Chimie analytique instrumentale

Notions de spectrofluorimétrie

Etienne QUIVET 04 91 10 62 43
etienne.quivet@univ-provence.fr
Laboratoire Chimie Provence,
UMR 6264, Université de Marseille
Spectrofluorimétrie
1. Principe
2. Spectres d’excitation
3. Spectres d’émission
4. Quantification HO O O

5. Instrumentation
COOH
 Principe

Luminescence : Émission d’un rayonnement électromagnétique

Classement en fonction du mode d’excitation

Chimiluminescence → réaction chimique

Bioluminescence → réaction enzymatique

Thermoluminescence → chaleur

Electroluminescence → champ électrique

Photoluminescence → Photons

Phosphorescence

Fluorescence
 Principe

Diagramme de Jablonski
Relaxation
∆Eex > ∆Eém ⇒ λex < λém
vibrationnelle
V4 Croisement
V3
V2 Inter-système
V1
S1 V0

Conversion T1
E λex interne
λém

V4
V3
V2
V1 S0
S0 V0
Absorption Fluorescence Phosphorescence
Désactivations
non radiatives

Les molécules qui se trouvent au repos dans le niveau vibrationnel V0 de l’état

électronique fondamental S0 se trouvent portée à un état excité S1 sous l’effet de
l’absorption d’un rayonnement lumineux (λex).
 Principe

Différents types de dissipation de l’énergie en excès peuvent

alors se produire. Ce sont des phénomènes de relaxation :

 Relaxation non rayonnante (non radiative)

conversion interne

relaxation vibrationnelle

 Relaxation rayonnante (radiative)

 Autres types de processus de fluorescence

 Principe

Relaxation rayonnante : fluorescence

La fluorescence moléculaire se produit par émission d’un photon (à λem)

dont l’énergie correspond à la transition entre l’état électronique S1 et
l’un des niveaux vibrationnels de l’état fondamental S0. L’excès
d’énergie vibrationnel par rapport à S0 est à nouveau perdu par un
processus de relaxation vibrationnelle.

C’est un phénomène rapide : il faut entre 10-9 et 10-7 seconde pour qu’une
molécule retourne à l’état fondamental.

La fluorescence se traduit par des bandes de rayonnement car les

molécules excitées peuvent revenir à n’importe quel niveau vibrationnel
de l’état électronique fondamental S0.
 Principe

Relaxation rayonnante : fluorescence

Comme un peu d’énergie se perd durant la relaxation vibrationnelle avant

que l’émission ne se produise, l’énergie émise est donc de λ plus grande
que celle de l’énergie absorbée (déplacement de Stokes).
Des raies de résonance sont aussi observables.
 Principe

Relaxation rayonnante : phosphorescence

La phosphorescence traduit un type différent de retour au niveau

fondamental. Après la phase d’absorption (transfert d’électron S0 → S1), si
la relaxation vibrationnelle est assez lente, on assiste au retournement de
spin de l’électron pour conduire à un état triplet T1 un peu plus stable.

Le retour au niveau fondamental avec émission de photon est donc ralenti

et les durées de relaxation peuvent être 108 fois plus grande que pour la
fluorescence (jusqu’à 10 secondes).
 Principe

Relaxation non rayonnante :

 conversion interne

 relaxation vibrationnelle

Autres types de processus de fluorescence :

 fluorescence de Stokes

 diffusion de Rayleigh

 diffusion Raman

 fluorescence de résonance
 Principe

Autres types de processus de fluorescence : fluorescence de Stokes

La fluorescence de Stokes s’observe normalement en solution avec

la réémission de photons ayant une longueur d’onde plus grande que
ceux observés.

Cependant, si de l’énergie thermique est ajoutée lorsque la molécule

est dans un état excité, une émission à plus courte longueur d’onde
peut se produire, c’est ce qu’on appelle la fluorescence anti-Stokes.
Elle s’observe généralement dans des gaz portés à très hautes
températures.
 Principe

Autres types de processus de fluorescence : diffusion de Rayleigh

La diffusion Rayleigh est la réémission, à la même longueur d’onde,

d’une petite fraction de la lumière excitatrice dans toutes les directions
par le solvant dans lequel se trouve le composé.

Son intensité dépend de la polarisabilité des molécules de ce solvant.

Diffusion Rayleigh
(raie excitatrice)

Diffusion Fluorescence Lumière diffractée

Raman (2ème ordre du réseau)
 Principe

Autres types de processus de fluorescence : diffusion Raman

La diffusion Raman, de 100 à 1000 fois plus faible que la diffusion

Rayleigh, provient d’une partie de l’énergie de la lumière excitatrice
aux molécules de solvant sous forme d’énergie de vibration. Les
molécules de solvant réémettent donc des photons de moindre
énergie que ceux ayant servi à les exciter.

Autres types de processus de fluorescence : fluorescence de résonance

La fluorescence de résonance, réémission de photons à la même

longueur d’onde, n’est que rarement observée en solution du fait des
interactions avec le solvant, mais peut se produire dans les gaz.
 Principe

Fluorophores :

 Molécules biologiques : Tryptophane (groupement aromatique), GFP

(Green Fluorescent Protein) protéine verte extraite des méduses mutants…
Avantage : insertion dans le génome

 Molécules organiques attachées : Très nombreuses… plus ou moins

spécifiques (cystéines –SH, lysine-NH2). Liaison Biotine-avidine.

 Intercalants de l’ADN : BET, YOYO

 Indicateurs fluorescents : molécules organiques qui deviennent

fluorescentes en présence d’un cofacteur Ca2+, Na+, Cl-, O2, pH…

 Nanocristaux : sondes inorganiques, spectre d’émission étroit, spectre

d’absorption large, photostables, visibles en microscopie électronique.
 Spectres d’excitation et d’émission

Chaque molécule fluorescente présente deux spectres caractéristiques :

 un spectre d’excitation qui permet de déterminer l’efficacité

relative des différentes longueurs d’onde
des rayonnements incidents sur la fluorescence

 un spectre d’émission qui

montre l’intensité
relative des rayonnements
émis à
différentes longueurs d’onde
 Spectres d’excitation

Le spectre d’excitation (obtenu avec un fluorimètre) n’est pas toujours

identique au spectre d’absorption (obtenu avec un spectrophotomètre) de
la molécule → artefacts instrumentaux

Exemple : complexe alizarine - aluminium

Paramètres différents
Spectre d’excitation Spectre d’absorption entre les appareils :
350 nm 270 nm largeur de bande du
430 nm 350 nm monochromateur, intensité
470 nm 480 nm de la source lumineuse,
largeur de fente…

Le spectre d’absorption → bonne approximation de λext

En général, on choisit la valeur de la longueur d’onde la plus

grande dans le spectre d’excitation pour exciter la molécule
 Spectres d’émission

Chaque bande observée dans le spectre d’excitation aura une

bande d’émission (ou de fluorescence) correspondante. Ces
deux bandes seront approximativement des images miroirs l’une
de l’autre. Cependant, plus le composé est complexe, plus la
bande de fluorescence est large et moins la symétrie des spectres
sera avérée.

Exemple : Iso-thiocyanate de fluorescéine

 Spectres d’émission

Exemple : mélange anthracène - quinine

Bandes
CH2
N d’excitation
superposées
O
H3C OH

La quinine peut être mesurée

à 350 nm et l’anthracène à
300 nm environ

Réciproquement, si deux composés émettent une

fluorescence à la même longueur d’onde, ils peuvent
toujours être mesurés ensemble dans la solution s’ils ont des
pics d’excitation différenciés.

☺ Avantage majeur de la fluorimétrie par rapport à la

spectrophotométrie
 Quantification

Suivant l’endroit de la solution où la fluorescence est émise, une

intensité lumineuse variable atteint le détecteur.

Il y a simultanément absorption
I0 partielle de l’intensité de la radiation
lumineuse excitatrice (bleu) et
absorption partielle de la lumière de
fluorescence (rose) avant d’atteindre
la sortie. Ce phénomène appelé filtre
If1 If2 If3 If4 interne rend difficile le calcul de
l’intensité de fluorescence.
If
(vers détecteur)

L’intensité de fluorescence If est la somme des fluorescences

individuelles (If1, If2…) des molécules présentes dans le volume délimité
par les fenêtres d’entrée et de sortie.
 Quantification

Pour les solutions, on définit le rendement quantique

(ou rendement de fluorescence) Φ

Φ = If / Ia

Φ représente le rapport entre le nombre de photons émis (If)

sur le nombre de photons absorbés (Ia).

Φ est indépendant de l’intensité lumineuse.

Plus la valeur de Φ est élevée, plus le composé est fluorescent.

 Quantification

Quantification → rendement quantique Φ ne sert pas directement

Φ = If / Ia
If = Φ.(I0 – It) = Φ.I0.(1 – (It /I0))
Ia = I0 - It
I0 → intensité de la lumière incidente
It → intensité de la lumière transmise

If = Φ.(I0 – It) = Φ.I0.(1 – (It /I0))

If = Φ.I0.(1 – 10-A)
log (I0 / It) = A ⇒ It / I0 = 10-A
 Quantification

Si la solution est diluée, l’absorbance (A = ε.l.C) est faible.

If = Φ.I0.(1 – 10-A)
If = Φ.I0.A = Φ.I0.ε.l.C
A = ε.l.C

Pour les mesures faites dans les mêmes conditions, Φ.ε.l peut être
dans un même facteur K.

If = K.I0.C

Si l'absorbance est trop importante, il y a une perte de la linéarité liée

à la forme de l'équation ci-dessus en 10-A, et au "self-quenching",
phénomène dans lequel les molécules absorbent la radiation de
fluorescence émise par d'autres molécules.
 Instrumentation

Différents éléments d’un spectrofluorimètre :

 une source lumineuse (génération d’une large bande de radiation)

 un porte échantillon (ou porte cuve)

 deux unités de dispersion (monochromateurs)

 un détecteur (mesure de l’intensité de la radiation)

 divers composants optiques (lentilles, miroirs, filtres…)

 Instrumentation

Source lumineuse :

Les lampes au xénon et au mercure ainsi que des lasers pulsés

sont couramment employées

L’intensité de fluorescence semble proportionnelle à l’intensité

lumineuse excitatrice incidente (If = K.I0.C). Cependant, une
source trop intense peut provoquer une photodécomposition de
l’échantillon (→ effet inverse de celui recherché !).

Deux unités de dispersion (monochromateurs) :

A l’inverse d’un spectrophotomètre, il y a deux

monochromateurs : un pour l’excitation, un pour l’émission.
 Instrumentation

Source lumineuse :

Lampe à vapeur de mercure (Hg) Lampe à vapeur de xénon (Xe)

 Instrumentation

Détecteur :

La majorité des spectrofluorimètres place le photodétecteur

perpendiculairement au faisceau d’excitation. Cet arrangement
permet de diminuer les contributions de diffusion Rayleigh et
Raman dans le signal détecté.

On peut également mesurer la fluorescence suivant d’autres angles

(22,5° ou 37° notamment) et plus récemment des appareillages
permettant de mesurer une fluorescence à angle variable ont été
développés.
Instrumentation