FERMENTACIN INDUSTRIAL

La Microbiologa es una Ciencia experimental que se ocupa del estudio de los

microorganismos y de sus interacciones con otros organismos y con el medio ambiente.
La fermentacin industrial es la aplicacin de los conocimientos de la microbiologa
respecto de todos aquellos aspectos de los microorganismos que tienen una aplicacin
industrial, tanto en la transformacin de productos empleados en la alimentacin como
en la produccin de sustancias tales como antibiticos, vitaminas, enzimas, as como en
la obtencin de masa microbiana (protena unicelular, vacunas, fertilizantes,
microbianos, biopesticidas).
Fruto del conocimiento de las capacidades que poseen los microorganismos ha
sido, y sigue siendo, su inmediato aprovechamiento para estos fines y, as, a los mtodos
tradicionales de produccin de sustancias por fermentacin se han unido recientemente
las tcnicas de manipulacin gentica de los mismos que han permitido obtener, de
forma masiva, nuevos productos de inters prctico que los microorganismos
normalmente no sintetizan tales como insulina, hormona de crecimiento humana e
interfern. La Biotecnologa es la aplicacin de los principios cientficos y tcnicos en el
procesamiento de los materiales por agentes biolgicos para obtener bienes y servicios.
Actualmente, se denomina Biotecnologa Molecular a la aplicacin de las tcnicas del
DNA recombinante en los seres vivos para la obtencin de productos de inters
industrial.

OBJETIVOS DE LA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

Desde un punto de vista industrial, lo que se pretende es que se obtenga el mayor
rendimiento posible de producto a partir del sustrato utilizado. Estos altos rendimientos
se obtienen en la sntesis qumica; en la biosntesis, la energa obtenida se utiliza no slo
para la obtencin del producto deseado sino que se aplica en todos los procesos
metablicos que van a permitir a ese ser vivo crecer. Cuanto ms complejo sea el ser
vivo, ms energa requerir para crecer y por lo tanto menor rendimiento obtendremos
del producto deseado. De ah que siempre que se puede se utilizan microorganismos. No
obstante existen una serie de productos que, en la actualidad, no pueden ser sintetizados
por los microorganismos; de ah que se recurra primero a las plantas y sino a los
animales. Por consiguiente, en la obtencin de productos industriales la primera va es la
sntesis qumica, si no funciona se recurre a los microorganismos, plantas y finalmente
animales.
Los productos de inters industrial producidos por los microorganismos se encuadran en
7 categoras principales:

1.- Las clulas microbianas propiamente dichas.

2.- Las macromolculas que sintetizan, por ejemplo enzimas.
3.- Los productos de su metabolismo, tanto primario (compuestos esenciales para su
crecimiento) como secundario (compuestos no esenciales para su desarrollo). En
trminos generales, los metabolitos tienen un peso molecular bastante bajo (menos de
1500 Daltons) si lo comparamos con el peso molecular de los enzimas que vara desde
10000 hasta varios millones de Daltons.
4.- Se acude tambin a las clulas microbianas para llevar a cabo conversiones
biolgicas a travs de las cuales un compuesto se transforma en otro estructuralmente
relacionado por intervencin de uno o varios enzimas aportados por las clulas.
5.- La obtencin de los derivados lcteos, cerveza, vino, pan, etc. constituyen alguno de
los procesos biotecnolgicos ms antiguos donde la intervencin de los
microorganismos es crucial.
6.- Ciertos microorganismos se hallan detrs de un proceso metalrgico que se remonta,
al parecer, hasta la poca romana: la lixiviacin bacteriana de menas de bajo contenido
para extraer de ellas metales. En la actualidad se utilizan microorganismos, Thiobacillus,
para extraer hierro, cobre y zinc de menas sin contaminar la atmsfera.
7.- La actividad microbiana se aplica tambin a la detoxificacin y degradacin de las
aguas residuales y desechos industriales. Las mareas negras y el vertido de lastres y
aguas de lavado de los petroleros son otros tantos problemas que plantean los residuos,
cuya solucin quizs est en manos de la Microbiologa ya que se han aislado muchos
microorganismos capaces de consumir componentes del petrleo.

DESARROLLO HISTORICO
Emprico
El arte de la fermentacin, definido tcnicamente en su sentido ms amplio como la
transformacin qumica de compuestos orgnicos con la ayuda de enzimas (sobre todo
los producidos por microorganismos), es muy antiguo. La capacidad de las levaduras
para producir alcohol en forma de cerveza la conocan ya los Sumerios y Babilonios
antes del ao 6000 a.c. Ms tarde, aproximadamente hacia el ao 4000 a.c., los Egipcios
descubrieron que el CO2 generado por la accin de las levaduras (Saccharomyces) poda
fermentar el pan. Referencias al vino, otro antiguo producto de fermentacin, se hallan
en el Gnesis, donde consta que No consuma algo ms de lo debido.
Hacia el siglo XIV d.c., la destilacin de bebidas alcohlicas a partir de grano
fermentado, prctica originaria de China, era comn en muchas zonas del mundo
(Francia-Brandy; Escocia-Whisky). Los microorganismos proporcionaron alimentos y
bebidas durante ms de 8000 aos, sin que se tuviera nocin de su existencia.
Leeuwenhoek, en el siglo XVIII, fu la primera persona que los describi en detalle al
observar, a travs de su propio microscopio simple, el sedimento de vinos. Sin embargo,

estas observaciones no condujeron a ninguna investigacin acerca de las posibles

actividades de los microorganismos descritos.
El papel de las levaduras como agentes fermentadores no fu reconocido hasta mediados
del siglo XIX por Pasteur que descubri que las levaduras transforman el azcar en
alcohol en ausencia de aire. A este proceso anaerbico se le conoce como fermentacin
alcohlica.
A finales del siglo XIX y gracias al desarrollo de las tcnicas de cultivos puros, se aisla
y distribuye la primera cepa de levadura vnica, la Steinberg 92, para su uso comercial
en la produccin del vino. Anteriormente, en 1883, Emil Christian Hansen obtuvo el
primer cultivo puro de levadura cervecera que denomin Saccharomyces carlsbergensis.
Con estos trabajos y los de Pasteur, la fermentacin pasa de ser un arte (resultados
imprevisibles) a ser una ciencia (resultados previsibles).

Cientfico
Los progresos realizados en investigacin bioqumica bsica a partir del descubrimiento
de los enzimas por Buchner en 1897 fu considerable, pero no comenzaron a aplicarse
en la fermentacin industrial hasta la primera guerra mundial (1914).
En el lado alemn, la obtencin de glicerol para la fabricacin de explosivos se convirti
en una necesidad urgente. El bloqueo martimo britnico cort la importacin de aceites
vegetales, la materia prima tradicional en la produccin de glicerol. Pero algunos aos
antes, el bioqumico alemn Carl Neuberg haba vuelto a considerar cierta observacin
de Pasteur: en la fermentacin alcohlica se solan originar pequeas cantidades de
glicerol (fermentacin gliceropirvica -----> lgrima del vino). Avanzando en su estudio,
Neuberg descubri que la adicin de bisulfito sdico al tanque de fermentacin
favoreca la produccin de glicerol a expensas de la de alcohol. Este descubrimiento fu
desarrollado rpidamente por los alemanes en una fermentacin industrial que produca
1000 toneladas de glicerol al mes.
Los ingleses, por su parte, andaban escasos de acetona para la fabricacin de
municiones. Dificultad de la que sali al paso un qumico de origen ruso, Chain
Weizmann. Weizmann desarroll la fermentacin butanol-acetona que depende de la
bacteria anaerobia Clostridium acetobutylicum. El descubrimiento de Weizmann jug un
papel determinante en el desarrollo de la guerra. Al finalizar sta, rehus todos los
honores que le propuso el gobierno Britnico. Sin embargo, utiliz su influencia para
que el gobierno Britnico ayudar a establecer el estado Judio en Palestina. En 1949,
Weizmann fu elegido el primer presidente de Israel.
El proceso alemn de obtencin de glicerol desapareci de la escena al final del
conflicto. Destino que no sufri el proceso butanol-acetona; ste persisti como fuente
de acetona durante muchos aos, hasta que al principio de los 50 lo desplazaron otros
procesos que se fundamentan en el petrleo.
La produccin de cido ctrico por microorganismos tambin tiene su origen en la
primera guerra mundial. Hasta entonces el cido ctrico se extraa de los ctricos, siendo

Italia el mayor productor. Cuando los hombres fueron llamados a filas, los cultivos se
desatendieron y al final del conflicto la industria estaba en ruina aumentando el precio
del cido ctrico. Todo esto favoreci la introduccin en 1923 de un proceso microbiano
para su obtencin. El organismo usado para la obtencin de cido ctrico, Aspergillus
niger, es un aerobio obligado, por lo que debe cultivarse en presencia de oxgeno, justo
lo contrario de Clostridium acetobutylicum. Para ello se desarrollaron los cultivos en
superficie y as poder mantener al microorganismo en contacto con el aire.
En 1928, Alexander Fleming observ que el hongo Penicillium notatum mataba sus
cultivos de la bacteria Staphylococcus aureus. Tras cultivar el hongo en medio lquido y
separar el lquido de las clulas, encontr que el lquido celular poda inhibir el
crecimiento de muchas especies bacterianas. Llam al ingrediente activo del lquido con
el nombre de penicilina, aunque no continu los estudios debido a que no posea
conocimientos qumicos (era mdico) para aislarla. En la dcada de 1930, cierto nmero
de qumicos britnicos intentaron aislar la penicilina. Pero fracasaron debido a su
inestabilidad. Por ltimo, un estudio comenzado en 1939 en la Universidad de Oxford
por Howard Florey, Ernst Chain y colaboradores condujo a la preparacin con xito de
una forma estable de penicilina y a la demostracin de su impresionante actividad
antibacteriana, primero en cobayas y despus en el hombre. El primer ensayo clnico con
una preparacin de penicilina se llev a cabo el 12 de Febrero de 1941. El paciente era
un polica de Oxford que se estaba muriendo por una infeccin con Staphylococcus
(septicemia). Al administrarle penicilina se observ un mejoramiento espectacular, pero
5 das despus, cuando se les acab la penicilina, la infeccin volvi a emerger y el
paciente muri. Este ensayo clnico fall debido a que no se poda obtener una
produccin a gran escala de penicilina. En este punto (1940-1941), los britnicos estaban
inmersos en la segunda guerra mundial. Florey y su colega Heatley consideraron que las
condiciones de una Inglaterra en guerra no eran las adecuadas para el desarrollo de un
proceso industrial de produccin del antibitico. Y as fu como se trasladaron a los
Estados Unidos, en 1941, en busca de apoyo. Con la ayuda del Departamento de
Agricultura y de varias compaas farmacuticas y Universidades se hizo posible la
produccin a gran escala de Penicilina un ao despus.
Al igual que Aspergillus niger, microorganismo utilizado en la produccin de cido
ctrico, Penicillium notatum es aerobio obligado y por lo tanto deba ser crecido en
cultivos en superficie, lo que favoreca la contaminacin y por lo tanto disminua el
rendimiento de penicilina. La necesidad de utilizar tcnicas aspticas llev al desarrollo
de los fermentadores con agitacin que actualmente son los que ms se utilizan para
cultivar a gran escala los microorganismos. Las condiciones aspticas se conseguan
esterilizando todo el equipo con vapor antes de la inoculacin y manteniendo la presin
del interior del fermentador superior a la atmosfrica. El oxgeno se introduca a travs
de aire estril y se distribua en el medio por agitacin.
Otra contribucin al desarrollo de la biotecnologa moderna que se realiz dentro del
programa de la penicilina fu el desarrollo de las tcnicas de seleccin de cepas. El
Penicillium notatum original produca 2 mg de penicilina por litro de cultivo. El

muestreo de diferentes Penicillium llev a la identificacin de una cepa superproductora

de Penicilina, Penicillium chrysogenum. Para incrementar el rendimiento de esta cepa,
se someti posteriormente y de una forma sistemtica a una variedad de agentes
mutgenos, de tal manera que los supervivientes superproductores se seleccionaban y se
sometan a otra ronda de mutaciones. Combinando las mejoras en la fermentacin con el
uso de mutantes, hoy en da el rendimiento se ha incrementado hasta los 20 g/L.
El advenimiento de la penicilina seal el comienzo de la era de los antibiticos.
Siguieron pronto los descubrimientos de Selman Waksman quien aisl Streptomyces
gryseus que produce estreptomicina. A partir de entonces se hizo prctica estndar el
muestreo de un gran nmero de aislamientos del suelo, consiguindose obtener
numerosos antibiticos nuevos a partir fundamentalmente de un grupo de bacterias
denominadas Actinomicetos.

Ingeniera Gentica
Despus de la introduccin de la fermentacin de la penicilina no hubo prcticamente
ningn desarrollo significativo en la microbiologa industrial durante 30 aos. La
mayora de las compaas se dedicaban a la bsqueda de microorganismos que
produjeran metabolitos o actividades deseadas, para posteriormente, realizar una
seleccin de cepas superproductoras y desarrollar la fermentacin.
Al final de los 60 se gener cierto revuelo ante las expectativas de utilizar las clulas
microbianas (biomasa) como una fuente de protenas, lo que se denomina Single Cell
Protein (SCP). Sin embargo, la introduccin de la SCP no tuvo el xito esperado debido
a que coincidi con un rpido incremento del precio del petrleo y con el desarrollo de
variedades de cultivos con alto rendimiento con lo que los pases desarrollados no
necesitaban SCP y los pases subdesarrollados no podan construir plantas industriales
para obtener SCP. El desarrollo en Biotecnologa, como en otras reas, est sujeto a
presiones polticas y econmicas (en el mundo de los negocios existe poco altruismo).
En 1973 Stanley Cohen, Herbert Boyer y sus colaboradores desarrollaron la metodologa
necesaria para transferir la informacin gentica (genes) de un organismo a otro. El
desarrollo de la tecnologa del DNA recombinante ha cambiado la naturaleza de la
biotecnologa ya que la ingeniera gentica provee la capacidad para crear (ms que
aislar) cepas superproductoras.
El 15 de Octubre de 1980, a los 20 minutos de comenzar la sesin en la bolsa de Nueva
York, las acciones de la compaa Genentech subieron de 35 $ a 89 $. Fu, hasta la
fecha, la mayor subida de acciones en la historia de la bolsa de Nueva York. Era la
primera vez que esta compaa cotizaba en bolsa. Cientficos de esta compaa, 2 aos
antes (1978), haban conseguido producir insulina humana en la bacteria Escherichia
coli con lo que poda ser usada por aquellos diabticos que eran alrgicos a la insulina
disponible hasta la fecha (Insulina de cerdo).

FUTURO
Las perspectivas futuras pueden llevar a los siguientes beneficios:
Diagnstico, prevencin o cura de enfermedades infecciosas y genticas.
Aumento del rendimiento de cultivos creando plantas resistentes a insectos,
hongos y virus.
Desarrollo de microorganismos que producirn compuestos qumicos, polmeros,
aminocidos, enzimas y varios aditivos de alimentos.
Facilitar la eliminacin de contaminantes y residuos txicos del medio ambiente.
Aunque es importante enfatizar los aspectos positivos de los nuevos avances, tambin es
necesario considerar las consecuencias sociales que pueden derivarse del uso de esta
tecnologa:
Puede ser algn organismo modificado genticamente perjudicial para otros
organismos o el medio ambiente?
Puede el desarrollo y uso de los organismos modificados genticamente reducir
la diversidad gentica natural?
Deben modificarse genticamente a los hombres?
Los nuevos diagnsticos invadirn la privacidad de las personas?
Deben tener propietario los organismos creados por ingeniera gentica?

CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS

Existen millones de organismos vivos en la Naturaleza, siendo algo caracterstico del
hombre su afn por ordenar esa gran variedad de organismos. Con esa necesidad de
ordenamiento surge la Taxonoma como la ciencia de la clasificacin, nomenclatura e
identificacin. La Clasificacin es algo creado por el hombre. Consecuencia de esta
artificialidad es la controversia que existe desde mediados del siglo XVIII sobre las
divisiones que se establecen entre los seres vivos. Lo que comenz con Linneo siendo
una sencilla divisin de los seres vivos, los reinos Animalia y Plantae, ha ido hacindose
cada vez ms complejo al pasar por distintas modificaciones hasta llegar a nuestros das
con la propuesta de los tres dominios y varios reinos y con la sospecha de que no ser la
ltima, ya que los conocimientos de que se dispone son cada vez mayores, as como las
posibilidades de aumentar esos conocimientos.
Carolus Linnaeus, a mediados del siglo XVIII, orden a todos los seres vivos en dos
Reinos bien definidos: el Reino Animalia que agrupaba a los animales, organismos

mviles y hetertrofos; y el Reino Plantae que inclua a los vegetales, individuos

inmviles, auttrofos y fotosintticos. Segn el esquema de los dos reinos, los protozoos
se incluyeron en el Reino Animalia y el resto de microorganismos en el Reino Plantae.
Sin embargo, esta clasificacin encontr pronto dificultades ya que existan numerosos
microorganismos que posean caractersticas intermedias que no permitan su clara
adscripcin a uno de los dos reinos preestablecidos. En 1866 Ernst Haeckel propuso un
tercer reino, el Reino Protista, para reordenar todos los seres vivos con organizacin
biolgica sencilla ya fueran unicelulares, cenocticos o multicelulares, pero todos ellos
carentes de especializacin tisular y en los que cada individuo era capaz de realizar las
funciones propias y especficas que los tejidos de organismos superiores, animales y
plantas, tenan encomendadas. Segn Haeckel, el Reino Protista incluira bacterias,
algas, hongos y protozoos. Sin embargo, la validez del Reino Protista fu cuestionada a
medida que se obtena ms informacin acerca de la estructura interna de los
microorganismos debido a los avances en microscopa electrnica.
En 1937 Chatton dividi el mundo de los seres vivos en dos grandes grupos segn
tuvieran o no membrana nuclear. Aparecieron as los trminos eucariota para definir
organismos con clulas nucleadas que van desde los protozoos, algas y hongos hasta los
animales y plantas; y procariota para agrupar clulas sin membrana nuclear, como es el
caso de las bacterias. La dicotoma eucariota-procariota fu utilizada por los taxnomos
como una caracterstica filogentica de primera magnitud.
Aparecieron de esta forma los esquemas de cinco reinos en los que los microorganismos
procariotas constituyeron un grupo taxonmico filogenticamente independiente. El ms
aceptado de todos ellos fu el de Whittaker, que en 1969 propuso un sistema de
clasificacin de los seres vivos basado en los dos niveles de organizacin celular y las
tres formas principales de nutricin (fotosntesis, absorcin e ingestin) que dieron lugar
a los Reinos Monera (procariotas), Protista (eucariotas unicelulares), Plantae (eucariotas
fotosintticos), Animalia (eucariotas fagotrofos) y Fungi (eucariotas osmotrofos). En el
esquema de Whittaker los microorganismos quedaron includos en los Reinos Monera
(bacterias), Protista (protozoos y microalgas) y Fungi (hongos filamentosos y levaduras).
Hasta este momento se utilizaron caractersticas morfolgicas y fisiolgicas hasta que el
desarrollo de la biologa molecular permiti utilizar los constituyentes moleculares como
nuevos criterios clasificatorios.
As, en 1987, Woese utilizando el 16S rRNA como reloj molecular comprob que, a
travs de la secuenciacin de esta molcula, los procariotas quedaban divididos en dos
grupos. El primero de ellos incluye las bacterias ms comunes, aisladas en su mayora
del cuerpo, suelo y agua denominndose eubacterias. El segundo grupo incluye las
bacterias que producen metano (metangenas), ciertas bacterias del azufre que pueden
crecer en ambientes muy cidos y calientes (termfilas extremas) y bacterias que viven
en ambientes salinos (halobacterias). Estas bacterias se denominaron arqueobacterias.
En 1990 Carl Woese propuso un nuevo taxon superior a Reino que denomin Dominio
(Dominio ----> Reino ----> Divisin ----> Clase ----> Orden ----> Familia ----> Gnero ---> Especie). Todos los seres vivos se agruparan en 3 dominios: Bacteria, Archaea y

Eukarya. De los cuales, dos son exclusivamente microbianos y estn compuestos

nicamente por clulas procariotas pertenecientes al Reino Monera (Bacteria y Archaea)
y el tercero (Eukarya), formado por eucariotas, incluira entre otros los Reinos Protista,
Plantae, Animalia y Fungi.

CARACTERISTICAS
INDUSTRIALES

DE

LOS

MICROORGANISMOS

Existen una serie de caractersticas que comparten todos los microorganismos y que
suponen ciertas ventajas para su uso en la industria. la ms fundamental, el pequeo
tamao de la clula microbiana y su correspondiente alta relacin de superficie a
volumen. Esto facilita el rpido transporte de nutrientes al interior de la clula y permite,
por consiguiente, una elevada tasa metablica. As, la tasa de produccin de protena en
las levaduras es varios rdenes de magnitud superior que en la planta de soja, que, a su
vez, es 10 veces ms alta que en el ganado. Esta velocidad de biosntesis microbiana
extremadamente alta permite que algunos microorganismos se reproduzcan en tan solo
20 minutos (Escherichia coli). Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son
muy variados. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre
el punto de congelacin del agua y el punto de ebullicin, en agua salada y dulce, en
presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen
una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes: en forma de esporas
permanecen inactivos durante aos hasta que el medio ambiente, ms favorable, permita
el desarrollo de las clulas. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer
una extensa gama de reacciones metablicas y adaptarse as a muchas fuentes de
nutricin. Versatilidad que hace posible el que las fermentaciones industriales se basen
en nutrientes baratos.
Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de inters; debe estar
disponible en cultivo puro; debe ser genticamente estable y debe crecer en cultivos a
gran escala. Otra caracterstica importante es que el microorganismo industrial crezca
rpidamente y produzca el producto deseado en un corto perodo de tiempo. El
microorganismo debe tambin crecer en un relativamente barato medio de cultivo
disponible en grandes cantidades. Adems, un microorganismo industrial no debe ser
patgeno para el hombre o para los animales o plantas. Otro requisito importante es la
facilidad de separar las clulas microbianas del medio de cultivo; la centrifugacin es
dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales ms favorables para
esto son aquellos de mayor tamao celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias
filamentosas) ya que estas clulas sedimentan ms fcilmente que las bacterias
unicelulares e incluso son ms fciles de filtrar.

DIFERENTES
INDUSTRIALES

TIPOS

DE

MICROORGANISMOS

Los microorganismos que sintetizan productos tiles para el hombre representan, como
mximo, unos pocos centenares de especies de entre las ms de 100000 descritas en la
Naturaleza. Los pocos que se han encontrado con utilidad industrial son apreciados por
elaborar alguna sustancia que no se puede obtener de manera fcil o barata por otros
mtodos.

1.- Levaduras
Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de aos para la fabricacin de pan y
bebidas alcohlicas. La levadura que sin duda fu la primera y an hoy en da sigue
siendo la ms utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que se emplean
diferentes cepas para la fabricacin de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales.
Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en
pequea escala para la produccin de alcohol a partir del suero de la leche. Yarrowia
lipolytica es una fuente industrial de cido ctrico. Trichosporum cutaneum desempea
un importante papel en los sistemas de digestin aerbica de aguas residuales debido a
su enorme capacidad de oxidacin de compuestos orgnicos, includos algunos que son
txicos para otras levaduras y hongos, como los derivados fenlicos.

2.- Hongos filamentosos

Los hongos tienen una gran importancia econmica, no tan slo por su utilidad, sino
tambin por el dao que pueden causar. Los hongos son responsables de la degradacin
de gran parte de la materia orgnica de la Tierra, una actividad enormemente beneficiosa
ya que permite el reciclaje de la materia viva. Por otro lado, los hongos causan gran
cantidad de enfermedades en plantas y animales y pueden destruir alimentos y
materiales de los que depende el hombre.
Los efectos perjudiciales de los hongos estn contrarrestados por su utilizacin
industrial. Los hongos son la base de muchas fermentaciones como la combinacin de
soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso, shoyu y
tempeh. Los hongos son tambin la fuente de muchos enzimas comerciales (amilasas,
proteasas, pectinasas), cidos orgnicos (ctrico, lctico), antibiticos (penicilina),
quesos especiales (Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las setas.

3.- Bacterias
Entre las especies bacterianas de inters industrial estn las bacterias del cido actico,
Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en cido actico. El gnero
Bacillus es productor de antibiticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas e
insecticidas. Del gnero Clostridium cabe destacar Clostridium acetobutylicum que
puede fermentar los azcares originando acetona y butanol. Las bacterias del cido

lctico incluyen, entre otras, las especies de los gneros Streptococcus y Lactobacillus
que producen yogur. Corynebacterium glutamicum es una importante fuente industrial
de lisina. El olor caracterstico a tierra mojada se debe a compuestos voltiles
(geosmina) producidos por Streptomyces aunque su principal importancia radica en la
produccin de antibiticos como anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina,
tetraciclina, etc.

METABOLITOS PRIMARIOS DE INTERES INDUSTRIAL

Los metabolitos primarios son molculas de bajo peso molecular que intervienen, bien
como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas anablicas y catablicas.
Los ms importantes desde el punto de vista industrial son los aminocidos, nucletidos,
vitaminas, cidos orgnicos y alcoholes.
Alcoholes: etanol
Aminocidos: cido glutmico, lisina, treonina
Nucletidos: cido 5' guanlico, cido 5' inosnico
Acidos orgnicos: cido actico, cido propinico, cido succnico, cido
fumrico, cido lctico, cido mlico, cido tartrico, cido ctrico, cido
glucnico
Polioles: glicerol, manitol
Polisacridos: xantano
Azcares: fructosa, sorbosa
Vitaminas: riboflavina (B2), cianocobalamina (B12)
La superproduccin de metabolitos primarios es evitada por la mayora de los
microorganismos, puesto que son procesos que consumen gran cantidad de energa, lo
cual hace que sean menos competitivos en los ambientes naturales. Sin embargo, existen
en la Naturaleza microorganismos que tienen alterados sus sistemas regulatorios y stos
son precisamente los que a lo largo del proceso de bsqueda son seleccionados para su
utilizacin en microbiologa industrial. Estos cultivos posteriormente se someten a un
profundo estudio mediante el cual, alterando las condiciones del medio y/o por
modificaciones genticas, incrementamos la superproduccin del producto que nos
interesa. Mediante estas alteraciones se ha conseguido, por ejemplo, que la bacteria
Pseudomonas denitrificans produzca 50.000 veces ms vitamina B12. Las
manipulaciones ms frecuentes son la alteracin de la regulacin por retroalimentacin y
la alteracin de la permeabilidad.

ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION

La regulacin por retroalimentacin es el control que utilizan los microorganismos para
evitar la superproduccin de aminocidos y nucletidos. Para eliminar este control se
han empleado dos tipos de manipulaciones: alteracin de la acumulacin de productos
finales y obtencin de mutantes resistentes a la regulacin por retroalimentacin.
1.- Alteracin de la acumulacin de productos finales:
A. Evitar la acumulacin de productos finales.
En una ruta metablica sencilla (no ramificada) la limitacin de la capacidad de la clula
para acumular intracelularmente productos finales inhibidores o represores, se utiliza
generalmente para la superproduccin de algn intermediario de esta ruta metablica. En
el siguiente esquema se representa este principio:
Si nosotros deseamos obtener una superproduccin del producto intermediario C en una
ruta metablica sencilla donde el producto final E por retroalimentacin inhibe al
enzima a y reprime a los enzimas a y b, lo primero que se hace es obtener un mutante
auxtrofo que le falte el enzima c. Al no poder sintetizar el producto E, este mutante
requiere para su crecimiento que se aada en el medio E. Si se aaden bajos niveles de
E, los necesarios para que el microorganismo crezca, ste microorganismo no podr
acumular concentraciones de E que inhiban o repriman a los enzimas a y b con lo que
ser posible obtener una gran acumulacin de C.
Mediante este tipo de manipulacin se ha conseguido por ejemplo, que un mutante de
Corynebacterium glutamicum auxtrofo en Arginina produzca 26 gramos/litro de LOrnitina.
B. Acumulacin de productos finales.
Se utiliza en rutas metablicas ramificadas. Consideremos una ruta metablica
ramificada que conduce a dos productos finales, A y B. Con frecuencia, si conseguimos
disminuir la concentracin de B, el producto A se acumulara.
El ejemplo ms importante, con inters comercial, de la utilizacin de esta estrategia es
la superproduccin de lisina. Este aminocido se utiliza como aditivo nutritivo, puesto
que la mayora de las protenas de cereales son deficientes en este aminocido. Pertenece
a la familia del aspartato y se produce en la mayora de las bacterias en una ruta
metablica ramificada que produce adems metionina, treonina e isoleucina.
En Escherichia coli, el primer paso de esta ruta est regido por tres aspartato quinasas,
cada una de las cuales est regulada por un producto final diferente y, adems, cada
producto final regula el primer enzima despus de cada ramificacin.
Sin embargo, en los microorganismos utilizados en la fermentacin para la produccin
de lisina (Corynebacterium glutamicum) existe una nica aspartato quinasa regulada por
un mecanismo concertado de retroalimentacin por la treonina y lisina. As mismo,
tampoco poseen regulacin en la ramificacin.

Mediante la eliminacin gentica del enzima homoserina deshidrogenasa, se obtiene un

mutante que no puede crecer salvo que se aada en el medio metionina y treonina.
Mientras que los niveles de treonina que se aadan sean bajos, pero suficientes para el
crecimiento del microorganismo, no se producir una inhibicin por retroalimentacin
de la aspartato quinasa, con lo que estos microorganismos son capaces de producir 50
gramos de L-lisina por litro.

METABOLITOS SECUNDARIOS DE INTERES INDUSTRIAL

Los metabolitos secundarios son molculas sintetizadas por determinados
microorganismos, normalmente en una fase tarda de su ciclo de crecimiento, cuyas
caractersticas son:
(i)

No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce.

En estado natural, sus funciones se hallan ordenadas a la supervivencia de
la especie, pero cuando los microorganismos que los producen se
desarrollan en cultivo puro los metabolitos secundarios no desempean esa
misin.

(ii)

Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados

qumicamente entre s. Por ejemplo, una nica cepa de una especie del
gnero Streptomyces produce 32 antraciclinas diferentes.

(iii)

Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de

organismos.

(iv)

La produccin puede perderse fcilmente por mutacin espontnea

(degeneracin de la raza), por lo que son muy importantes las tcnicas de
conservacin de estos microorganismos.

De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentacin, los ms importantes

para la salud humana son los metabolitos secundarios. Donde se incluyen, adems de los
antibiticos, ciertas toxinas (micotoxinas), alcaloides (cido lisrgico), factores de
crecimiento vegetal (giberelinas) y pigmentos.
Los metabolitos secundarios mejor conocidos son los antibiticos, de los que se han
descubierto ms de 5000, cifra que aumenta a razn de una media aproximada de 300
por ao, aunque la mayora carecen de utilidad pues son txicos para los organismos
vivos. Aproximadamente el 75% de los antibiticos conocidos son producidos por
actinomicetos. Algunas especies son excepcionales productores de antibiticos, por
ejemplo Streptomyces gryseus produce al menos 40 antibiticos diferentes.

INCREMENTO DE LA PRODUCCION DE METABOLITOS

SECUNDARIOS
La mayora de los controles descritos en este captulo se eliminan mediante
manipulacin ambiental o mediante la obtencin de mutantes mal regulados.

1.- Manipulacin ambiental

Catabolito: eliminacin de la glucosa del medio.
Induccin: adicin de manano al medio.
Carga energtica: disminucin de fosfato en el medio.
Precursores: adicin de precursores al medio.

FERMENTADORES INDUSTRIALES
El objetivo de la biotecnologa es obtener productos metablicos tiles a partir de
materiales biolgicos. La biotecnologa comprende dos fases distintas: la fermentacin
y la recuperacin de los productos. Para el cultivo de microorganismos en
condiciones ptimas, as como para la produccin, por parte de los microorganismos, de
los metabolitos o los enzimas deseados, deben ser desarrollados procedimientos de
fermentacin como son el desarrollo de cepas mediante manipulacin gentica y/o la
regulacin del metabolismo mediante la optimizacin del medio de cultivo as como el
control adecuado de los factores fsico-qumicos que afectan al rendimiento de las
fermentaciones industriales (02, T, pH, etc.). La recuperacin del producto o
"procesamiento posterior" (del ingls downstream processing) conlleva la extraccin y
purificacin de los productos biolgicos. La recuperacin en los procesos bioqumicos
difiere de la recuperacin qumica, principalmente, en que los materiales biolgicos son
frecuentemente mucho ms lbiles. Por lo tanto, la produccin de productos metablicos
tiles a partir de microorganismos conlleva una ntima relacin entre la Ciencia y la
Tecnologa. por un lado se deben desarrollar los microorganismos de inters industrial y
por otro se debe asegurar que estos microorganismos puedan crecer en gran cantidad
bajo aquellas condiciones que originen el mejor rendimiento posible del producto.
A simple vista uno puede pensar que aquellas condiciones que se han encontrado ser las
ms efectivas a pequea escala deberan ser igual de efectivas a larga escala y que para
conseguir este objetivo nicamente es necesario usar un recipiente mayor con el

correspondiente incremento de volumen del medio. Nada ms lejos de la realidad. Por

ejemplo, se puede conseguir un buen crecimiento de un microorganismo aerobio en un
matraz de 200 mL mediante agitacin en un incubador usando un rotor de 300 w. Si
nosotros simplemente ampliamos este sistema, un nico fermentador de 10.000 litros
requerira un agitador con un motor de 15 megawatios. Dicho motor debera ser tan
grande como una casa y el calor generado durante la agitacin hervira a los
microorganismos.
En lneas generales, un proceso tpico de fermentacin comienza con la formulacin y
esterilizacin del medio de cultivo as como la esterilizacin del equipamiento. Las
clulas se crecen primero en un cultivo de mantenimiento (5 a 10 mL), posteriormente
en un matraz (200 a 1.000 mL) y de ah en un prefermentador (10 a 100 L) para
finalmente inocular el fermentador de produccin (1.000 a 100.000 L). Una vez que la
fermentacin se ha completado, las clulas se separan del cultivo lquido. Si el producto
es intracelular, se rompen las clulas, se eliminan los restos celulares y se recupera el
producto del fluido libre de restos celulares. Si el producto es extracelular, se purifica a
partir del sobrenadante libre de clulas. Hasta ahora hemos visto el desarrollo de las
cepas as como el diseo de los medios de cultivo. A continuacin vamos a desarrollar
los aspectos tecnolgicos de las fermentaciones.

DISEO Y FUNCIONAMIENTO DEL FERMENTADOR

El estudio detallado del diseo de un fermentador cae fuera del objetivo de esta
asignatura que se concentra en los principios biolgicos de la biotecnologa. Sin
embargo, como la tecnologa de los procesos fermentativos es una amalgama de tcnicas
biolgicas e ingeniera qumica, se hace necesario proporcionar un breve resumen de los
tipos de fermentadores disponibles y de sus principales caractersticas. A continuacin
paso a describir una lista de 13 puntos considerados como los criterios ms importantes
para el diseo de un fermentador:
1.- El tanque debe disearse para que funcione aspticamente durante numerosos
das, as como para las operaciones de ms larga duracin.
2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireacin y agitacin para cubrir
las necesidades metablicas de los microorganismos.
3.- El consumo de energa debe ser tan bajo como sea posible.
4.- Debe tener un sistema para el control del pH.
5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras.
6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura.

7.- Las prdidas por evaporacin no deben ser excesivas.

8.- El diseo del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el
funcionamiento, recoleccin, limpieza y mantenimiento sean mnimas.
9.- El tanque debe ser verstil para la aplicacin de diversas modalidades de
procesos.
10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea
posible, soldaduras.
11.- La geometra del fermentador debe ser similar a otros tanques ms pequeos
o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos a
diferentes escalas.
12.- deben emplearse los materiales ms baratos que proporcionen resultados
satisfactorios.
13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador.
El mantenimiento de un ambiente asptico y unas condiciones aerbicas son,
probablemente, los dos puntos de mayor relevancia que hay que considerar. Los
fermentadores ms ampliamente utilizados a nivel industrial estn provistos de
mecanismos de agitacin, dispersin y aireacin as como de sistemas para el control de
la temperatura, pH y formacin de espuma.

TIPOS DE FERMENTACIONES
1.- Fermentacin discontinua
Una fermentacin discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema
cerrado". Al inicio de la operacin se aade la solucin esterilizada de nutrientes y se
inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubacin en
condiciones ptimas de fermentacin. A lo largo de toda la fermentacin no se aade
nada, excepto oxgeno (en forma de aire), un agente antiespumante y cidos o bases para
controlar el pH. La composicin del medio de cultivo, la concentracin de la biomasa y
la concentracin de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo
de las clulas observndose las cuatro fases tpicas de crecimiento: fase de latencia, fase
logartmica, fase estacionaria y fase de muerte.
En los procesos comerciales la fermentacin frecuentemente se interrumpe al final de la
fase logartmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte
(metabolitos secundarios).

2.- Fermentacin alimentada (fed-batch)

En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos los
sustratos se aaden al principio de la fermentacin. Una mejora del proceso cerrado
discontinuo es la fermentacin alimentada que se utiliza en la produccin de sustancias
como la penicilina. En los procesos alimentados, los sustratos se aaden
escalonadamente a medida que progresa la fermentacin. La formacin de muchos
metabolitos secundarios est sometida a represin catablica (efecto glucosa). Por esta
razn en el mtodo alimentado los elementos crticos de la solucin de nutrientes se
aaden en pequeas concentraciones al principio de la fermentacin y continuan
aadindose a pequeas dosis durante la fase de produccin.

3.- Fermentacin continua

En la fermentacin continua se establece un sistema abierto. La solucin nutritiva estril
se aade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solucin utilizada
de los nutrientes, con los microorganismos, se saca simultneamente del sistema.
El objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones es minimizar costes e
incrementar los rendimientos. Este objetivo puede alcanzarse si se desarrolla el tipo de
fermentacin ms adecuado para cada paso en particular. Si bien los procesos de
fermentacin continua no se utilizan de forma general en la industria, debido
fundamentalmente al mayor nivel de experiencia que se tiene en el crecimiento de
clulas en fermentacin discontinua, el coste de produccin de biomasa mediante cultivo
continuo es potencialmente inferior al de cultivo discontinuo. De este modo se han
instalado plantas de produccin para la produccin continua de protena de origen
unicelular a partir de n-alcanos, compuestos C1 y almidones.
Aunque muchas fermentaciones para la produccin de metabolitos funcionan bien como
procesos continuos, slo unos pocos procesos han resultado tiles para la aplicacin
prctica por varias razones:
a.- Muchos mtodos de laboratorio operan continuamente durante solamente 20 a 200
horas; para que sea de utilidad industrial el sistema debe ser estable durante al menos
500 a 1.000 horas.
b.- Mantener las condiciones estriles a escala industrial a lo largo de un largo perodo
de tiempo es difcil.
c.- La composicin de los sustratos debe ser constante a fin de obtener una produccin
mxima. La composicin de las soluciones de nutrientes industriales son variables
(lquido de maceracin del maiz, peptona, etc.) lo que puede originar cambios en la
fisiologa de la clula y disminuir la productividad.
d.- Cuando se utilizan cepas de alto rendimiento se producen mutantes degenerados, los
cuales pueden crecer en cultivo continuo ms deprisa que las cepas de produccin por lo

que el rendimiento disminuye con el tiempo ya que cada vez son menos clulas las que
sintetizan el producto de inters.

4.- Reactores de enzimas o clulas inmovilizadas

Consiste en pasar el medio fresco a travs de un biorreactor en el que por diversas
tcnicas hemos inmovilizado clulas (o enzimas). En el biorreactor se producen las
transformaciones bioqumicas que deseamos y recuperamos el producto transformado
tras su paso por la columna. Con este sistema se eliminan los problemas de desequilibrio
(estabilidad) del sistema continuo clsico y adems el producto resultante est libre de
clulas. Presenta el inconveniente de que no todos los microorganismos pueden
inmovilizarse.
Existen tres mtodos de inmovilizar las clulas:
a.- Asociacin fsica mediante resinas de intercambio inico. La unin se puede
romper fcilmente.
b.- Unin covalente mediante glutaraldehido, tolueno, di-isocianato, iodo acetil
celulosa. Unin fuerte aunque inactivacin.
c.- Atrapamiento mediante colgeno, gelatina, agar, alginatos, poliacrilamida,
poliestireno. Es el mtodo ms utilizado en inmovilizacin de clulas; para ello se
mezclan las clulas con el polisacrido lquido y posteriormente se deja enfriar
para que solidifique. Finalmente se fragmenta o granula y se empaqueta en una
columna.

FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE AFECTAN AL

RENDIMIENTO DE LAS FERMENTACIONES INDUSTRIALES

1.- Oxgeno
Uno de los factores ms crticos en la operacin de fermentacin a gran escala es el
suministro de un intercambio de gases adecuado. El oxgeno es el sustrato gaseoso ms
importante para el metabolismo microbiano y el anhdrido carbnico es el producto
metablico ms importante. El oxgeno no es un gas muy soluble ya que una solucin
saturada de oxgeno contiene aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua. debido a la
influencia de los ingredientes del cultivo, el contenido mximo de oxgeno realmente es
ms bajo de lo que debera ser en agua pura. El suministro se logra pulverizando aire en
el fermentador durante el proceso.

La ley de Henry describe la solubilidad del oxgeno en soluciones de nutrientes en

relacin a la presin parcial del oxgeno en la fase gaseosa:

En esta ecuacin C es la concentracin de O2 de la solucin de nutrientes a saturacin,

P0 es la presin parcial del gas en la fase gaseosa y H es la constante de Henry que es
especfica para cada tipo de gas. A medida que aumenta la concentracin de O2 en la
fase gaseosa, aumenta la proporcin de O2 en la solucin de nutrientes. En consecuencia,
la presin ms alta de O2 se consigue durante la aireacin con oxgeno puro. Comparado
con el valor obtenido al utilizar aire (9 mg O2/L), en agua se disuelven 43 mg O2/L
cuando se utiliza oxgeno puro. Otra caracterstica es que a medida que aumenta la
temperatura desciende la solubilidad del oxgeno.
Una vez disuelto el O2 ste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a cada clula
individual. Para ello deben ser superadas varias resistencias parcialmente
independientes:
a.- La resistencia dentro de la pelcula de gas a la interfase.
b.- La penetracin de la interfase entre la burbuja de gas y el lquido.
c.- Transferencia desde la interfase al lquido.
d.- Movimientos dentro de la solucin de nutrientes.
e.- Transferencia a la superficie de la clula.
En las fermentaciones que se llevan a cabo con organismos unicelulares como bacterias
o levaduras, el factor ms importante que controla la velocidad de transferencia es la
resistencia en la interfase entre la burbuja de gas y el lquido. Las clulas microbianas
prximas a la burbuja de gas pueden absorber directamente el O2 a travs de la interfase
aumentando la transferencia del gas a estas clulas. En los aglomerados de clulas o en
las bolitas de micelio, la transferencia de gas dentro del aglomerado puede ser un factor
limitante.
Por ltimo indicar la concentracin crtica de oxgeno que es el trmino utilizado para
expresar el valor de la velocidad especfica de absorcin de oxgeno que permite la
respiracin sin impedimentos. Esta concentracin crtica de oxgeno suele tener unos
valores concretos para cada microorganismo oscilando de forma general entre el 5% y el
25% de los valores de saturacin de oxgeno en los cultivos.

2.- Temperatura
La temperatura es otro de los parmetros esenciales para el xito de una fermentacin.
Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la ptima tienen retardado
su crecimiento y por lo tanto reducida la produccin celular, es decir su productividad.

Por otro lado, si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una
respuesta de estrs al choque trmico con la consiguiente produccin de proteasas
celulares que ocasionan una disminucin en el rendimiento de los productos proteicos. A
fin de obtener rendimientos ptimos, las fermentaciones deben ser llevadas a cabo en un
margen estrecho de temperatura y a ser posible constante. La velocidad de produccin
de calor debida a la agitacin y a la actividad metablica de los microorganismos no se
ve compensada por las prdidas de calor que resultan de la evaporacin, por lo que se
debe recurrir a sistemas de refrigeracin. Dentro de stos, los ms utilizados en las
fermentaciones industriales son las camisas de agua.

3.- pH
La mayor parte de los microorganismos crecen ptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero
durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al
medio, lo que puede originar un cambio del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se
debe controlar el pH del medio de cultivo y aadir un cido o una base cuando se
necesite para mantener constante el pH. Por supuesto que esta adicin del cido o base
debe ser mezclada rpidamente de tal manera que el pH del medio de cultivo sea el
mismo en todo el fermentador.

AGITACION Y MEZCLADO
La agitacin es la operacin que crea o que acelera el contacto entre dos o varias fases.
Una fermentacin microbiana puede ser considerada como un sistema de tres fases, que
implica reacciones lquido-slido, gas-slido y gas-lquido.
1.- La fase lquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos. Puede existir,
en algunos casos, una segunda fase lquida si existe un sustrato inmiscible en agua
como por ejemplo los alcanos.
2.- La fase slida consiste en clulas individuales, bolitas de micelio, sustratos
insolubles o productos del metabolismo que precipitan.
3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de oxgeno, para
la eliminacin del CO2 o para el ajuste del pH con amonio gaseoso.
Una adecuada agitacin de un cultivo microbiano es esencial para la fermentacin ya
que produce los siguientes efectos en las tres fases:
1.- Dispersin del aire en la solucin de nutrientes.
2.- Homogeneizacin, para igualar la temperatura, pH y concentracin de
nutrientes, en el fermentador.

3.- Suspensin de los microorganismos y de los nutrientes slidos.

4.- Dispersin de los lquidos inmiscibles.
Bajo estas premisas se podra concluir que cuanto mayor sea la agitacin, mejor ser el
crecimiento. Sin embargo, la agitacin excesiva puede romper las clulas grandes e
incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso en la viabilidad celular. Por lo
tanto, se debe conseguir un balance entre la necesidad del mezclado y la necesidad de
evitar el dao celular.
Los diferentes tipos de agitacin que se utilizan en las fermentaciones se incluyen dentro
de las siguientes clases:
1.- Agitadores rotativos, los cuales tienen un sistema interno mecnico de
agitacin.
2.- Columnas de burbujas, la agitacin se realiza mediante la introduccin de aire
a sobrepresin.
3.- Sistema aero-elevado (airlift), que pueden tener un circuito interno o externo.
La mezcla y circulacin de los fluidos son el resultado de las corrientes de aire
introducido, las cuales causan diferencias en la densidad dentro de las diferentes
partes del fermentador.
De estos tres tipos el ms utilizado es el primero ya que es ms flexible en las
condiciones de operacin, es ms fcil de conseguir comercialmente, provee una
eficiente transferencia de gases a las clulas y es el tipo con el que se tiene ms
experiencia.

ESTERILIZACION DEL AIRE DE FERMENTACION

La mayor parte de las fermentaciones industriales operan en condiciones de agitacin
vigorosa y el aire que se suministra al fermentador debe ser esterilizado. El nmero de
partculas y microorganismos en el aire vara en gran medida dependiendo de la
localizacin de la planta, el movimiento del aire y el tratamiento previo del aire. Como
media, el aire exterior tiene 10 - 100.000 partculas por m3 y 5 - 2.000 microorganismos
por m3. De estos, el 50% son esporas de hongos y el 40% son bacterias G (-). Los
fermentadores funcionan generalmente con velocidades de aireacin de 0,5 - 1,0 vvm
(volumen de aire/volumen de lquido por minuto). Un fermentador que tenga un
volumen de trabajo de 50 m3 con una velocidad de aireacin de 1 vvm necesita 3.000 m3
de aire estril por hora. La importancia crtica de la esterilizacin del aire en la
microbiologa industrial puede ser deducida a partir de estos valores.

Los mtodos existentes para la esterilizacin de los gases incluyen la filtracin,

inyeccin de gas (ozono), depuracin de gas, radiacin (UV) y calor. De todos estos,
slamente la filtracin y el calor son prcticos a escala industrial. Durante muchos aos
el aire se esteriliz pasndolo sobre elementos calentados elctricamente, pero debido al
alto coste de la electricidad a partir de la crisis del petrleo de los aos 70, este proceso
ha sido reemplazado por la filtracin.
Actualmente, en los sistemas industriales el aire se esteriliza por filtracin. En los
sistemas ms antiguos se instalaban filtros en profundidad como los de lana de vidrio en
los que las partculas son atrapadas por una combinacin de efectos fsicos (inercia,
bloqueo, difusin, gravedad y atraccin electrosttica). Los dos ltimos mecanismos
tienen un efecto mnimo sobre la eliminacin de las partculas. Las desventajas de los
filtros de lana de vidrio incluyen el arrugamiento y la solidificacin durante la
esterilizacin por vapor.
Actualmente estn siendo reemplazados por filtros de cartuchos que utilizan membranas
plegadas. Las ventajas de estos filtros es que son sustancialmente ms pequeos, debido
a la construccin de los cartuchos es fcil reemplazar los elementos filtrantes utilizados,
al poseer una estructura membranosa (steres de celulosa, polisulfona o nylon) tienen un
efecto de filtros absolutos. La desventaja de la mayor parte de los sistemas instalados
actualmente es que no existen todava, para uso industrial, filtros absolutos para
bacterifagos. Los bacterifagos pueden ocasionar el fallo total de un sistema como por
ejemplo en la produccin de cido glutmico por Corynebacterium glutamicum o al
trabajar con Escherichia coli.
El aire que sale del fermentador tambin debe ser esterilizado, sobre todo si se trabaja
con organismos recombinantes. No slo como medida de seguridad, sino tambin para
prevenir que las cepas industriales se liberen al medio ambiente y por lo tanto estn
disponibles de una forma gratuita para los competidores. De nuevo, se utiliza la
filtracin.

RECUPERACION DE PRODUCTOS
El trmino recuperacin (downstream processing) es un trmino colectivo, til para
todas las etapas que se requieren a fin de recuperar los productos tiles de cualquier tipo
de proceso industrial. Cuando se discute la recuperacin del producto se debe distinguir
entre los conceptos de purificacin y concentracin. Una etapa de recuperacin cambia
la pureza y/o la concentracin de un metabolito. En el proceso ideal de recuperacin se
optimizan ambos parmetros.

En los primeros tiempos de la Microbiologa Industrial las tcnicas utilizadas en la

recuperacin de productos (extraccin, destilacin, dilisis, cristalizacin, precipitacin,
desecacin) se tomaron ms o menos directamente de la ingeniera qumica sin ms que
un intento aproximado para adaptarlas a los materiales biolgicos. Sin embargo,
gradualmente se comprendi que haba que perfeccionar procesos especficos de
purificacin para materiales biolgicos ya que los bioproductos son frecuentemente
compuestos muy lbiles cuyas estructuras activas pueden sobrevivir solamente bajo
condiciones definidas y limitadas de pH, temperatura, fuerza inica, etc. Tambin
result claro que no existe una operacin nica, ideal o universal, ni siquiera secuencias
de operaciones que puedan ser recomendadas; las operaciones individuales unitarias
deben ser combinadas de la forma ms adecuada para cada problema particular.
En muchos casos la primera etapa, al final de una fermentacin, es la separacin de los
slidos del lquido que casi siempre es acuoso. El propio microorganismo puede ser el
producto final deseado, sin embargo, en la mayor parte de los procesos a gran escala el
producto deseado es un metabolito que est presente intra o extracelularmente. Ejemplos
de metabolitos intracelulares incluyen a los cidos nucleicos, las vitaminas, enzimas y
ciertos antibiticos como la griseofulvina. Ejemplos de metabolitos extracelulares
incluyen a los aminocidos, el cido ctrico, alcohol, algunos enzimas (amilasas y
proteasas) y la mayor parte de los antibiticos (penicilina, estreptomicina). En unos
pocos casos se encuentran metabolitos tanto en las clulas como en el filtrado del cultivo
(vitamina B12).
Si el metabolito que se va a aislar es intracelular, ste debe ser liberado de las clulas
antes de proceder a las siguientes etapas. Una vez el metabolito ha sido separado de las
clulas, la seleccin de etapas adicionales de purificacin depender del producto
deseado. La transparencia resume varios procesos de purificacin, ordenados de acuerdo
con los principios de separacin para partculas de varios tamaos, peso, carga, etc. Las
ltimas etapas en la recuperacin implican precipitacin, cristalizacin y/o desecacin.

A. Separacin de las partculas

La primera etapa en la recuperacin del producto es, por consiguiente, la separacin de
la biomasa celular y los ingredientes insolubles del sobrenadante de cultivo. Para este
propsito existen varios mtodos, que incluyen la floculacin, flotacin, filtracin y
centrifugacin.

1.- Floculacin y flotacin

Las clulas aisladas en el rango de tamao de 1 a 10 m sedimentan solo muy
lentamente y son difciles de precipitar incluso con la centrfuga. En estos casos se
recurre a la floculacin para producir grandes agregados que sedimentan mucho ms
rpidamente ya que la velocidad de sedimentacin de una partcula aumenta con su
dimetro (ley de Stokes).
En la mayor parte de los casos se aade un agente floculante como una sal inorgnica,
polielectrolitos orgnicos o hidrocoloides minerales. La floculacin depende tanto del
agente floculante empleado como de otros factores como la naturaleza de las clulas, de
los constituyentes inicos as como su concentracin. La floculacin puede ocurrir
reversiblemente si las cargas sobre la superficie de la clula pueden neutralizarse por
iones de carga opuesta, e irreversiblemente si se forman, entre las clulas, puentes de
molculas polimricas cargadas.
Si no se forma un flculo suficientemente denso, puede utilizarse la flotacin que es el
proceso reverso a la floculacin. La flotacin se consigue introduciendo gas en el
lquido. Las pequeas burbujas de gas adsorben y atrapan a las clulas y suben a la capa
de espuma en la parte superior del recipiente donde pueden ser recogidas y sacadas del
biorreactor.

2.- Filtracin
Lo ms frecuente es que la primera etapa en el proceso de recuperacin se lleve a cabo
por algn tipo de proceso de filtracin. Los dos principales tipos de filtros son los
denominados filtros en profundidad y filtros en superficie; en ambos casos la fuerza
motriz es la presin, sea creada por sobrepresin o por vaco.
Un filtro en profundidad se construye a partir de una matriz filamentosa, como lana de
vidrio o papel de filtro, llevndose a cabo el proceso de filtracin debido a que las
partculas que han de ser removidas quedan atrapadas dentro de la matriz. Las partculas
que van a ser filtradas son frecuentemente ms pequeas que los poros del filtro, pero a
pesar de ello son separadas a medida que pasan a travs de los intersticios retorcidos del
filtro. Los filtros en superficie son membranas en las que el tamao de los poros es ms
pequeo que las partculas que van a ser filtradas. Las partculas son, por consiguiente,
separadas sobre las superficies de los filtros.
Los hongos filamentosos se filtran frecuentemente a travs de filtros profundos. Por su
parte, los cultivos bacterianos deben ser filtrados en superficie. En cualquier caso, la
velocidad de filtracin, es decir el volumen de filtrado que puede ser recogido en un
tiempo determinado, est influenciada por numerosos factores, como el tamao de los
microorganismos, su morfologa, la viscosidad del fluido, temperatura, etc.

Uno de los inconvenientes de la filtracin en superficie es la colmatacin. Debido a que

este proceso de filtracin depende estrictamente del tamao de los poros y del tamao de
las partculas, a medida que el material celular se amontona sobre el filtro se forma una
capa que reduce la velocidad de filtracin.
Una mejora considerable en el flujo que pasa por el filtro se consigue por filtracin en
contracorriente, en la cual los slidos que no pasen a travs del filtro son mantenidos en
suspensin mediante un flujo turbulento a travs de la membrana o ajustando palas
mviles o mediante un impulsor en el interior del filtro. El filtrado pasa a travs de la
membrana y la biomasa se separa del filtro y se transfiere con el material que se retiene.
Con el mtodo de contracorriente puede obtenerse un aumento de la velocidad de
filtracin de 100 veces en comparacin con la filtracin esttica.
Dependiendo del tamao de las partculas que sean filtradas se reconocen tres tipos
principales de procesos de filtracin:

Osmosis reversa, para partculas de 0,0001 a 0,001 m

Ultrafiltracin, para partculas de 0,001 a 0,1 m
Microfiltracin, para partculas de 0,1 a 10 m
Las posibilidades de los procesos de ultrafiltracin y smosis reversa se dan
generalmente en trminos del peso molecular del tamao de corte. La smosis reversa
implica generalmente a sustancias de pesos moleculares menores de 1.000 daltons y la
ultrafiltracin a sustancias de pesos moleculares mayores de 1.000 daltons. El proceso
de microfiltracin concierne principalmente a la separacin de clulas o de fracciones
celulares. Se utilizan membranas fabricadas con steres de celulosa, polivinilfluoruros,
policarbonatos, polisulfonas y celulosa.
En los procesos clsicos de purificacin utilizados en la industria de antibiticos
(micelios de hongos y actinomicetos), la biomasa se separa del filtrado del cultivo sobre
un filtro de tambor rotatorio a vaco que consiste en un tambor rotatorio en cuya parte
exterior se enrolla un pao y el vaco se produce desde el interior del tambor. Para
aumentar la eficiencia del proceso de filtracin, se utiliza una ayuda filtrante como tierra
de diatomeas. Para mantener la eficiencia de filtracin, se utiliza una cuchilla automtica
para raspar continuamente del filtro la biomasa junto con una fina capa del material de
ayuda de filtracin. Organizando el tambor en segmentos, la ayuda filtrante puede ser
lavada a medida que gira el tambor. Los filtros de tambor a vaco son especialmente
buenos para suspensiones que contengan una alta concentracin de slidos (20-60% de
volumen de micelio).

3.- Centrifugacin
Las bacterias son normalmente demasiado pequeas como para ser separadas con filtros
sencillos. Su separacin por centrifugacin tambin es difcil debido a las pequeas
diferencias en densidad entre las partculas y la suspensin.
La centrifugacin no slo se utiliza para separar partculas slidas de la fase lquida sino
tambin para la separacin de fluido/fluido. Si bien la separacin fluido/partcula es de
la mayor importancia, la separacin fluido/fluido tambin es importante como es el caso
en la produccin de penicilina para la separacin del solvente que extrae el antibitico
de la fase acuosa mediante una contracorriente continua en dos etapas con acetato de
amilo o de butilo a 0-3C y pH: 2,5-3,0.
La separacin eficiente de las clulas por centrifugacin se ve favorecida por un tamao
grande de las partculas, una gran diferencia entre la densidad de las partculas y el
lquido, una baja viscosidad del lquido, un radio elevado del rotor de la centrfuga y una
alta velocidad angular. Tanto el tamao de las partculas, su densidad as como la
viscosidad del lquido normalmente no se pueden controlar. Adems, el radio del rotor
de la centrfuga no puede incrementarse indefinidamente ya que el estrs mecnico
incrementa con el cuadrado del radio por lo que los lmites de seguridad se alcanzan
fcilmente. Por todo esto y cuando se trabaja con grandes volmenes se debe recurrir a
centrfugas de flujo continuo. En este tipo de centrfugas la separacin de partculas es
ms eficiente cuanto ms lento sea el flujo de la suspensin a clarificar ya que se
incrementa el tiempo que cada partcula est expuesta a la fuerza centrfuga.
En la transparencia se muestran esquemticamente algunos tipos de rotores: cmara
tubular, recipiente de cmara mltiple y centrfuga de rotor de discos. Todos los diseos
tienen desventajas individuales a las que deben ser aadidas las generales del coste
(incluyendo el mantenimiento), consumo de energa y (exceptuando las que incorporan
refrigeracin) elevacin de la temperatura.

B. Desintegracin de los microorganismos

En algunos casos la recuperacin de los productos requiere que los microorganismos
sean fragmentados por procedimientos qumicos, fsicos o biolgicos. Un resumen de
los mtodos utilizados en la desintegracin de los microorganismos se encuentra en esta
transparencia. La seleccin de un mtodo depende principalmente de la naturaleza de las
clulas. Aunque las membranas celulares no ofrecen especial resistencia a la ruptura, las
paredes celulares varan ampliamente en lo rpidamente que pueden ser rotas. Las
bacterias Gram + y los hongos son mucho ms difciles de romper que las bacterias G-

debido a la composicin de la pared celular. Incluso dentro de un mismo

microorganismo las clulas varan significativamente en sensibilidad a la ruptura
dependiendo de su estado fisiolgico. Al mismo tiempo, la desintegracin debe ser
llevada a cabo sin destruir el producto que nos interesa. Por ejemplo, pueden utilizarse
cidos para romper muchos microorganismos pero no pueden ser utilizados si el
producto de inters es lbil a los cidos.

1.- Mtodos qumicos

Los mtodos qumicos utilizados para desintegrar clulas microbianas incluyen
tratamiento con lcalis o cidos, solventes orgnicos y detergentes.
La lisis bacteriana mediante el uso de lcalis puede llevarse a cabo a gran escala y con
bajo coste siempre y cuando el producto sea estable a pH: 10,5-12,5. Por ejemplo, la
hormona de crecimiento humano recombinante se libera fcilmente de Escherichia coli
por tratamiento con hidrxido sdico a pH: 11. El tratamiento con solventes orgnicos es
un tratamiento sencillo y barato que se utiliza en el aislamiento de enzimas en levaduras.
No obstante, se corre el riesgo de que el tratamiento desnaturalice las protenas por lo
que se debe chequear con antelacin. Los detergentes permeabilizan las clulas
bacterianas al solubilizar las membranas celulares. Como consecuencia de esta actividad
se originan agujeros por los que salen al exterior las protenas y otras molculas.
desgraciadamente los detergentes son caros, desnaturalizan la mayora de las protenas y
a menudo aparecen como contaminantes en el proceso subsecuente de purificacin. Para
la extraccin de clulas de levadura se utiliza la plasmlisis que se consigue mediante la
adicin de una concentracin alta de cloruro sdico.

2.- Mtodos biolgicos

Se utiliza la lisis enzimtica. Por ejemplo, la pared celular de las bacterias Gram + se
hidroliza con el enzima lisozima que se aisla de la clara de huevo. La pared celular de
las bacterias Gram - se hidroliza con lisozima y EDTA. La pared celular de las levaduras
se hidroliza con una combinacin de uno o ms de los enzimas (1,3)-glucanasa,
(1,6)-glucanasa, mananasa y quitinasa. Los tratamientos enzimticos son muy
especficos y las condiciones para la lisis son suaves. En la actualidad, los costes limitan
el uso de los enzimas como agentes lticos celulares en la industria. Una variante que se
utiliza en levaduras es la autolisis en la cual los enzimas autolticos endgenos de las
levaduras llevan a cabo la destruccin de su propia pared celular. La adicin de cloruro
sdico, acetato de etilo o cloroformo y la incubacin durante 24h a 45C aumenta la
velocidad del proceso autoltico.

3.- Mtodos fsicos

La desintegracin por ultrasonidos se utiliza ampliamente en el laboratorio, pero debido
a su alto coste no es adecuada para procesos a escala industrial. Otro mtodo fsico
incluye repetidos ciclos de congelacin y descongelacin pero en este caso muchas de
las clulas permanecen intactas. Industrialmente los mtodos fsicos ms empleados de
desintegracin celular suponen la accin mecnica. Los molinos de bolas llevan a cabo
la ruptura de las clulas mediante la accin de bolas de vidrio. Las clulas y las bolas de
vidrio se mezclan juntas y se someten a una alta velocidad de mezclado en una vasija de
reaccin. La ruptura se produce cuando una bola de vidrio fuerza una clula contra las
paredes de la vasija. Con este mtodo se consigue una velocidad mxima de ruptura de
aproximadamente el 80% de las clulas. Otro enfoque es el uso de homogeneizadores.
En tales artilugios el material biolgico se coloca bajo una fuerte presin hidrosttica
(alrededor de 500 atmsferas) y la presin se libera bruscamente permitiendo que el
lquido salga por una vlvula, lo que ocasiona la lisis celular.

C. Mtodos de aislamiento
Una vez que se han lisado las clulas, los restos celulares se retiran bien por
centrifugacin de gran capacidad a baja velocidad o por filtracin en membrana. Al final
obtenemos un lquido libre de clulas que es el que sufre los tratamientos posteriores
para aislar y en su caso purificar el producto de inters.

1.- Cromatografa
Algunas de las etapas ms caras en la recuperacin del producto implican el uso de
mtodos cromatogrficos. Tales mtodos son de especial valor para la purificacin de
materiales biolgicos sensibles y encuentran un amplio uso en la preparacin de
materiales farmacuticos, reactivos de diagnstico y reactivos para investigacin. Los
distintos mtodos cromatogrficos que existen segn su mecanismo de separacin son:
filtracin en gel (peso molecular), cromatografa de adsorcin (interacciones
hidrofbicas), cromatografa de intercambio inico (carga), cromatografa de afinidad
(actividad biolgica) y electroenfoque (punto isoelctrico).

2.- Extraccin
La extraccin, cuando se aplica a los bioproductos, tiene tanto la funcin de separacin
como la de concentracin. El caldo acuoso de fermentacin que contiene el producto
deseado se mezcla con un solvente inmiscible en el que se disuelva preferentemente y
del que pueda ser ms fcil y especficamente recuperado. Una vez se ha concentrado el

producto deseado en la fase solvente puede ser adicionalmente purificado. La extraccin

con solventes ha sido utilizada ampliamente en la industria de antibiticos, como la
penicilina, utilizando solventes como el acetato de amilo o de butilo. Para la separacin
de enzimas en estado activo no pueden ser utilizados los solventes orgnicos pero s
pueden ser utilizados sistemas acuosos en fase mltiple preparados en una solucin de
sales con polmeros hidroflicos (polietilenglicol-dextrano). En ambas fases el agua es el
componente principal, pero ambas fases no son miscibles por lo que los enzimas pueden
separarse fcilmente sin prdida de actividad.

3.- Cristalizacin y precipitacin

La cristalizacin a baja temperatura es una forma muy suave de purificacin. La
cristalizacin se utiliza principalmente para la purificacin de compuestos de bajo peso
molecular, como los antibiticos. Por ejemplo, la Penicilina G es generalmente extrada
del caldo de fermentacin con acetato de butilo y cristalizada por adicin de acetato
potsico en solucin etanlica.

4.- Desecacin
El secado del material biolgico es en muchos casos el mtodo final por el que los
productos son llevados a una forma estable adecuada para su manejo y almacenamiento.
La sensibilidad al calor de la mayor parte de los productos biolgicos significa que los
nicos mtodos que pueden ser utilizados son los que conducen a la eliminacin de agua
con elevacin mnima de la temperatura. En algunos casos, la termoestabilidad de los
productos, como enzimas o preparaciones farmacuticas, es mejorada por la adicin de
azcares u otros estabilizantes inertes. La liofilizacin es el mtodo de desecacin ms
suave debido a que el agua es sublimada a partir de una masa congelada. Muchos
productos farmacuticos son liofilizados como vacunas, fracciones de plasma, hormonas
y preparaciones de enzimas, as como ingredientes muy lbiles y caros para diagnosis.
Tambin se utiliza la liofilizacin cuando el producto final es un cultivo microbiano
vivo (cultivos para inoculacin en las industrias lcteas).

D. Rendimiento
Las prdidas en la recuperacin dependen de la sensibilidad de las sustancias al proceso
y del nmero de etapas de purificacin. El promedio de prdidas atribuidas a la
purificacin est en torno al 20% pero en casos extremos, con ciertos tipos de
metabolitos intracelulares, puede llegar a ser el 90%. En la transparencia se muestran los
datos para la purificacin de cido glutmico donde se observa la extensin en la que
deben ser combinados y optimizados los mtodos de recuperacin. El rendimiento final
es slamente un factor, ya que el coste de los productos qumicos, el equipo y los
salarios deben ser considerados en el clculo global.