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Chimie analytique instrumentale Notions de spectrofluorimétrie Etienne QUIVET 04 91 10 62 43

Chimie analytique instrumentale

Notions de spectrofluorimétrie

analytique instrumentale Notions de spectrofluorimétrie Etienne QUIVET 04 91 10 62 43

Etienne QUIVET 04 91 10 62 43 etienne.quivet@univ-provence.fr

Laboratoire Chimie Provence, UMR 6264, Université de Marseille

Spectrofluorimétrie 1. Principe 2. Spectres d’excitation 3. Spectres d’émission 4. Quantification 5. Instrumentation
Spectrofluorimétrie 1. Principe 2. Spectres d’excitation 3. Spectres d’émission 4. Quantification 5. Instrumentation
Spectrofluorimétrie 1. Principe 2. Spectres d’excitation 3. Spectres d’émission 4. Quantification 5. Instrumentation

Spectrofluorimétrie

1. Principe

2. Spectres d’excitation

3. Spectres d’émission

4. Quantification

5. Instrumentation

1. Principe 2. Spectres d’excitation 3. Spectres d’émission 4. Quantification 5. Instrumentation HO O O COOH
1. Principe 2. Spectres d’excitation 3. Spectres d’émission 4. Quantification 5. Instrumentation HO O O COOH
HO O O COOH
HO
O
O
COOH

Principe

Luminescence : Émission d’un rayonnement électromagnétique

: Émission d’un rayonnement électromagnétique Classement en fonction du mode d’excitation Chimi
: Émission d’un rayonnement électromagnétique Classement en fonction du mode d’excitation Chimi

Classement en fonction du mode d’excitation

Classement en fonction du mode d’excitation Chimi luminescence Bio luminescence réaction chimique
Classement en fonction du mode d’excitation Chimi luminescence Bio luminescence réaction chimique

Chimiluminescence

Bioluminescence

réaction chimique

réaction enzymatique

chaleur

champ électrique

Photons

réaction enzymatique chaleur champ électrique Photons Thermo luminescence Electro luminescence Photo luminescence

Thermoluminescence

Electroluminescence

Photoluminescence

chaleur champ électrique Photons Thermo luminescence Electro luminescence Photo luminescence Phosphorescence Fluorescence
chaleur champ électrique Photons Thermo luminescence Electro luminescence Photo luminescence Phosphorescence Fluorescence

Phosphorescence

Fluorescence

Principe

Diagramme de Jablonski

Relaxation

E ex > E ém ⇒⇒⇒⇒λ ex < λ ém

vibrationnelle Croisement V 3 V 4 Inter-système V 2 V S 1 V 1 0
vibrationnelle
Croisement
V 3 V 4
Inter-système
V 2
V
S
1
V
1
0
Conversion
T 1
λ
E
λ ex
interne
ém
V 3 V 4
V 2
V
1
S 0
S 0
V
0
Absorption
Fluorescence
Phosphorescence

Désactivations non radiatives

Les molécules qui se trouvent au repos dans le niveau vibrationnel V 0 de l’état électronique fondamental S 0 se trouvent portée à un état excité S 1 sous l’effet de l’absorption d’un rayonnement lumineux (λ ex ).

Principe

Différents types de dissipation de l’énergie en excès peuvent alors se produire. Ce sont des phénomènes de relaxation :

Relaxation non rayonnante (non radiative)

conversion interne

relaxation vibrationnelle

Relaxation rayonnante (radiative)

Autres types de processus de fluorescence

Principe

Relaxation rayonnante : fluorescence

La fluorescence moléculaire se produit par émission d’un photon (à λ em ) dont l’énergie correspond à la transition entre l’état électronique S 1 et l’un des niveaux vibrationnels de l’état fondamental S 0 . L’excès d’énergie vibrationnel par rapport à S 0 est à nouveau perdu par un processus de relaxation vibrationnelle.

C’est un phénomène rapide : il faut entre 10 -9 et 10 -7 seconde pour qu’une molécule retourne à l’état fondamental.

La fluorescence se traduit par des bandes de rayonnement car les molécules excitées peuvent revenir à n’importe quel niveau vibrationnel de l’état électronique fondamental S 0 .

Principe

Relaxation rayonnante : fluorescence

Comme un peu d’énergie se perd durant la relaxation vibrationnelle avant que l’émission ne se produise, l’énergie émise est donc de λ plus grande que celle de l’énergie absorbée (déplacement de Stokes). Des raies de résonance sont aussi observables.

grande que celle de l’énergie absorbée ( déplacement de Stokes ). Des raies de résonance sont

Principe

Relaxation rayonnante : phosphorescence

La phosphorescence traduit un type différent de retour au niveau fondamental. Après la phase d’absorption (transfert d’électron S 0

S 1 ), si

la relaxation vibrationnelle est assez lente, on assiste au retournement de

spin de l’électron pour conduire à un état triplet T 1 un peu plus stable.

Le retour au niveau fondamental avec émission de photon est donc ralenti et les durées de relaxation peuvent être 10 8 fois plus grande que pour la fluorescence (jusqu’à 10 secondes).

et les durées de relaxation peuvent être 10 8 fois plus grande que pour la fluorescence
et les durées de relaxation peuvent être 10 8 fois plus grande que pour la fluorescence

Principe

Relaxation non rayonnante :

conversion interne

relaxation vibrationnelle

Autres types de processus de fluorescence :

fluorescence de Stokes

diffusion de Rayleigh

diffusion Raman

fluorescence de résonance

Principe

Autres types de processus de fluorescence : fluorescence de Stokes

La fluorescence de Stokes s’observe normalement en solution avec la réémission de photons ayant une longueur d’onde plus grande que ceux observés.

Cependant, si de l’énergie thermique est ajoutée lorsque la molécule est dans un état excité, une émission à plus courte longueur d’onde peut se produire, c’est ce qu’on appelle la fluorescence anti-Stokes. Elle s’observe généralement dans des gaz portés à très hautes températures.

Principe

Autres types de processus de fluorescence : diffusion de Rayleigh

La diffusion Rayleigh est la réémission, à la même longueur d’onde, d’une petite fraction de la lumière excitatrice dans toutes les directions par le solvant dans lequel se trouve le composé.

Diffusion Rayleigh (raie excitatrice) Diffusion Fluorescence Raman
Diffusion Rayleigh
(raie excitatrice)
Diffusion
Fluorescence
Raman

Son intensité dépend de la polarisabilité des molécules de ce solvant.

dépend de la polarisabilité des molécules de ce solvant. Lumière diffractée (2 è m e ordre

Lumière diffractée (2 ème ordre du réseau)

Principe

Autres types de processus de fluorescence : diffusion Raman

La diffusion Raman, de 100 à 1000 fois plus faible que la diffusion Rayleigh, provient d’une partie de l’énergie de la lumière excitatrice aux molécules de solvant sous forme d’énergie de vibration. Les molécules de solvant réémettent donc des photons de moindre énergie que ceux ayant servi à les exciter.

Autres types de processus de fluorescence : fluorescence de résonance

La fluorescence de résonance, réémission de photons à la même longueur d’onde, n’est que rarement observée en solution du fait des interactions avec le solvant, mais peut se produire dans les gaz.

Principe

Fluorophores :

Molécules biologiques : Tryptophane (groupement aromatique), GFP (Green Fluorescent Protein) protéine verte extraite des méduses mutants… Avantage : insertion dans le génome

Molécules organiques attachées : Très nombreuses… plus ou moins

spécifiques (cystéines –SH, lysine-NH2). Liaison Biotine-avidine.

Intercalants de l’ADN : BET, YOYO

Indicateurs fluorescents : molécules organiques qui deviennent fluorescentes en présence d’un cofacteur Ca 2+ , Na + , Cl - , O 2 , pH…

Nanocristaux : sondes inorganiques, spectre d’émission étroit, spectre d’absorption large, photostables, visibles en microscopie électronique.

Spectres d’excitation et d’émission

Chaque molécule fluorescente présente deux spectres caractéristiques :

un spectre d’excitation qui permet de déterminer l’efficacité relative des différentes longueurs d’onde des rayonnements incidents sur la fluorescence

d’onde des rayonnements incidents sur la fluorescence un spectre d’émission qui montre l’intensité

un spectre d’émission qui montre l’intensité relative des rayonnements émis à différentes longueurs d’onde

Spectres d’excitation

Le spectre d’excitation (obtenu avec un fluorimètre) n’est pas toujours identique au spectre d’absorption (obtenu avec un spectrophotomètre) de

la molécule

artefacts instrumentaux

Exemple : complexe alizarine - aluminium

Spectre d’excitation

Spectre d’absorption

350

nm

270

nm

430

nm

350

nm

470

nm

480

nm

Paramètres différents entre les appareils :

largeur de bande du monochromateur, intensité de la source lumineuse, largeur de fente…

Le spectre d’absorption

bonne approximation de λ ext

spectre d’absorption bonne approximation de λ e x t En général, on choisit la valeur de

En général, on choisit la valeur de la longueur d’onde la plus grande dans le spectre d’excitation pour exciter la molécule

Spectres d’émission

Chaque bande observée dans le spectre d’excitation aura une bande d’émission (ou de fluorescence) correspondante. Ces deux bandes seront approximativement des images miroirs l’une de l’autre. Cependant, plus le composé est complexe, plus la bande de fluorescence est large et moins la symétrie des spectres sera avérée.

Exemple : Iso-thiocyanate de fluorescéine

de fluorescence est large et moins la symétrie des spectres sera avérée. Exemple : Iso-thiocyanate de
de fluorescence est large et moins la symétrie des spectres sera avérée. Exemple : Iso-thiocyanate de

Spectres d’émission

Exemple : mélange anthracène - quinine

H C

3

Exemple : mélange anthracène - quinine H C 3 N O OH N Bandes d’excitation superposées
N O OH N
N
O
OH
N

Bandes

d’excitation

superposées

CH 2

H C 3 N O OH N Bandes d’excitation superposées CH 2 La quinine peut être
H C 3 N O OH N Bandes d’excitation superposées CH 2 La quinine peut être
H C 3 N O OH N Bandes d’excitation superposées CH 2 La quinine peut être

La quinine peut être mesurée à 350 nm et l’anthracène à 300 nm environ

mesurée à 350 nm et l’anthracène à 300 nm environ Réciproquement , si deux composés émettent

Réciproquement, si deux composés émettent une fluorescence à la même longueur d’onde, ils peuvent toujours être mesurés ensemble dans la solution s’ils ont des pics d’excitation différenciés.

Avantage majeur de la fluorimétrie par rapport à la spectrophotométrie

Quantification

Suivant l’endroit de la solution où la fluorescence est émise, une intensité lumineuse variable atteint le détecteur.

I 0

intensité lumineuse variable atteint le détecteur. I 0 I f1 I f2 I f3 I f4
I f1 I f2 I f3 I f4
I f1
I f2
I f3
I f4
atteint le détecteur. I 0 I f1 I f2 I f3 I f4 I f (vers

I f (vers détecteur)

Il y a simultanément absorption partielle de l’intensité de la radiation lumineuse excitatrice (bleu) et absorption partielle de la lumière de fluorescence (rose) avant d’atteindre la sortie. Ce phénomène appelé filtre interne rend difficile le calcul de l’intensité de fluorescence.

rend difficile le calcul de l’intensité de fluorescence. L’intensité de fluorescence I f est la somme

L’intensité de fluorescence I f est la somme des fluorescences individuelles (I f1 , I f2 …) des molécules présentes dans le volume délimité par les fenêtres d’entrée et de sortie.

Quantification

Pour les solutions, on définit le rendement quantique (ou rendement de fluorescence)

= I f / I a

représente le rapport entre le nombre de photons émis (I f ) sur le nombre de photons absorbés (I a ).

est indépendant de l’intensité lumineuse.

Plus la valeur de

est élevée, plus le composé est fluorescent.

Quantification

I 0

I t

Quantification

rendement quantique

ne sert pas directement

= I f / I a

I a = I 0 - I t

pas directement = I f / I a I a = I 0 - I t

I f =

.(I 0 – I t ) =

.I 0 .(1 – (I t /I 0 ))

intensité de la lumière incidente

intensité de la lumière transmise

I f =

.(I 0 – I t ) =

.I 0 .(1 – (I t /I 0 ))

log (I 0 / I t ) = A I t / I 0 = 10 -A

(I 0 / I t ) = A ⇒ ⇒ ⇒ ⇒ I t / I

I f =

.I 0 .(1 – 10 -A )

Quantification

Si la solution est diluée, l’absorbance (A = ε.l.C) est faible.

I f =

.I 0 .(1 – 10 -A )

A = ε.l.C

I f = .I 0 .(1 – 10 - A ) A = ε .l.C I

I f =

.I 0 .A = .I 0 .ε.l.C

Pour les mesures faites dans les mêmes conditions, .ε.l peut être dans un même facteur K.

. ε .l peut être dans un même facteur K . I f = K.I 0

I f = K.I 0 .C

Si l'absorbance est trop importante, il y a une perte de la linéarité liée à la forme de l'équation ci-dessus en 10 -A , et au "self-quenching", phénomène dans lequel les molécules absorbent la radiation de fluorescence émise par d'autres molécules.

Instrumentation

Différents éléments d’un spectrofluorimètre :

une source lumineuse (génération d’une large bande de radiation)

un porte échantillon (ou porte cuve)

deux unités de dispersion (monochromateurs)

un détecteur (mesure de l’intensité de la radiation)

divers composants optiques (lentilles, miroirs, filtres…)

Instrumentation

Source lumineuse :

Les lampes au xénon et au mercure ainsi que des lasers pulsés sont couramment employées

ainsi que des lasers pulsés sont couramment employées L’intensité de fluorescence semble proportionnelle à

L’intensité de fluorescence semble proportionnelle à l’intensité lumineuse excitatrice incidente (I f = K.I 0 .C). Cependant, une source trop intense peut provoquer une photodécomposition de

l’échantillon (

effet inverse de celui recherché !).

Deux unités de dispersion (monochromateurs) :

A l’inverse d’un spectrophotomètre, il y a deux monochromateurs : un pour l’excitation, un pour l’émission.

Instrumentation

Source lumineuse :

Instrumentation Source lumineuse : Lampe à vapeur de mercure (Hg) Lampe à vapeur de xénon (Xe)
Instrumentation Source lumineuse : Lampe à vapeur de mercure (Hg) Lampe à vapeur de xénon (Xe)

Lampe à vapeur de mercure (Hg)

Instrumentation Source lumineuse : Lampe à vapeur de mercure (Hg) Lampe à vapeur de xénon (Xe)

Lampe à vapeur de xénon (Xe)

Instrumentation

Détecteur :

La majorité des spectrofluorimètres place le photodétecteur perpendiculairement au faisceau d’excitation. Cet arrangement permet de diminuer les contributions de diffusion Rayleigh et Raman dans le signal détecté.

On peut également mesurer la fluorescence suivant d’autres angles (22,5° ou 37° notamment) et plus récemment des appareillages permettant de mesurer une fluorescence à angle variable ont été développés.

Instrumentation

Instrumentation
Instrumentation