Cromatografa de Lquida de Alta Eficiencia

Chromatography

High Performance Liquid

Qu es Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia?

Tipos de Cromatografa Lquida
Diagrama de un Sistema de HPLC
Eleccin del Solvente
Bombas
Programacin del Solvente
Sistemas de Inyeccin de muestra
Columnas y Fase Estacionaria
Deteccin
Derivatizacin
Anlisis Cualitativo y Cuantitativo
Problemas ms comunes encontrados en HPLC
Recomendaciones para adquirir un sistema de HPLC
Referencias Bibliogrficas recomendadas

Qu es Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia?

Tipos de Cromatografa Lquida

Cromatografa de Particin.
Cromatografa de Adsorcin
Cromatografa Inica
Cromatografa de Exclusin

Diagrama Bsico de un sistema de HPLC

Elecccin del Solvente

Caractersticas:

Disponible comercialmente
Precio
Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad de
pureza cromatogrfica. Bajo contenido de impuresas.
Disolver la muestra
Misible con otros solventes para formar mezclas tiles
No degradar o disolver la fase estacionaria
Tener baja viscosidad para reducir las cadas de presin
Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia ptica (cuando se usan
detectores UV)

Filtracin y Desgasificacin de solventes

En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Tcnicas del Laborario

Moderno ms importantes como herramienta analtica para separar y detectar
compuestos qumicos. Como en todas las tcnicas analticas, los pequeos
problemas a la larga pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y
durabilidad del sistema. Aun con la evolucin de los cromatografos lquidos en
la era de la computadora, hay aun problemas que sta no puede resolver.

Hasta los Solventes para HPLC, tods filtrados cuidadosamente en la fbrica,

pueden acumular partculas en suspencin que pueden ser perjudical a los
componentes del sistema HPLC. Estas partculas en suspencin pueden venir
de varias fuentes, incluso de la exposicin al polvo en el aire durante el
trasegado de solvente en el depsito para solvente, la exposicin a partculates
del aire durante el almacenamiento del solvente en el depsito del solvente, la
degradacin lenta del recipiente solvente, o de condensacin y polimerizacin
del solvente. Las partculas pueden ocasionar costosos daos a la bomba HPLC,
al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los
fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan
que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.

En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone
el interior del solvente a la atmsfera y empieza a acumular gases disueltos
que se encuentran en la atmsfera. El trasegado del solvente en el depsito
solvente y su almacenamiento en estos depsitos mseste fenmeno. El
Oxgeno Disuelto que constituye el 21% de la atmsfera puede producir mayor
interferencia en los detectores de fluorescencia y electroqumicos. El Nitrgeno
Disuelto es el otro componente de la atmsfera que puede producir burbujas
en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos
falsos y desviaciones de la lnea base. El Dixido de Carbono disuelto algunas
veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente.

Mtodos de Filtracin de Solventes en HPLC

Hay tres(3) mtodos comunes que se utilizan hoy para la filtracin previa de los
Solventes en HPLC :

Filtro a la Entrada del Solvente

Filtracin al Vaco
Filtracin en Lnea
Mtodos de Desgasificacin de Solventes en HPLC

Existen cuatro(4) mtodos comunes usados para desgasificar solventes en

HPLC previos a su uso:

Sonificacin
Burbujear Helio
Desgasificacin Electrnica en la Lnea del Flujo
Desgasificacin al Vaco en Lnea

Bombas

Requisitos o aspectos ms importantes que debe reunir una bomba o sistema

de bombeo:

Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.

Mantener el flujo libre de pulsaciones
Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)
Control y reproducibilidad del flujo de solvente
Componentes de la bomba resistentes a la corrosin

Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar segn su funcionamiento

y diseo en:

Mecnicas
Recprocantes
De desplazamiento contnuo
Neumticas

Programacin del Solvente

Existen dos mtodos de programacin de Solvente en HPLC:

Isocrtico
Gradiente de Elucin. Es un trmino que se utiliza para describir el proceso
mendiante el cual se cambia la composicin de la fase mvil. Pueden
efectuarse de dos maneras:
A baja presin
A alta presin
Cuando se desarrolla un anlisis usando el mtodo de gradiente se debe tener
presente dos objetivos:

Obtener la mejor resolucin de los componentes de la muestra en el menor

tiempo posible.
Asegurar alta presicin y exactitud.

Para obtener buenos resultados con el mtodo de gradiente debemos seguir 5

pasos fundamentales:

Determinar la composicin inicial y final del solvente

Ajustar el tiempo del gradiente
Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)
Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolusin
Regresar a las condiciones iniciales la columna.

Sistemas de Inyeccin de muestra

Estos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un

principio de utilizaba la inyeccin de la muestra con jeringas de alta presin
cuales ya estn de desuso. Hoy se utiliza el sistema de Vvulas inyectoras.

Columnas y Fases Estacionarias

Tipos de Columna:

Fuentes de dao de una columna de HPLC:

* Obstruccin por partculas pequeas en los solventes o fases mviles
* Obstruccin por materiales no eludos en las muestras
* Variacin de las caractersticas de retencin por incremento de materiales no
eludos

Deteccin

La eficiencia de un detector cromatogrfico depende de la relacin entre la

cantidad fsica medida y la composicin del efluente, as como tambin de
lascaractersticas de las seal de transferida.

Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:

Detectores basados en una propiedad de la fase mvil . Ejemplo: Detector de

Indice de Refraccin
Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo:
Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta

Los detectores ms utillizados en HPLC son:

Detector UV. Hay bsicamente tres tipos:

Detector de Longitud de Onda Fija
Detector de Longitud de Onda Variable
Detector de Arreglo de Diodos
Detector de Indice de Refraccin. Existen muchos diseos de estos detectores,
pero solamente existen ahora dos tipos:
Tipo Deflexin
Tipo Fresnel
Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar
compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacin .
Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
Segn la Fuente de Excitancin
Segn el sistema ptico
Detectores Electroqumicos. Pueden ser clasificados en tres tipos:
Detector Amperomtrico
Detector Conductimtrico
Detector Potenciomtrico

Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroqumicos para

asegurarse anlisis reproducicbles:
Chequear que esten conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector
y registrador (integrador.
Usar bombas reciprocantes de doble piston
Mantener en todo momento el flujo de la fase mvil en el detector.
Operar con el voltaje adecuado
Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la efiencia que nos
indique la necesidad de reacondicionar los electrodos.
Tener electrodos de referencias extras en solucin 3M de NaOH y reemplazar el
electrodo de referencia en la celda 1 2 veces a la semana.
Desconectar el detector electroqumico cuando este llimpiando las columnas.

Utilizar agua, buffers y solventes orgnicos de alta pureza.

Derivatizacin

Existen dos tendencias :

Pre-Columna
PostColumna

Analisis Cualitativo y Cuantitativo

Ver Cromatografa de Gases

Problemas ms comunes encontrados en HPLC

Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus

posibles causas posibles, y cmo solucionarlos.

Presin Alta
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o Guarda Columna por
partculas.
Solucin: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna
desconectada del detector. Si sto no funciona reemplaze el fritado a la
entrada de la columna. Si la presin sigue alta reemplaze la columna.
Solucin a largo plazo: Asegurese que todas las fases mviles se filtren
apropiamente antes que entren a la bomba de HPLC . Tambin filtre todas las
muestras antes de inyectarlas.
Prdida de la Resolucin
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC del Guarda Columna por
partculas.
Solucin: vea la seccin de Presin Alta
Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases mviles
en el sistema de HPLC.
Picos Hendidos

Posible causa : Obstruccin de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por

partculas.
Solucin: Marcha atrs columna roja con presin baja est al lado de abre. Si es
necesario reemplaze el fritado de la entrada o la columna.
Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases mviles
en el sistema de HPLC.
Variacin en los Tiempos de Retencin
Posible causa : Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase
mvil.
Solucin: Bomba primera y est fases seguras tan mviles es propiamente
[degassed]
Solucin a larga plazo: Asegurese fase tan mvil est propiamente y
adecuadamente desgasificada. Si usa desgasificacin electrnica en lnea
asegura esa cadencia del flujo no es demasiado alto para evita [degassing]
completo.
Variaciones de la Lnea Base
Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a
una mala desgasificacin de los solventes de la fase mvil.
Solucin: Asegurese que todas las fases mviles estn debidamente
desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la presin a toma de
corriente del detector.
Lnea Base con mucho Ruido
Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba.
Solucin: Enjuage el sistema y purge la bomba de HPLC . Use Solventes
desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo
de la fase movil del sistema.
Picos Falsos (Detectores Electroqumicos y de Fluorescencia)
Posible causa: Oxgeno Disuelto
Solucin: Desgasificar adecuadamente las fases mviles para reducir la
concentracin de oxgeno disuelto.
Solucin a largo plazo: Agregar un sistema de filtracin al vaco en lnea.
Peridicamente chequear el nivel de oxgeno disuelto.
Baja Ninguna Presin
Posible causa: Trabajar con bombas, sellos pistones expuestos por mucho
tiempo a partculas en suspencin en la fase mvil.
Solucin: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.

Recomendaciones para adquirir un sistema de HPLC

Estos son algunos consejos para adquirir un sistema de HPLC ajustado a sus
necesidades:

Cuntas muestras y tipos de ensayos

La facilidad para reemplazar los sellos de las bombas (mantenimiento)
La exactitudad y presicin del sistema de bombas
El Sistema de Gradiente. La suavidad y reproducibilidad de la mezcla
Que tipo de servicio ofrecen puede ofrece la casa vendedora
Suministro de software y compatibilidades
Cunto puede PAGAR usted !

Referencias Bibliogrficas Recomendadas

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