
Inicialmente, un enfoque basado en PCR para probar mutaciones en los
codones 130-139 de Idh1; los codones 126-155, 144-178, 250-262 y
fuera IDH2; todos de codificacin de los exones de TP53; y se us el
promotor de TERT (44-48). Si no mutaciones estaban presentes dentro
de estos genes, las bibliotecas de gama sincronizado de ADN de los
tumores y pellets WBC se prepararon y se capturaron (SureSelect;
Agilent) como se ha descrito previamente (47). Massively secuenciacin
paralela se llev a cabo en un Instrumento HiSeq Illumina, ya sea en el
Fondo Goldman Secuenciacin en Johns Hopkins Medical Institutions o
personales Genoma diagnsticos. Las mutaciones fueron identificados
como se describe anteriormente (47, 49-52).
La deteccin de mutaciones en el LCR. Se utiliz ADN de tumor, los
glbulos blancos, y CSF de validar las mutaciones somticas
identificadas por secuenciacin especfica y determinar si estas
mutaciones podran encontrarse en el LCR; 3-5 ng tumoral
y se utiliz ADN de WBC para cada ensayo, mientras que todo el ADN de
la CSF (por
Se utilizaron los casos con <20 ng de ADN CSF est disponible) o 20 ng
de ADN para cada CSF ensayo (Tabla S2). Para este propsito, los
cebadores fueron diseados para amplificar un ~ 100 pb regin que

rodea cada mutacin. Los dos cebadores tenan las secuencias

universales en sus extremos 5 ', lo que permite una segunda ronda de
PCR se realiz con un segundo conjunto de cebadores que contienen
estas secuencias (19, 47). Las secuencias de los cebadores usados para
evaluar cada mutacin se enumeran en la Tabla S5. Los oligonucletidos
utilizados en este estudio fueron sintetizados por TriLink Biotecnologas.
Los Los productos de PCR finales (despus de dos rondas de PCR) fueron
purificados con AMPure (Beckman) y se secuenci usando un
Instrumento MiSeq Illumina. Los datos fueron analizados con el seguro
SEQs la tubera, permitiendo que las mutaciones se producen como poca
frecuencia como 0,01% para ser detectado y cuantificado con confianza
usando las condiciones experimentales aplicadas (19). En todos los
casos, el ADN de la normal clulas sirvi como control para garantizar
que las mutaciones no eran el resultado de errores generados durante la
purificacin de ADN, amplificacin, secuenciacin o procesos. Cuatro
bibliotecas de gama emparejado para las muestras de LCR fueron
tambin generado y capturado exoma-(Tabla 2). Preparacin de la
biblioteca genmica se realiz utilizando el kit de preparacin de
muestras de ADN TruSeq (iluminacin) de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante. captura Exomic (SureSelect; Agilent) y
secuenciacin masiva en paralelo se realizaron como se descrito arriba.