Anlisis Instrumental

Unidad IV Mtodos pticos de

Anlisis Instrumental
Prof. Dr. Eliel R. Romero Garca
M.C.Q. Fernando Bedolla Czares

2.1 Mtodos pticos de anlisis

instrumental
a. Espectroscopia Atmica:
Espectroscopia atmica de absorcin
Espectroscopia atmica de emisin

b. Espectroscopia Molecular:
Turbidimetra
Nefelometra
Espectroscopia UV-Vis
Espectroscopia IR

Mtodos de pticos basados en la Absorcin de

radiacin UV-Vis
La regin del espectro de absorcin UV-Vis engloba las radiaciones
perceptibles por el ojo humano y han sido muy tiles especialmente
en el campo del anlisis cuantitativo, est constituida por tres zonas
del espectro EM:
1. UV-Cercano 185-400 nm
2. Visible 400-700 nm
3. IR-Cercano 700-1100 nm

Espectrometra de absorcin UV-Vis

La mayora de los espectrmetros comerciales cubren en el rango 185900 nm.
El rango inferior depender de la naturaleza de los materiales pticos y
la presencia de gases (v.g. O2, vapor de agua).
Algunos equipos alcanzan hasta 150 nm con muestras en estado gaseoso
en la regin UV-vaco.

Matices absorbidos y transmitidos

Verde
azul

Azul
verdoso

Azul

Naranja

Amarillo

Verde

From left to right: cobalt(II) nitrate, Co(NO3)2 (red); potassium dichromate,

K2Cr2O7 (orange); potassium chromate, K2CrO4 (yellow); nickel(II) chloride,
NiCl2 (green); copper(II) sulfate, CuSO4 (blue); potassium permanganate,
KMnO4 (violet).

Todas las sustancias coloreadas tienen un

sistema de enlaces conjugados.

OH O

CH3
CO2H

H
N

O
HO

OH
OH O
cido carmnico

N
H

O
ndigo

O
H

crocetina

La zona de longitudes de onda que se registra en un

espectro UV- Vis es entre 200 y 800 nm.
En esta zona no absorben dobles ni triples enlaces aislados
Solo van a absorber enlaces conjugados y heterotomos
con pares de electrones no compartidos (O, N)

Espectrometra de absorcin UV-Vis

La absorcin luminosa se da por interaccin de los fotones incidentes
con las especies de la muestra.

Cuando una molcula aislada absorbe un fotn de la regin UV-Vis, la

energa de uno o varios electrones de valencia aumenta, perturbacin que
causa una serie de transiciones resultado de la suma de la energas
rotacional ERot, vibracional EVib, y electrnica EElec:

E tot E Rot E Vib E Elec

En donde: EElec>EVib>ERot

Tipos de electrones absorbentes

Los que participan directamente en la formacin del enlace entre tomos

y que estn asociados a ms de un tomo
Los electrones no enlazantes o externos que no participan y estn
localizados alrededor de tomos como O, S, N, halgenos
Enlaces sencillos: orbitales
Doble enlace: 2 tipos de orbitales, (par e- enlazantes), (el otro par)

Transiciones electrnicas
La absorcin de radiacin UV/VIS se restringe a un nmero limitado de
grupos funcionales cromoforos que contienen los electrones de
valencia con energas de excitacin relativamente bajas.

Hay tres tipos de transiciones electrnicas que implican:

Electrones , y n

Electrones d, f: Iones de los metales de transicin, lantnidos y

actnidos
Electrones transferencia carga: Complejos inorgnicos

1. Transiciones , y n
Se dan en iones y molculas orgnicas.
Las molculas orgnicas son absorbentes de la radiacin EM debido a la
capacidad de elevar los niveles de energa de los electrones de valencia.
Los enlaces sencillos absorben en el rango del UV vaco (l < 185 nm),
debido a la interferencia atmosfrica las determinaciones se limitan a l
superiores.

 La absorcin UV-Vis esta limitada a los grupos cromforos, que son

grupos funcionales que contienen electrones de valencia con energas
de excitacin relativamente bajas.

Los espectros de los cromforos orgnicos son complejos debida a la

superposicin de las transiciones vibracionales y las electrnicas,
dando una banda de absorcin ancha y en ocasiones continua.

1. Transiciones , y n
Tipos de electrones absorbentes en las molculas orgnicas:
1. Los electrones de enlace entre los tomos y que se asocian con ms de un
tomo.
2. Los electrones antienlazantes (* *) y los pares no enlazados (n) de la
ltima capa de valencia, como en el O, N, S y halgenos.
Los tipos de enlaces
moleculares en el
formaldehdo:

1. Transiciones , y n
Son cuatro tipos de
transiciones posibles:
1. *
2.n *
3.n *
4. *

Niveles de energa electrnicos de

los orbitales moleculares

Electrones
implicados

Enlace

transicin

max (nm)

Electrones

C-C, C-H

->*

150

-O-

n->*

185

-N-

n->*

195

-S-

n->*

195

C=O

n->*

290

C=O

n->*

190

C=C

->*

190

Electrones n

Electrones

Comparacin de las transiciones ms frecuentes encontradas en

compuestos orgnicos simples

Transicin *
Un e- del orbital enlazante de la molcula se excita al correspondiente
* por absorcin de la radiacin, por lo que la molcula se encuentra en
estado excitado ,*.
Para la transicin se requiere un alto nivel de energa, por lo que se lo
que se localiza en el rango del UV-vaco.

El metano, por ejemplo, que slo contiene enlaces sencillos CH y que

slo puede sufrir transiciones * presenta un mximo de absorcin a
125 nm
Como la fuerza del enlace CC es menor que la del enlace CH, se
requiere menos energa para la excitacin; por ello, el pico de absorcin
aparece a mayor longitud de onda

Transicin: ns*
Fenmeno caracterstico de los compuestos saturados que contienen
pares de e- no compartidos (no enlazantes).
Requieren menos energa que las * y se producen en la regin 150 a
250 nm y cuyos picos de absorcin aparecen la mayora por debajo de
los 200 nm.
Depende del tipo de enlace y en menor medida de la estructura de la
molcula.
Son de absortividad molar media a baja de 100 y 3000 L cm-1 mol-1.
Muestran batocromia en presencia de solventes polares.
Son pocas las molculas orgnicas detectables en este rango de UV.

Ejemplo: Transicin n* de una amina primaria.

La absorcin correspondiente a esta transicin desaparece al aadir un
equivalente de un cido protnico HX, seguido de la formacin de una sal
de amonio que moviliza el par libre del tomo de N necesario para esta
transicin (frmula entre corchetes).

Algunos ejemplos de absorcin

para transiciones n *

Transiciones n* y *
La mayora de los mtodos de espectroscopia de absorcin de los

compuestos orgnicos se basan en estas transiciones puesto que los picos

de absorcin se encuentran en una regin experimentalmente accesible
(200-700 nm).
Se requieren de grupos funcionales no saturados (electrones ) y dichos
centros absorbentes son denominados cromforos; las molculas de
esqueleto carbonado conteniendo uno ms grupos cromforos se
denominan cromgenos.
El solvente ejerce efecto sobre la l de los picos

Absorcin de algunos cromforos *

Ejemplo,

Transicin

Regin del espectro

electromagntico

s s*

U.V. de vaco

CH4 (Vapor)
(125 nm)

n s*

U.V. lejano

Acetona
(190 nm)

p p*

U.V. cercano

Benceno
(203 y 250 nm)

n p*

Visible

Nitrobenceno
(665 nm)

l max. absorcin

Espectrometra de absorcin UV-Vis

Los picos de absorcin correlacionan con los tipos de enlaces en las

especies en cuestin, por lo que la absorcin puede ser til para identificar
los grupos funcionales presentes en una molcula, pero de mayor
aplicacin es la determinacin cuantitativa de las especies que contienen
los grupos absorbentes.

La absorcin de radiacin UV-VIS es debida a los Cromforos ms que a la

molcula en su conjunto (IDENTIFICACIN DE GRUPOS FUNCIONALES en base a su
l y e).

Es comn que los compuestos orgnicos muestren dos o ms picos

mximos de absorcin en la regin UV.

Espectrometra de absorcin UV-Vis

Los datos se registran anotando la longitud de onda y
el solvente utilizando, adems se indica el logaritmo del
coeficiente de extincin molar en la l en la que se
encuentra el mximo de UV.

letanol
mx 232 nm(log e 4.18)

Espectrometra de absorcin UV-Vis

La energa transmitida a compuestos orgnicos como el
b-caroteno, es suficiente para permitir la ocurrencia de un
gran nmero de diferentes transiciones electrnicas entre
los mltiples niveles de energa vibratorios y rotacionales.

Los valores de E son tan cercanos que la resolucin

completa en una solucin es imposible, obtenindose una
banda amplia de absorcin, conteniendo todas las
transiciones superpuestas.

 Cromforos aislados:
Para una serie de molculas con un mismo cromforo, la posicin e
intensidad de las bandas de absorcin sern constantes. Cuando hay
cromforos separados por al menos dos enlaces simples, se observa la
superposicin de los efectos individuales.

Cromforos conjugados:
Cuando los cromforos se encuentran muy cercanos entre s, el espectro
de absorcin se desplaza hacia mayores longitudes de onda (efecto
batocrmico) y con un aumento en la intensidad de la absorcin (efecto
hipercrmico).

Efecto de los dobles enlaces conjugados sobre la posicin del mximo de

absorcin de la transicin ,* para algunos polienos conjugados

Auxcromos
Es un sustituyente (generalmente saturado) que altera la l y el
coeficiente de extincin molar del mximo de absorcin cuando
se une a un cromforo
Causa el efecto batocrmico y/o el efecto hipercrmico

Desplazamiento hipsocrmico
Para las n * las l son cortas y tienden al azul (efecto hipsocrmico)
conforme aumenta la polaridad del solvente, o sea, es el desplazamiento a
longitudes de onda ms cortas como resultado de una sustitucin o cambio
del solvente.

Absorption spectra of 2-(4'-hydroxystyryl)-N-methylquinolinium-betaine in chloroform (1), water (2)

Desplazamiento hipsocrmico

Absorption spectra of 4-(4'-hydroxystyryl)-N-methyl-pyridinium-iodide

in n-butanol (1), n-propanol (2), methanol (3), water (4)

Desplazamiento batocrmico
El desplazamiento del mximo de absorcin a longitudes de onda
ms largas causado por cualquier sustitucin en el cromforo (por
auxcromo) o un cambio en un disolvente.

Para las ,* la tendencia es hacia el rojo (batocrmico), en donde

las fuerzas de polarizacin atractivas entre el disolvente y el
absorbente tienden a disminuir los niveles de energa de los estados
excitado o no excitado, efecto que tambin se presenta en las
transiciones n,*

Desplazamiento batocrmico e hipsocrmico

hipsochromic shift

batochromic shift

Efecto hipercrmico
Aumento en el coeficiente de extincin molar e; se observa como
un incremento de la intensidad de la banda espectral debida a las
interacciones con los componentes de la matrz molecular; disminuye
la transmitancia e incrementa la absorbencia

Efecto hipocrmico
Reduccin en el coeficiente de extincin molar e

Espectros UV de algunos compuestos orgnicos representativos

Espectros UV de la 1,2,4-tetrazina

Caractersticas de absorcin de algunos compuestos

aromticos

2. Transiciones de Electrones d y f
Observada en la mayora de los metales en transicin absorben en el
UV o visible.

Para los elementos de la primera y

segunda serie de los metales en
transicin son los e- de 3d y 4d (v.g. Cu,
Ti, Cr, V, Mn, Fe, Hg, Co, etc.).

Para los lantnidos y actnidos (v.g.

Holmio, Erbio, Protactinio, Samario, etc.)
son el resultado de transiciones
electrnicas de los e- de 4f y 5f.

Espectros de absorbancia UV-Vis de algunos iones de metales de transicin

3. Electrones de transferencia de carga

Son de emax muy alta (>10 000).
Muchos complejos inorgnicos presentan este fenmeno (complejos de
transferencia de carga).
Son de elevada sensibilidad para la deteccin y determinacin de
especies absorbentes.

Ejemplos: complejos fenlicos, tiocianato con Fe(III), o-fenantrolina

con Fe(II), el complejo de yoduro de yoduro de molecular, el complejo
ferrocianuro del azul de prusia.

Uno de los componentes debe ser dador y otro donador de e-, por lo
que la absorcin implica la transferencia de e- del dador hasta un
orbital del acceptor.
El estado excitado es resultado de un proceso de oxido-reduccin
interno

Aplicaciones de la espectrometra UV-Vis

1.Anlisis cuantitativo
2.Titulaciones Fotomtricas
3.Anlisis cualitativo

Espectroscopia UV-Vis

Anlisis Cuantitativo

Aplicaciones amplias para compuestos

orgnicos e inorgnicos.
De amplia selectividad
Sencilla adquisicin de datos.

- Determinacin de azcares reductores y totales

(prueba del fenolsulfrico), determinacin de
protenas (prueba del c. Bicincnico BCA,
Bradford, Biuret).
- Turbidimetra y densidad ptica (cinticas de
crecimiento celular, biomasa).

Anlisis de un analito individual

Experimentalmente se inicia con una CURVA DE CALIBRACIN [A = f(c)],
partiendo de disoluciones de concentraciones conocidas del analito y
sometidas al mismo tratamiento que la muestra.
La curva ajustada a una lnea recta para diluciones diluidas, permite
deducir la concentracin cx de la muestra problema.
AR

y = mx + b

Ax

Absorbancia

cR

Concentracin

0
cx

Espectroscopia UV-Vis

Algunos factores que influyen

en los resultados de la
valoracin fotomtrica son el
pH de la solucin, la naturaleza
del disolvente y temperatura.

Absorbancia

Una
curva
de
titulacin
fotomtrica es un grfico de
absorbancia,
corregida
por
cambios de volumen, como una
funcin del volumen del titulante.

Punto de
equivalencia

Reactivo en volumen

a) Absorbancia de los tituladores

Absorbancia

Las
mediciones
fotomtricas
o
espectrofotomtricas se pueden emplear
para localizar el punto de equivalencia de
una titulacin, siempre que el analito, el
reactivo o el producto de la titulacin
absorban radiacin.

Titulaciones Fotomtricas

Punto de
equivalencia

Reactivo en volumen

b) Absorbancia de los productos

Espectroscopia UV-Vis

Titulaciones Fotomtricas
Son mejores que las titulaciones por
potenciometra o conductimetra, pero se requieren
tituladores automticos programables.

Ventajas:
1. Se mide directamente la absorbencia de la concentracin.
2. Alto grado de sensibilidad.
3. No hay contacto directo con la muestra.
4.Como resultado de la dependencia lineal y la sensibilidad es til en titulaciones
exactas en sistemas acuosos diludos y los que contienen electrolitos dbiles as
como en sistemas no acuosos.

Titulaciones Fotomtricas
Br -

H2O

-OH + NaOH

p-bromofenol

-ONa

+ H2 O

p-bromofenolato de
sodio
(Azul)

(Amarillo)

Absorbancia (l 325 nm)

Br -

Absorbe el azul (440-475 nm),

molcula menos soluble

0.32

Efecto
batocrmico

Absorbe el amarillo (570-600 nm),

molcula ms soluble

1.2

2.4

3.6

Volumen de NaOH 0.12 N (mL)

Espectroscopia UV-Vis

- Se utiliza para valorar vitaminas ( A, C y D),

- Determinar la presencia de cido ascrbico y
porfirinas en muestras de suero y orina.
- En casos de intoxicacin por CO, la tcnica es
ampliamente usada para detectar la formacin
de carboxihemoglobina en sangre.

Espectroscopia UV-Vis

Anlisis Cualitativo

La espectroscopia proporciona suficientes datos

para:
- La identificacin de sustancias puras y ayudar en
la caracterizacin estructural (ya que la curva de
absorcin completa de una sustancia pura es nica
y permite ser distinguida de todas las dems).
- Puede establecerse el tipo general y, en algunos
casos, la identidad de los constituyentes de
mezclas simples.

Anlisis de mezclas
Espectros no superpuestos

Medidas a 1 para M y 2 para N

Anlisis de mezclas
Espectros superpuestos parcialmente

La eleccin de la es funcin de grado de superposicin

Anlisis de mezclas
Espectros completamente superpuestos

Determinacin de mezclas
Se basa en que, a una determinada longitud de onda la absorbancia
observada es igual a la suma de las absorbancias de cada componente

Para que la exactitud y precisin de los

resultados sean buenas es necesario
seleccionar ambas longitudes de onda
de forma que aAAS < aCAF a una de las
longitudes de onda y lo inverso a la
otra longitud de onda .

Determinacin de mezclas, ejemplo

Se pueden determinar las concentraciones de una mezcla de Fe+3 y Cu +2
formando el complejo con hexacianorutenato (II) , Ru(CN)6 -4 , que forma
un complejo de color azul- violceo con el Fe+3 (max = 550 nm) y un
complejo gris plido con el Cobre (max = 396 nm)
Las absortividades molares de los complejos de metal se resumen en la
tabla siguiente:
Cuando una muestra que contiene Fe+3 y Cu+2 se
analiza en una cubeta de 1 cm de paso ptico la
absorbancia a 550 nm fue de 0,183 y la
absorbancia a 396 nm fue de 0,109.
Cul es la concentracin molar de Fe +3 y Cu+2 en la muestra ?

Determinacin de mezclas, ejemplo

a 550 nm : 0,183 = 9970 CFe + 34 CCu

a 396 nm : 0,109 = 84 CFe + 856 CCu
Despejamos CCu en la primera ecuacin:
=

0.183 9970
34

= 1.275104 M

Y sustituimos en la segunda:
0.183 9970
0.109 = 84 + 856(
)
34
0.109 = 84 + (4.607 251009.41 )
250925.41 = 4.498

4.498
250925.41

= 1.792105 M

Aplicaciones Qumicas

A) Sustancias inorgnicas
Se produce una absorcin selectiva cuando un nivel
energtico electrnico incompleto se halla cubierto o
sobrepuesto por un nivel de energa completo normalmente
formado por valencias de coordinacin con otros tomos.
P.ej. El Cu2+ forma complejos de coordinacin en sol. acuosa
con cualquier molcula o ion disponibles que tengan pares
de electrones sin compartir, como el H2O, NH3, CN-, Cl-, etc.

Aplicaciones Qumicas
B) Molculas Orgnicas:
La absorcin selectiva entre las molculas orgnicas se relaciona con
la localizacin de los electrones en la molcula.
Las molculas con dobles enlaces conjugados producen absorcin a l
mayores, y entre ms extenso sea el sistema conjugado mayor ser la l
a la que se observe la absorcin.
Si el sistema se extiende demasiado la absorcin penetrar en la
regin visible y tendr color, v.g. el b-caroteno tiene 11 dobles enlaces
conjugados y absorbe en l de entre 420-480 nm por lo tanto aparece
de color amarillo-verde.

Espectroscopia UV-Vis

Los picos de absorcin correlacionan con los

tipos de enlaces en las especies en cuestin,
por lo que la absorcin puede ser til para
identificar los grupos funcionales presentes en
una molcula, pero de mayor aplicacin es la
determinacin cuantitativa de las especies que
contienen los grupos absorbentes.

OH O

CH3
CO2H

HO

OH
OH O
cido carmnico

N
H

H
N

O
ndigo

Espectroscopia UV-Vis
AgNO3, 10 mM

AgNPs en soluciones de CTS

1.2

CTS-AgNPs (10mM)

Absorbancia (u.a.)

1.0

0.8

CTS-AgNPs (5mM)
CTS-AgNPs (1mM)

0.6

CTS-[Ag2-(afinina)](NO3)2

0.4

(75 g/mL)
0.2

CTS puro
0.0
350

400

450
Longitud de onda (nm)

500

550

[Ag2-(afinina)](NO3)2
(75 g/mL)

Reglas de Woodward-Fieser: la correlacin del espectro UV

y la estructura
El anlisis estructural a partir de espectros electrnicos es muy impreciso.

Sin embargo, desde 1940 hasta finales del siglo pasado se han desarrollado
espectros de un elevado nmero de molculas que han permitido correlacionar la
estructura con los picos mximos de absorcin.
Las correlaciones ms populares fueron las de Woodward, Fieser y Scott para los
compuestos orgnicos insaturados, dienos y esteroides.

Por medio de tablas se colectaron incrementos, diversos factores y

particularidades estructurales para la prediccin de la banda de absorcin *

La concordancia de los datos experimentales

con los calculados es muy elevada:

Aplicacin de las Reglas de Woodward-Fieser

Reglas de Fieser-Kuhn
Para sistemas polinicos conjugados de ms de cuatro dobles enlaces

lmax = 114 + 5M + n(48.0 - 1.7n) - 16.5 Rendo-10 Rexo

emax = (1.74 x 104)n

n: n dobles enlaces conjugados.

M: sustituyentes alquilo (o similares) unidos al sistema conjugado.

Rendo: n anillos con dobles enlaces endocclicos en el sistema conjugado.

Rexo: n anillos con dobles enlaces exocclicos en el sistema conjugado.

Licopeno

Reglas de Fieser-Kuhn

Valores calculados:
lmax = 114 + 5(8) + 11[48.0 - 1.7(11)] - 0 -0 = 476 nm
emax = (1.74 x 10 4) 11 = 19.1 x 104
Valores experimentales (hexano):
lmax = 474 nm
emax = 18.6 x 104

-caroteno

Reglas de Fieser-Kuhn

Valores calculados:
lmax = 114 + 5(10) + 11[48.0 - 1.7(11)] - 16.5(2) -10(0) = 453.3 nm
emax = (1.74 x 10 4) 11 = 19.1 x 104
Valores experimentales (hexano):
lmax = 452 nm
emax = 15.2 x 104

INSTRUMENTACIN DE USO PARA LA ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN

MOLECULAR UV/VIS
Los espectrmetros estn conformados por tres partes bsicas:
1. Fuente de luz
2. El sistema dispersivo (monocromador)
3. El detector
Muestra

Fuente

Detector

Monocromador

Diseo de un espectrmetro de tipo secuencial de ptica normal

Muestra

Fuente

Sistema disperso

Espectrmetros de tipo simultneo de ptica inversa

Detector de
Detector
fila de diodos

INSTRUMENTACIN DE USO PARA LA ESPECTROSCOPA DE

ABSORCIN MOLECULAR UV/VIS
1) Fuente de luz: (Continua y de potencia constante)

a) Lmpara de Deuterio e Hidrgeno (regin UV 160-375 nm)

b) Lmpara de filamento de Wolframio (regin 350-2500 nm)
c) Lmpara de arco de Xenn (regin de 200-1000 nm)
2) Celdas: (1 cm)
a)
b)
c)
d)

Cuarzo (Vis/IR, con un mx. de 3 mm de espesor de pared)

Slice (Vis/IR, con un mx. de 3 mm de espesor de pared)
Cristal silicatado (regin de 350-2000 nm)
Plstico (Vis)

3) Equipos
a)
b)
c)
d)

Haz sencillo
Doble haz espacial
Doble haz temporal
Multicanal

INSTRUMENTACIN DE USO PARA LA ESPECTROSCOPA DE

ABSORCIN MOLECULAR UV/VIS

Representacin grfica de un espectrofotmetro de ptica dispersiva

convencional

Colormetro Spectronic 20

La disposicin instrumental para medir las propiedades de

transmisin de la luz de soluciones del Spectronic 20

PERKIN ELMER LAMBDA 2

PERKIN ELMER LAMBDA 2

PERKIN ELMER LAMBDA 2

PERKIN ELMER LAMBDA 2

PERKIN ELMER LAMBDA 2

PERKIN ELMER LAMBDA 2

UV/Visible Life Science Spectrophotometer

Representacin grfica de un Espectrofotmetro de

arreglo en serie de diodos

Diagrama de un Espectrofotmetro de arreglo en serie de

diodos