EPITELIAL DE LA RETINA HUMANA El fin del artculo surge como observacin de que la disfuncin de va ubiquitina-proteasona (UPP) se asocia con varias enfermedades degenerativas relacionadas con la edad, pues la ubiquinizacin es un importante sistema del control de las protenas que sern degradadas por el proteasoma, de lo contrario, las protenas anormales o mal plegadas, que pueden ser resultado de situaciones de estrs ambiental, pueden causar daos irreparables. El objetivo es por tanto investigar el efecto del estrs oxidativo en la UPP de las clulas de la retina (EPR). La investigacin del efecto del estrs oxidativo en la UPP en un cultivo EPR se realiz simulando el estrs oxidativo, exponiendo al cultivo celular a perxido de hidrogeno (H2O2) de forma continua o tambin a foto-oxidacin; la actividad de los proteasomas fueron controlados mediante pptidos y se revis la actividad de conjugacin ubiquitina con ensayos tiolester. Para tal fin, primero se hizo la exposicin a H 2O2 de clulas clulas del epitelio pigmentario de la retina (EPR) en lnea (ARPE-19) incubadas en suero, piruvato y fenol. Tambin se expuso estas clulas a A 2E (fluorforo de la lipofuscina) y azul claro como su potenciador, para simular el estrs fotoxidtico. Los conjugados de ubiquitina formados (Ub E1) o tiolsteres ubiquitina (E2) se visualizaron por autorradiografa. La actividad del proteasoma de clulas ARPE-19 se determin, utilizando pptidos. La actividad del proteasoma fue definida como la actividad peptidasa en los extractos celulares. Los resultados de la exposicin de las clulas ARPE-19 de 40 a 50 M H 2O2 durante 4 horas resultarn en una reduccin de 30% a 50% en todas las tres actividades de peptidasa del proteasoma. Del mismo modo, la exposicin de clulas ARPE-19 a A2E cargado y/o a luz azul, result en una reduccin del 40% al 60% en la actividad del proteasoma. La carga de A2E o la exposicin a la luz azul tuvieron poco efecto sobre la actividad del proteasoma. En contraste, la exposicin de ARPE-19 a niveles bajos de H 2O2 (10 M) estimul la actividad de conjugacin de la ubiquitina. La carga de A 2E, con o sin exposicin a la luz azul, vari los niveles de la activacin de enzima ubiquidina y aumento la actividad de conjugacin. La exposicin a H2O2 o fotooxidacin mediada por A2E tambin result en un doble a triple aumento en los niveles de conjugados de ubiquitina endgena. Adems para estudiar el efecto del estrs oxidativo fisiolgicamente relevante en la UPP, primero se determin los niveles de conjugados de ubiquitina
endgenos en clulas del EPR. Como se inform en otros tipos de clulas, la
mayora de los conjugados de ubiquitina detectados en clulas ARPE-19 fueron de alta masa. En esta investigacin, los niveles de conjugados de ubiquitina endgenos aumentaron aproximadamente 2,5 veces cuando las clulas fueron expuestas a una media de 10 M H 2O2 durante 4 horas (estrs oxidativo fisiolgicamente relevante). La exposicin a 50 M H 2O2 aument los niveles de conjugados de ubiquitina endgenas en aproximadamente 3,2 veces.Los ensayos Tiolster mostraron que el nivel de E1 Ub tiolster no cambi despus de la exposicin, lo que indica que la actividad E1 no fue afectada por estos niveles de estrs oxidativo. Por otro parte, con mltiples E2 en clulas de mamfero, tiolster ensayos detectan al menos cuatro E2 activos diferentes en clulas ARPE-19. Los niveles de todos estos tiolsteres E2 Ub aumentaron aproximadamente 60% en la exposicin a 10 MH. Se evalu adicionalmente el efecto de foto-oxidacin mediada por A 2E en la actividad de ubiquitina-conjugacin. Se encontr que la acumulacin de A 2E, independientemente de exposicin a la luz azul, mejor la capacidad de los lisados de clulas para formar conjugados de ubiquitina por 1.8- a 2,6 veces. La actividad de ubiquitina-conjugacin mejorada pareca correlacionarse con un aumento en los niveles de Ub E1 y E2 tiolsteres. La exposicin a la luz azul sola no tuvo efecto detectable sobre los niveles de E1 en las clulas. Estos datos indicaron que la regulacin al alza del sistema ubiquitina-conjugacin en respuesta al estrs oxidativo leve puede explicar en parte la acumulacin de conjugados de ubiquitina endgenos en las clulas RPE. Resumiendo lo referido se puede decir que, la foto-oxidacin mediada por A2E tambin result en un aumento de 3,5 veces en los niveles de conjugados de ubiquitina endgena en las clulas. La exposicin a la luz azul solo tuvo poco efecto sobre los niveles de conjugados de ubiquitina endgena, mientras que la acumulacin de A2E solo result en un aumento de 1,7 veces en los niveles de conjugados endgenos. La acumulacin dramtica de conjugados de ubiquitina endgena, cuando se expuso a la RPE con niveles fisiolgicamente pertinentes de estrs oxidativo; indic, que la capacidad de las clulas para procesar ubiquitina conjugados se vio afectada por el estrs oxidativo. Por otro lado, a fin de probar el efecto de la oxidacin fisiolgicamente relevante sobre la actividad de la proteasoma, se evalu el efect de la fotooxidacin mediada por A2E en la actividad del proteasoma en clulas ARPE-19. Encontrndose que la exposicin a la luz azul o a la acumulacin de A2E e forma independiente, solo tuvo poco efecto sobre la actividad del proteasoma. En contraste, la acumulacin de A2E y la exposicin a la luz azul juntas, resultaron en una disminucin de 40% a 60% en las tres actividades de peptidasa del proteasoma. La actividad de tipo quimotripsina y la actividad de tipo tripsina del proteasoma fueron preferentemente afectadas por fotooxidacin. Es decir, los datos indican que el proteasoma en RPE es
susceptible al estrs oxidativo y puede ser inactivado por el estrs oxidativo
fisiolgicamente relevante. La actividad en el sobrenadante de clulas ARPE19 H2O2 o la inactivacin inducida por fotooxidacin-del proteasoma pueden ser mediados por las especies reactivas de oxgeno o por productos de la peroxidacin de lpidos. Tambin se investig los efectos de H 2O2 y HNE sobre las protenas, la pregunta era si las protenas oxidadas afectaran al proteasoma. Para lo cual se prepar el sobrenadante-proteasoma libre de clulas ARPE-19, una fraccin del sobrenadante-proteasoma libre se trat con H 2O2. Resultando que el tratamiento del sobrenadante con H2O2, aumento significativamente los carbonilos de protenas, un indicador de la oxidacin de protenas. Se aadieron tambin, fracciones de proteasoma libre no oxidado u oxidadas a la fraccin enriquecida de proteasoma ARPE-19 y despus se midi la actividad de tipo quimotripsina del proteasoma. Encontrandose que la adicin de la proteasoma no oxidado fraccin libre a la fraccin enriquecida con proteasoma no tuvo efecto sobre la actividad del proteasoma. Estos datos indican que el H2O2 y HNE, pero no protenas oxidadas, inhiben la actividad del proteasoma. Para concluir se recuerda que la UPP juega un papel importante en un gran nmero de funciones celulares, como el control de la calidad proteica y que, una extensa agresin oxidativa tambin puede probablemente daar o poner en peligro el funcionamiento de de las clulas RPE. En este trabajo se evaluaron los efectos de los factores de estrs oxidativo fisiolgicamente relevantes de la UPP en las clulas RPE humanas cultivadas. Los datos obtenidos y ya referidos sugieren, que las especies reactivas del oxgeno o productos de peroxidacin de lpidos tales como HNE juegan un papel importante en la inactivacin del proteasoma sobre el estrs oxidativo fisiolgicamente relevante. En consonancia con la observacin de que el proteasoma en clulas ARPE-19 es susceptible al estrs oxidativo, de igual forma los experimentos realizados mostraron que el proteasoma fue inhibido por especies reactivas del oxgeno o productos de peroxidacin de lpidos pero no por protenas oxidadas (condiciones oxidantes suaves). Aunque los datos tampoco descartan esta posibilidad. Este trabajo indica tambin que otro mecanismo, la inactivacin oxidativa de la proteasoma, tambin podra contribuir a la acumulacin de conjugados de ubiquitina en respuesta al estrs oxidativo. En conclusin se puede afirmar que la disminucin, relacionada con la edad, en la capacidad antioxidante en muchos tejidos, reducir la actividad del proteasoma en muchos tejidos, incluyendo retina; esta disminucin en la actividad del proteasoma puede ser responsable de la acumulacin de protenas daadas en varios tejidos, en particular para clulas. Por tanto, proteccin del proteasoma de la inactivacin oxidativa puede ser una estrategia
vlida para prevenir la relacionada con la edad acumulacin de protenas
daadas y la aparicin o el progreso de enfermedades. Los datos de este trabajo indican, que el proteasoma es un objetivo de estrs oxidativo y que la inhibicin del proteasoma puede explicar la acumulacin de conjugados de ubiquitina. Por ejemplo, la inactivacin oxidativa de la proteasoma en RPE podra ser una de las conexiones mecnicas entre el estrs oxidativo y la patognesis de la AMD (degeneracin macular relacionada con la edad). Por lo tanto, la proteccin del proteasoma de la inactivacin oxidativa puede ser una estrategia vlida para la prevencin de enfermedades relacionadas con la edad, incluyendo AMD