Vous êtes sur la page 1sur 14

7.

ELECTROPHORESE CAPILLAIRE
OBJECTIFS
Comprendre les principes dune sparation par lectrophorse
Connatre les paramtres principaux qui dcrivent la sparation et lefficacit de la
sparation

Savoir le rle de la physicochimie du milieu sur la sparation


Connatre les applications principales de llectrophorse capillaire
7.1 Introduction
Le principe de llectrophorse capillaire repose sur la migration des espces en solution,
porteuses dune charge lectrique globale, soumises leffet dun champ lectrique, et au
contact dun support appropri. La mise en uvre consiste utiliser un tube capillaire ouvert
ses extrmits, en verre de silice de trs faible diamtre (15 150 m).
Ce capillaire, dune longueur L variant entre 20 et 80 cm, est rempli de la mme solution
aqueuse dlectrolyte tampon que les deux rservoirs situs de part et dautre. On applique
aux lectrodes une diffrence de potentiel pouvant atteindre 30 kV. Lintensit ne doit pas
dpasser 100 A (soit une puissance dissipe denviron 3 W maximum), pour viter
lchauffement du capillaire quil est prfrable nanmoins de placer dans une enceinte
thermostate.
Les espces, quelles soient charges positivement ou ngativement, migrent en gnral vers
la cathode. Un systme de dtection est plac avant lextrmit aval du capillaire. En mode
UV par exemple, le capillaire coupe le trajet optique entre la source et le photomultiplicateur, ce
qui permet de mesurer labsorbance de la solution en vitant tout volume mort. Il en est de
mme pour la dtection lectrochimique. De minuscules lectrodes sont, dans ce cas,
insres dans le capillaire.

104

7.2. Capillaires
silice fondue
SiOH SiO (pH > 3)
Double couche
couche diffuse (mobile)
couche fixe

7.3 Principes

La vitesse et la direction dpendent des tailles et des charges des ions (magnitude et signe)
Sparation danions ou de cations mais pas despces neutres

4e

= diffrence de potentiel (couche mobile, couche fixe)


e = charge par unit de surface
= constante dilectrique du tampon
= paisseur de la double couche
Lpaisseur de la double couche est inversement proportionnelle la concentration du
tampon
En lectrophorse capillaire, on observe que les constituants dun mlange se sparent par
effet de deux facteurs principaux appels mobilit lectrophortique et flux ou coulement
lectro-osmotique, qui se manifestent aussi bien pour les ions que pour les molcules ou les
micelles.

105

cations
espces neutres
anions

7.4 Electro-osmose
7.4.1 Mobilit lectro-osmotique
Un facteur important qui contrle gnralement la migration des soluts est la mobilit lectroosmotique, O, due lcoulement de llectrolyte ou flux lectro-osmotique qui apparat aussi
bien en lectrophorse sur bande par effet du support, quen lectrophorse capillaire par effet
de la paroi interne du capillaire.
La paroi de silice est tapisse de groupements silanols qui se dprotonnent si le pH est
suprieur 2. Elle forme alors une couche polyanionique fixe. Par contre, en vis--vis, la
+
couche polycationique (positive) de llectrolyte, dont les ions H3O , se met en mouvement ds
quun champ lectrique est cre dans le capillaire, entranant toutes les espces prsentes. Ce
dplacement linaire de llectrolyte produit par la charge des ions et le champ tangentiel
appliqu, peut tre contrl, voire invers, en modifiant la surface, le pH, ou en ajoutant des
surfactants ioniques.

EO =

= viscosit du tampon
.

-1

E : champ lectrique (V cm )
106

dpendant du tampon
- constante dilectrique
- viscosit
- (pH, concentration)
dpendant de la composition du capillaire
-
7.4.2 Dbit lectro-osmotique

VEO =

E
4
.

-1

ou E est le champ lectrique (V cm )

E=

V
L

V : potentiel appliqu
L : longueur du capillaire

7.4.3 Facteurs qui influencent llectro-osmose

potentiel appliqu
pH
temprature
solvants organiques
modification de la paroi du capillaire

7.4.3.1 Effet du potentiel appliqu


Une augmentation du potentiel
- vEO (dbit)
- temps de migration (temps danalyse)
Mais aussi,
- I (courant)
- P (puissance) = VI
(On utilise la puissance comme indicateur de chauffage par effet Joule)
dpendant des conditions du tampon
- composition
- pH
-I
107

dpendant du capillaire
- diamtre
- longueur

Exemples :
diamtre
-R
- I (V = IR)
- P (P = VI)
(donc, on peut augmenter V max)
longueur ( L)
- E (E = V/L)
- R (V = IR)
-I
- P (P = VI) chauffage

7.4.3.2 Effet du pH
SIOH2+SiOH+H+ SiO2H+
pH : normalement optimis pour la sparation et non pas le dbit lectroosmotique.

108

7.4.3.3 Effet de la concentration du tampon/force ionique

4e

Concentration
- adsorption dans la couche de Stern
-
-
- vEO
et si la temprature dest pas contrle, une augmentation de I :
I (courant) T :
Limitations : la concentration du tampon devrait excder la concentration de lchantillon
(10-100x)
Chauffage dans les capillaires
- pics plus larges
- viscosit du tampon (donc I)
- bullition du tampon
- dcomposition de lchantillon
Il vaut mieux utiliser un maximum de voltage sans excs de chauffage
7.4.3.4 Effet de la temprature
1 C (20 21 C)
2.4 %
et puisque

VEO =

E
4

2-4 % VEO
mais aussi 0.5 % (cte. dilectrique)
En gnrale, T VEO
Sil y a trop de chauffage, il en rsulte :
dcomposition de lchantillon
diffusion ( largeur des pics)
bullition du tampon
109

7.4.3.5 Effet des solvants organiques


difficile prvoir, il y a des effets sur :
- la viscosit
- la constante dilectrique
Exemple :
MeOH
- la viscosit augmente jusqu' 50 % v/v (puis diminution 100% v/v)

7.4.3.6 Modification chimique du capillaire


On peut rduire, liminer ou inverser VEO
- liaison covalente (i.e. polyacrylamide)
- modification dynamique
surface cationique (CTAB)
surfactant non-ionique (TWEEN)
surfactant zwitterionique (TRIS)
pH normalement optimis pour la sparation et non pas le dbit lectroosmotique.
7.4.4 Inversion du dbit EO
Exemples :
Bromure de tetradecyltrimetyl ammonium

110

avec addition de - lactalbumin (protine : pI 4.3)

7.4.5 Rsum : Electroosmose


Pour modifier le dbit lectroosmotique (DEO) :
- V : DEO
- pH (tampon) : DEO
- [tampon] : I tampon : DEO
- T : DEO

7.4.6 Dtermination du dbit lectro-osmotique


ajout dun compos neutre
VEO = l / t

l = longueur du capillaire jusquau dtecteur (pas L longueur totale du capillaire)


t = temps
le compos doit tre :
- neutre (pH du tampon)
- soluble
- inerte
- sensible la dtection employe
e.g. phnol, MeOH, benzne
111

7.5 Electrophorse
7.5.1 Mobilit lectrophortique
Dans toute exprience dlectrophorse, un compos porteur dune charge lectrique migre,
sous influence du champ lectrique appliqu E une vitesse appele vitesse de migration
lectrophortique VEP qui dpend de sa mobilit lectrophortique EP.
EP est dfinie partir de sa vitesse de migration VEP observe dans un lectrolyte suppos
immobile et du champ lectrique
VEP = EP
.

EP =

q
=
L
6r VEP V

r = rayon hydrodynamique
q = charge (q = 0 : aucune sparation)
L dsigne la longueur totale du capillaire et V le potentiel appliqu ses extrmits. On verra
2 -1 -1
plus loin quon peut obtenir EP(cm .V .s ) partir dun lectrophorgramme, de manire
indirecte. On affecte la mobilit lectrophortique un signe (+ ou -) selon la nature cationique
ou anionique de lespce ; EP est nulle pour une espce globalement neutre. Ce paramtre
dpend, non seulement de la charge de lespce, mais de son diamtre et la viscosit de
llectrolyte.
Facteurs influenant la mobilit lectrophortique
Charge :
- pH important (macromolcules !)
-

e.g. R-CHCOOH R-CHOO RCHCOO

|
NH3
+
2+

e.g. Zn

NH3
+

NH2

2-

4+ EDTA Zn - EDTA

Viscosit :
- Modifications de temprature ou de solvant (ajout dun modificateur organique)
Rayon hydrodynamique de lion

112

7.5.2 Dtermination de

VEP=

! distance

tR temps

( ) (!t )

!
VEP= t

obs

EO

EP= VEP

()

V
L

() ()

! L
EP= !
t obs t EO V

7.6 Optimisation de la sparation


Les performances de llectrophorse capillaire sont comparables celles de la
chromatographie liquide quelle complte utilement pour les sparations de biopolymres ; la
mise au point dune sparation revient trouver un milieu tampon adapt au problme
rsoudre ; cependant la reproductibilit des analyses est plus difficile matriser ; la sensibilit
est trs grande : on connat des exemples de dtection de quelques milliers de molcules
vraies. La quantit requise dchantillon est trs faible et la consommation de ractifs ou de
solvants est ngligeable.
Les lectrophorgrammes permettent de calculer les paramtres de sparation (facteurs de
capacit, slectivit, rsolution) comme en chromatographie. Quatre paramtres sont
importantes pour la sparation :
Temps ( t )
Rsolution ( R )
Efficacit ( N )
Slectivit ( )
7.6.1 Temps de sparation
t=

!L
(P+O)V

Pour diminuer le temps :


-L
- obs
-V
113

7.6.2 Rsolution ( R )
R=0.177(EP1EP2)

V
moy+EO)D

Pour augmenter la rsolution :


V
i.e.

R = f ( V)
moy = O

mais
=

!
tm (moy +LO)V

7.6.3 Efficacit (
N)
6

Lefficacit thorique N, qui peut atteindre 10 plateaux au mtre, dune colonne de longueur
2 -1
totale L et de longueur effective l, peut tre calcule partir du coefficient de diffusion D (cm .s )
2
du solut choisi, donn par la loi dEinstein ( = 2Dtm) et de son temps de migration tm partir
des deux expressions quivalentes :
2
N= !
2DTm

N= app V !
2D L

()

N=16 t =5.54 t
w
w
1/ 2

( + )V
N= P . O
2 D
.

Pour augmenter lefficacit de la sparation :


-V
- OBS
- D ( sparation des petits soluts - moins efficace)

114

7.6.4 Slectivit ()
HPLC :

EC :

t t
= 2 m
t1 t m
t t
= 2 0
t1 t 0
V
= f 2
V1

= f 2
1

115

7.7 Dtection

116

7.8 Comparaison entre llectrophorse capillaire et la chromatographie liquide

Techniques complmentaires
Pics plus troits en EC
potentiels de 20'000 60'000 V
N
- 100'000 - 200'000 (EC)
- 5'000 - 100'000 (HPLC)

7.9 Exemple dune sparation EC

117