CAPITULO IV

PROPUESTA TECNICA DE LA MEJORA.

4.1 Plan de accin de la Mejora propuesta

FUENTE: Elaboracin propia.

4.2 Consideraciones tcnicas, operativas y ambientales para la implementacin de la

mejora.
Toma de muestra.
Para poder evaluar la capacidad lipoltica de los microorganismos de inters se
procedi con anterioridad a tomar la muestra . Las muestras de agua fueron

recolectadas en la trampa de grasas (de la planta de helados) ubicada

en la parte exterior de la fbrica. Se recolectaron en total dos muestras
de aproximadamente 300 ml cada una. Dichas muestras fueron
colocadas en frascos estriles de 500 ml cerradas hermticamente con
tapas rosca de plstico y conservadas con refrigerantes dentro de un
cooler hasta su llegada al laboratorio.
Tratamiento de la muestra en el laboratorio
Fundamento de la metodologa
El mtodo utilizado en la determinacin de Bacillus sp. y Pseudomonas
sp. consiste en que luego de haber sido sembrados en medios de cultivo
adecuados, al cabo de 24 o 48 horas se observara la presencia de
colonias. Como pruebas confirmativas se utilizaran la tincin Gram que
es una tcnica de laboratorio que permite identificar distintos tipos de
bacterias segn la coloracin de su pared celular e identificndolos si son Gram
positivos o Gram negativos, as como tambin se realizara la prueba de la
catalasa que descompone el perxido de hidrogeno en agua y oxgeno. El
burbujeo procedente del oxgeno indica que la prueba es positiva.

Una vez recolectada la muestra en el laboratorio se manej con las

tcnicas de aislamiento segn sea la bacteria a estudiar ya sea para
Pseudomonas sp o Bacillus sp para ello se requiri de los siguientes
equipos, materiales y reactivos para su manejo.
EQUIPOS:

Cabina de bioseguridad.
Estufa.
Autoclave.
Plancha de calentamiento.
Mechero.
Microscopio.
Termmetro.

MATERIALES:
Frascos de vidrio: 500ml.

 Tubos de ensayo 20 x 150 estriles.

Pipetas 10 y 1ml.
Asas bacteriolgicas.
REACTIVOS:
Agar Cetrimide.
Agar Nutritivo.
Caldo Nutritivo.
Agar Tributirina.
Alcohol.
Material para coloracin Gram (agua destilada, alcohol, cristal violeta,
lugol, alcohol, safranina)
Material para prueba de la catalasa. (anexo3)

EPPs:

Mascarillas.
Guantes de ltex.
Guardapolvos.
Lentes protectores.
Tocas.

Procedimiento para el manejo y aislamiento de Bacillus sp.

Se realiz por el mtodo reportado por Harwood, 1989 y Doi, Mc
Gloughlin, 1992. Para lo cual se suspendi 100 ml de la muestra y se
calent a 80C, durante 10 minutos.
Para la dilucin se emplearon una serie de 3 tubos, cada uno con sus
respectivos rtulos hasta 10-3, a cada uno se le agregaron 9ml de agua
destilada estril. Luego se inoculo 1 ml de la muestra (despus de haber
calentado a 80C y enfriado) al primer tubo, cada vez que se inocula un
mililitro a cada serie se agito por 25 veces para que el volumen
utilizado se pueda homogenizar (estndar methods). (Ver anexo 1).
Posteriormente, se realiz la siembra por dilucin en placas, a la dilucin
10-3 conteniendo agar nutritivo (Orber et al, 2005) realizado con el asa de
siembra por el mtodo del estriado de 4 cuadrantes. Las placas fueron
incubadas a temperatura de ambiente durante 20 horas, la incubacin se
realiz en condiciones de aerobiosis para garantizar que las especies del
genero Clostridium sp. y dems bacterias esporulantes anaerobias estrictas
quedaran eliminadas (C. Harwood, 1889 y J. Martnez,1985 citados en Orber
et al, 2005) pasada las cuales se observaron el crecimiento de las unidades
formadoras de colonias, luego se procedi a la resiembra en tubos con agar
nutritivo inclinado. (Orber et al, 2005), antes de hacer la resiembra se realiz

las pruebas de tincin Gram y catalasa para corroborar sus caractersticas. Y

luego se incubo a 35C como cultivo puro. (Ver anexo 2 y 3)

Procedimiento para el manejo y aislamiento Pseudomonas .

El procedimiento se realizara de acuerdo a metodologa utilizada por (Huan y
Rivera, 2014) con algunas modificaciones orientadas a nuestro trabajo.
Para el aislamiento de Pseudomonas sp en laboratorio se calent la muestra a
temperatura de ambiente para que se pueda realizar las respectivas diluciones.
Para la dilucin se emplearon una serie de 3 tubos, cada uno con sus
respectivos rtulos hasta 10-3, a cada uno se le agregaron 9ml de agua
destilada estril. Luego se inoculo 1 ml de la muestra al primer tubo, cada vez
que se inocula un mililitro a cada serie se agito por 25 veces para que el
volumen utilizado se pueda homogenizar (estndar methods). (anexo 1)
Luego se cogi una azada de la dilucin 10 -3 y se sembrara en las placas Petri
que contienen agar Cetrimide a travs del mtodo del estriado en 4
cuadrantes. La incubacin se realizara a 37C por 48 a 72 horas.

De notarse la presencia de colonias al cabo del tiempo de incubacin se

proceder a realizarse la coloracin Gram y Catalasa para corroborar sus
caractersticas. (Ver anexo 2y3)
Posteriormente, luego de confirmarse con las pruebas se extrajo la cepa
en agar nutritivo y se conserv a 4C. (Ver anexo 3)
Preparacin del inculo de Bacillus sp y Pseudomonas sp
Para la preparacin del inculo se tom una asada de las cepas seleccionadas y
se sembr en caldo nutritivo, luego se incub a 37C por 24 horas. Despus se
procede a evaluar la actividad lipoltica con los diferentes parmetros ya
establecidos. (Huan y Rivera 2014)

Evaluacin de la actividad lipoltica del inculo

Fundamento de la metodologa
El mtodo aplicado para evaluar la actividad lipoltica consiste en observar al
cabo de 48 a 72 horas la aparicin de un halo alrededor de las colonias que
nos indica presencia de actividad lipoltica por accin de las lipasas.

HACER CUADROS ESTADISTICOS

CON LOS RESULTADOS QUE
OBTENGAMOS DURANTE LA
SEMANA

ANEXO1
PROCESO DE DILUCION

(ANEXO 2)
PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA TINCIN GRAM.
Materiales
Laboratorio de ciencias bsicas (mecheros y lavamanos)
Microscopios pticos
Aceite de inmersin
Papel filtro
Papel tises o papel suave
Porta objetos (4)
Cubre Objetos
Pinzas metlicas
Cultivos de microorganismos (Placas de Agar con muestra)
Set de tincin de Gram. (cristal violeta, lugol, alcohol, safranina, agua
destilada)
Cabinas de bioseguridad
Guantes (un par por persona)

PROCEDIMIENTO FROTIS FIJADO:

A.- colocar una pequea gota de agua en el centro del portaobjeto limpio.
B.- flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones aspticas, una pequea
cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua.
C.- remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin
homognea que quede bastante extendida para facilitar el secado.
D.-Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario
realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota
de la suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente
sobre el portaobjetos.
E.- Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin
acercando el portaobjetos a la llama del mechero. En este caso hay que tener
mucha precaucin de no calentar demasiado el portaobjeto pues las clulas
pueden deformarse o romperse.
Tincin Gram.
Cubrir la preparacin con cristal violeta o violeta de genciana durante 1
minuto.
Decantar el colorante y lavar suavemente con agua destilada.
Cubrir con Lugol por 1 minuto lavar suavemente con agua.
Decolorar con alcohol-acetona. Hasta que la preparacin deje de perder
color (30 segundos).
Cubrir con fuccina o safranina por 30 segundos.
Remover suavemente el exceso con agua destilada.
Drenar el frotis y secarlo al aire en posicin vertical o subvente con
papel filtro.
Limpiar el reverso.
Examinar en el microscopio
(ANEXO 3)
PRUEBA DE LA CATALASA
1. PROPOSITO Y ALCANCE:
Se utiliza en la caracterizacin inicial de la mayora de las bacterias. La
enzima catalasa est presente en la mayora de las bacterias aerobias y
anaerobias facultativas que contienen citocromo. Son excepcin
Streptococcus spp y Enterococcus spp.
2. FUNDAMENTO:
Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan el perxido de hidrgeno
en agua y oxgeno gaseoso, y como resultado se liberan burbujas de gas.
3. MUESTRAS:
Colonias bacterianas crecidas en medio de cultivo slido
4. REACTIVOS Y MATERIALES:

Solucin de perxido de hidrgeno (guardar en nevera a 2-8C y no

exponer a la luz):
Al 30% para Neisseria spp.
Al 15% para anaerobios.
Al 3% para el resto de bacterias Nota: al 30% puede servir para
todas las bacterias pero es ms peligroso, por el riesgo de
quemaduras al entrar en contacto con piel y mucosas. Asas
desechables Porta objetos.
5. PROCESAMIENTO
5.1. PROCEDIMIENTO
Depositar una colonia en un porta objetos, preferiblemente de
un medio sin sangre (si el medio es agar sangre no debe
tocarse el agar). Para bacterias anaerobias exponer las
colonias al aire 30 segundos antes de realizar la prueba.
Aadir una gota del reactivo.
Lectura en 10-20 segundos (si es necesario, usar lupa)
6. OBTENCIN Y EXPRESIN DE LOS RESULTADOS.
Positivo: formacin de burbujas
Negativo: no formacin de burbujas o muy escasa produccin tras
20 segundos.