CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)

La cromatografa engloba a un conjunto de tcnicas de anlisis basadas en la

separacin de componentes de una mezcla y su posterior deteccin. Las tcnicas
cromatogrficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase mvil que
consiste en un fluido (gas, lquido, o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra
con un flujo constante de presin proporcionado por una bomba, hasta llegar al
punto donde es introducida la muestra. Siguiendo el flujo de presin la lleva a una
columna donde se encuentra la fase estacionaria que se trata de un slido o un
lquido fijado en un slido.
Los componentes de la mezcla interaccionan de distinta forma con la fase
estacionaria y con la fase mvil. De este modo, los componentes atraviesan
la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando.
Ventajas:

Tcnica sencilla y rpida.

Se puede usar desde la escala microanaltica, hasta la industrial.
Permite tener un registro continuo del anlisis.
Puede aplicarse a sustancias lbiles, por ser poco destructiva.
Volmenes de inyeccin mayores.
Mayor precisin.
No se limita a analitos voltiles.

El equipo se divide en varios mdulos que describir a continuacin:

El modulo de disolventes o tambin conocido como la fase mvil, se colocan

los disolventes a usar con diferentes canales.
Desgacificador. Tiene la funcin de eliminar el aire de los disolventes, mediante
tubos con membranas, para evitar que afecte la continuidad de la fase a travs de
la columna o que cambien los tiempos de retencin.
Modulo de la bomba, es de tipo cuaternario conectada a los diferentes canales
que absorben los disolventes, permite mezclar hasta cuatro diferentes al mismo
tiempo dependiendo de la tcnica, cada que se haga una mezcla se empieza con
el gradiente del 100% y se va reduciendo por lapsos de tiempo hasta ajustar el
equipo al gradiente deseado, ya que no es conveniente hacerlo directamente.
Este compartimento tambin tiene una vlvula de purga que se usa cuando hay

soluciones distintas, se purga la lnea con el nuevo disolvente para que entre a la
columna.
Automatizado, se llama as ya que es el mdulo de inyeccin automtica,
mediante un brazo robtico toma cada vial y los coloca en el puerto de inyeccin y
con una aguja toma la cantidad indicada para inyectarla al sistema, y se observa
en la pantalla una lnea roja que indica que la corrida ha empezado, y empieza a
tomar el tiempo de cada uno de los compuestos que se evidencian en forma de
pico, el tiempo que tarda en salir cada uno se denomina tiempo de retencin.
Mdulo de columnas. Conocido como fase fija, es el espacio destinado para las
columnas; sin embargo solo se puede usar una a la vez. Mediante una vlvula de
suicheo se indica la que se desea usar. La columna est conectada mediante
canales que vienen del mdulo anterior con la mezcla de disolventes que pasan a
travs de esta hacia el mdulo de detencin
Mdulo de deteccin. Se tienen dos tipos de lmpara la de luz ultravioleta y la
de luz visible, tiene la capacidad de detectar diferentes longitudes de onda que se
pueden medir al mismo tiempo mediante un arreglo de iodos, tiene 64 dientes que
detecta una onda diferente al mismo tiempo, pero esto depende del equipo.
Equipo de manejo de informacin. Es una computadora que tiene instalado el
software que maneja todo el sistema, est diseado para indicar las
caractersticas de la inyeccin dependiendo de la tcnica a seguir. Tambin se
establece el nombre de cada muestra, repeticin, volumen de inyeccin mediante
una tabla de secuencia y se puede dar seguimiento al proceso. Tambin hay
comandos para el tipo de inyeccin, control de la bomba, el flojo por minuto, stop
time, post time para estabilizar el sistema. Se puede programar para que el equipo
se pare en caso de que no tenga disolvente y as evitar que se queme la bomba.

El papel esencial de las bombas es impulsar a la fase mvil con presin y flujo
constante, el proceso de inyeccin de la muestra en la actualidad es
automtica, las columnas que se utilizan normalmente son de acero inoxidable y
los detectores su papel fundamentalmente es de indicar el momento de
aparicin de los diferentes componentes que constituyen la muestra, calificarlo
cuantitativamente como cualitativamente.
El uso de la cromatografa ha demostrado ser muy significativo para el estudio del
cido lipico, un tipo de cromatografa utilizado fue el HPLC-fase inversa (figura 4),
porque trabaja con las polaridades de los compuestos que se van analizar en el
futuro, ya que la fase mvil es ms polar que la fase estacionaria. La fase mvil
es agua con un componente menos polar como puede ser: agua/metanol,
agua/ACN.
El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza apolar, tal es el
caso del cido lipico que es un compuesto apolar, mientras que las molculas de
carcter polar efluyen ms rpidamente.
En este tipo de estudios, los proveedores recomiendan que se filtre y se
desgasifique todo componente antes de ser introducido a un sistema de HPLC,
esto con el propsito de evitar daos futuros.
En el anlisis de cido lipico todos los solventes, el agua de HPLC, junto con la
fase mvil deben ser pasados a travs de un filtro de 4 y desgasificados al bajo
vaco, antes de su uso.
Se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las
fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto
relativamente apolar y una fase estacionaria apolar. El efecto hidrofobico
disminuye con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil.
PROCESO DE DERIVATIZACIN
Derivatizacin pre-columna. Esta acoplada con cromatografa de fase reversa
en lugar de cromatografa de intercambio catinico, fue originalmente introducida
como respuesta al incremento en la demanda de mayor sensibilidad y mayor
velocidad de anlisis, las ventajas de la metodologa de la Derivatizacin
pre-columna incluyen simplicidad, velocidad y alta sensibilidad.
Por ello, si se requiere mxima sensibilidad de deteccin, un reactivo fluorescente
combinado con la Derivatizacin pre-columna es el mtodo ms indicado.

Como desventaja est la necesidad de garantizarse la completa reaccin del

reactivo derivatizante y la posibilidad de interferencia con la separacin por exceso
del reactivo, el medio de reaccin o la produccin de diferentes derivados de un
componente.
Adems la estabilidad del derivado puede ser un importante factor durante la
derivatizacin pre-columna, la demora entre la derivatizacin y la inyeccin llega a
ser fundamental para los resultados obtenidos.
La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus componentes
se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones qumicas o fsicas
con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna.

SOLVENTE UTILIZADO PARA EL ANLISIS DE CIDO LIPICO

El uso de agentes acarreadores es de suma importancia ya que es quien
transporta la muestra por todo el sistema de HPLC, en el anlisis de cido lipico
el solvente mas efectivo para su elusin es una mezcla de agua/ACN en
concentraciones de (80:20), por ser bajo en contenido de impurezas,
disolvindose junto con la muestra, sin degradar la fase estacionaria y es de baja
viscosidad lo que le permite reducir cadas de presin.