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Revisin del artculo: Molecular cloning and functional characterization
of a mouse gene upregulated by lipopolysaccharide treatment reveals
alternative splicing
Natalia Libreros Marn a, Carolina Ramos Cobob
Autores: Kejun Du c,Yaoming Chen c,Zongming Dai c,Yuan Bi c,Tongjian Cai c,Lichao Hou
d
, Yubo Chai e,Qinghe Song e,Sumin Chen e,Wenjing Luo c,Jingyuan Chen c.
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a

Estudiante de 7mo Semestre de Biologa, Universidad Icesi, Cali, Colombia

Estudiante de 7mo Semestre de Qumica, Universidad Icesi, Cali, Colombia
c Department of Occupational and Environmental Health, Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanzi Province,PR China
d Department of Anesthesiology, Xijing Hospital , Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanzi Province,PR China
e Department of Biochemisty and Molecular Biology, Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanzi Province,PR China
b

Resumen
En el artculo estudiado se llev a cabo el tratamiento de clulas de ratn con
lipopolisacrido (LPS), estos ltimos inician una respuesta inflamatoria de la cual se
desconocen los mecanismos asociados. Es por esta razn que se decidi buscar caracterizar
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secuencias de cDNA de un ratn con gen de respuesta a LPS y tambin evaluar los efectos
de MLrg. Los cDNA de longitud completa se obtuvieron por tratamiento con LPS en
clulas NIH3T3. Fue posible observar, que el gen MLrg produce dos productos de
empalmes alternativos encontrados en GenBank como DQ316984 y DQ320011, quienes
codifican para los polipptidos MLrgS y MLrgW, respectivamente. Por otro lado, se
encontr que ambas protenas contienen dedos de zinc y cremalleras de leucina los cuales
son dominios que juegan un papel importante en la regulacin de la transcripcin. La
expresin regulada de MLrgW y MLrgS siguiendo el tratamiento con LPS, permiti
observar que las protenas se localizaban preferiblemente en la membrana nuclear y el
citoplasma. En una transfeccin estable de NIH3T3, una sobreexpresin de MLrgW
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provoc que la proporcin de clulas en G1 fuera significativamente menor, mientras que
en las clulas con sobreexpresin de MLrgS se pudo observar un aumento significativo del
nmero de clulas presentes en la fase G2, por lo tanto, se concluy que ambas protenas
son potenciales reguladoras de la progresin del ciclo celular. La regulacin de MLrgW y
MLrgS podra ser un componente importante de la va inflamatoria de LPS y de la
respuesta del husped a la infeccin con GNB.

Introduccin
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Las animales estn constantemente expuestos a una gran variedad patgenos, entre los
cuales se encuentran las bacterias Gram-negativas (GNB). La membrana plasmtica de
estas bacterias est recubierta por lipopolisacridos (LPS) los cuales son glicolpidos o
endotoxinas- que en mamferos activan las respuestas del sistema inmunitario innato. Una
de las primeras respuestas es la sntesis de citoquinas pro-inflamatorias, cuya
sobreexpresin conlleva al choque sptico in vivo. A pesar del gran impacto de los LPS
sobre la salud humana, la va por medio de la cual estas molculas inducen la respuesta
inflamatoria no ha sido completamente dilucidada, pero si se sabe que los efectos de los
LPS son modulados por la expresin diferencial del genoma del husped (Du et al, 2009).
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Los grandes avances en el anlisis de genomas eucariotas se deben a las molculas de DNA
recombinante, que son molculas que contienen secuencias de DNA derivadas de ms de
una fuente. Una de las aplicaciones ms importantes de la tecnologa de DNA recombinante
es el aislamiento de segmentos particulares de DNA que codifican para protenas (Karp,
2011). Para la construccin de estos fragmentos hbridos son necesarios dos componentes
esenciales: enzimas de restriccin, que son enzimas cortadoras de DNA; y vectores, que son
partes de DNA que pueden aceptar, transportar y replicar otras partes de DNA. Los
plsmidos bacterianos son los vectores ms ampliamente utilizados para la clonacin de
DNA y expresin de protenas (Thieman & Palladino , 2010).
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Al estudiar la expresin gnica y su regulacin como ocurre en el presente artculo- se
utilizan gran variedad de tcnicas moleculares que analizan el mRNA producido por un
tejido en particular, esto se debe a que la cantidad de mRNA producido suele ser
equivalente a la cantidad de protenas. La PCR de transcripcin inversa (RT-PCR) permite
detectar cantidades minsculas de mRNA. En sta tcnica la enzima transcriptasa inversa
convierte el mRNA aislado en cDNA, y con la DNA polimerasa se obtiene el cDNA de
doble cadena que posteriormente puede hibridarse con plsmidos bacterianos u otros
vectores segn el tipo de estudio que se desee realizar- (Thieman & Palladino , 2010).
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Una de las tcnicas ms importantes para la separacin con base a la relacin carga-masa de
los productos de la PCR es la electroforesis, esta tcnica aprovecha el hecho de que la
mayora de los polmero biolgicos poseen carga elctrica y, por lo tanto, son capaces de
migrar bajo la influencia de un campo elctrico. Una forma usual de caracterizar una
macromolcula es la determinacin de la velocidad con que se mueve al someterla a un
campo elctrico. Esta propiedad puede ser utilizada para calcular el peso molecular de una
protena, para distiguir molculas por su carga neta o forma, para detectar cambios de
aminocidos, de restos polares o no polares y viceversa, y para separar cuantitativamente
distintas especies moleculares. En la electroforesis la fuerza aplicada est contrarrestada por
la resultante del rozamiento de la partcula en el medio. Si una particula con carga q
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suspendida en un medio aislante se encuentra en un campo elctrico, E, la partcula se
mover a una velocidad constante, v, determinada por el balance entre la fuerza elctrica,
Eq, y la resultante del rozamiento con el medio, fv, donde f es el coeficiente de friccin. La
electroforesis es enormemente til analtica y preparativa debido a su capacidad para
separar molculas distintas. Aunque la teora es correcta para aportar las principales
indicaciones que deben seguirse para la utilizacin de esta tcnica esto es, que la
movilidad se incrementa con la cargar, decrece frente al coeficiente de friccin y es cero
para molculas de carga nula, - de hecho, las condiciones ptimas de separacin se
determinan casi siempre empricamente para cada caso.
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Existen tres tipos de electroforesis: de frente mvil, zonal y continua. En la primera, las
macromolculas estn presentes en toda la disolucin y su posicin se determina en funcin
del tiempo por ptica de schlieren. Por otra parte, la usada en el laboratorio y en el
desarrollo del artculo fue una electroforesis zonal, en esta la disolucin a tratar se coloca
una mancha o fina capa de muestra en contacto con un medio semislido o gelatinoso, se
aplica un campo elctrico y las partculas migran a travs del soporte. Como las molculas
se aplican en una zona, se utilizan pequeas cantidades de muestra, pudiendo conseguirse
entonces una completa separacin de todos los componentes. Esta tcnica es utilizada para
analizar mezclas, determinacin de pureza de muestra, detectar cambios en la movilidad o
de conformacin y para la purificacin de sustancias. Finalmente, en la electroforesis
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continua, la muestra se aplica tambin en una zona, pero se aade continuamente a lo largo
del proceso (Freifelder, 2003).
En eucariotas, el mRNA inicial copiado de un gen es inmnaduro y no es totalmente
funcional. Estos transcritos primarios sufren modificaciones, que consisten principalmente
en el corte de intrones regiones no codificantes-.Este proceso de empalme no siempre se
produce de la misma manera muchos exones se pueden tratar como intrones- por lo que se
pueden producir mltiples protenas a partir de un nico gen (Thieman & Palladino , 2010).
En este estudio se encontr que el gen MLrg (mouse LPS-responsive gene) cuya
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expresin es inducida por los LPS- genera dos protenas por empalme alternativo: MLrgW
y MLrgS.
Mediante la tcnica Western blotting, es posible identificar protenas especficas de una
mezcla compleja de protenas extradas de clulas. Para ello las protenas que se encuentran
en la mezcla son separadas segn su peso molecular por medio de electroforesis en gel. Las
bandas resultantes se transfieren a una membrana adsorbente que suele ser de
nitrocelulosa-, y esta membrana es incubada con anticuerpos especficos para la protena de
inters (Mahmood & Yang, 2012).
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Materiales y mtodos
Tabla 1. Materiales usados para la clonacin molecular y caracterizacin funcional de los
genes de ratn regulados por un tratamiento con LPS y de los materiales en la prctica de
laboratorio de clonacin y amplificacin de genes
Materiales artculo

Materiales prctica de Laboratorio

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LPS (E.coli),
Hepes
DEPC
Plsmidos pUC19, pcDNA3.1(+), pTAT
Triazol
Purificadores reactivos de DNA
Kit de RT
Kit de extraccin de plsmidos (libre de endotoxinas)
Enzimas de restriccin,
DNA polimerasa Taq,
Ligasa T4
Sistema de deteccin de quimioluminiscencia mejorada
Lneas celulares de NIH3T3 y L929, cepa celular

Muestra de ADN (regin codificante GFP)

Buffer PCR
MgCl2
d-NTPs 20 mM
Primer GFP for, GFP rev, T7, SP6
DNA polimera Taq
Agua Bidestilada estril
Kit de clonacin pGEMT-Easy
Clulas componentes
Colonia recombinantes crecidas en medio LB-agar

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La metodologa utilizada en el desarrollo del artculo inicia con el cultivo celular, donde
clulas NIH3T3 de ratn son cultivadas en DMEM y expuestas a 100 g/L de LPS por 24h.
A continuacin, se llev a cabo la amplificacin de MLrg cDNA por RT-PCR, esta gracias
una investigacin exhaustiva haciendo uso de diversos bancos de datos que permiti
determinar los primers para la amplificacin de las secuencias de cDNA, se utilizaron
cuatro primers un par para la amplificacin de la secuencia completa y los restantes para la
codificante, estos dos ltimos posean sitios de restriccin para KpnI y Xhol,
respectivamente. Los productos de la PCR fueron separados por electroforesis en gel de
agarosa 1% y teidos por EB. Se purificaron los productos de la PCR y haciendo uso de los
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sitios de restriccin en el vector pTAT se llev a cabo exitosamente el proceso de
transformacin en las clulas BL21 de E.Coli. Gracias a la secuenciacin se pudo
identificar las formas MLrgW y MLrgS. Despus de este descubrimiento se hizo un estudio
para conocer la expresin de MLrgW/MLrgS inducida por IPTG y una preparacin de un
serum inmune. Se procedi con la localizacin de MLrgW y MLrgS en la clula por medio
de estudios de antgeno- anticuerpo de inmunohistoqumica. Luego, se busc como LPS
inducia cambios en MLrgW y MLrgS por medio de western blotting y inmunohistoqumica,
en este caso los fibroblastos de las clulas de ratn y las clulas de fibrosarcomo L929
fueron expuestas a LPS por 24h. Se utilizaron anticuerpos policlonales de conejo para
detectar polipptidos MLrgW yMLrS; el estudio de blot fue desarrollado usando HRG
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conjugado, IgG y un sistema de deteccin de quimioluminiscencia. Mientras que por
inmunohistoqumica, la unin de los anticuerpos fue detectada usando IgG con SABC,
desarrollado con FITC y finalmente se observ la imagen por un microscopio con escner
lser. Teniendo esto, se procedi a observar como las lneas celulares estabilizaban la
expresin de los polipptidos, en transfectantes y por medio de Western blotting.
Finalmente, se estudi la distribucin del ciclo celular evaluada por citometra de flujo,
donde las clulas incubadas se les analiz la distribucin de las diferentes fases del ciclo
usando un analizador Becton-Dickinson FACSort.

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En el laboratorio de amplificacin de DNA animal y vegetal, haciendo uso del mismo
principio de PCR que en el artculo pero no se llev a cabo ninguna tcnica de
secuenciacin ni de caracterizacin.
Resultados
En este estudio se caracteriz molecularmente un nuevo gen de respuesta a los LPS -MLrg
(mouse LPS-responsive gene) el cual codifica para dos protenas (MLrgW y MLrgS).
Con la amplificacin por RT-PCR se encontr que la longitud total del fragmento de cDNA
para MLrg es de 1905pb, y para los transcritos generados por empalme alternativo las
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longitudes son 1554 pb (MLrgW) y 1407 pb (MLrgS). Las protenas resultantes presentan
517 y 468 aminocidos -respectivamente- y ambas poseen dominios de cremalleras de
leucina (bZIP) bien conservados (Figura 1A).
En las figuras 1B y 1C puede observarse los resultados de los anlisis histoqumicos: en las
clulas L929 transfectadas (con 6His-TAT- MLrgW y 6His-TAT- MLrgS), la protenas se
localizan principalmente en la membrana nuclear y en el citoplasma. Consideramos que las
figuras 1B y 1C no exhiben claramente la presencia de las protenas en el citoplasma
celular, pero si es claro una predominancia a presentarse en la membrana nuclear.
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La cuantificacin de los niveles de MLrgW y MLrgS por medio de la tcnica Western
blotting- demuestra que los LPS inducen la expresin del gen MLrg. En la figura 1D se
puede observar que en las clulas control (no tratadas con LPS), las cuales corresponden a
los carriles 3 y 5, no hay expresin de MLrg. Por el contrario, las clulas tratadas con LPS
las cuales corresponden a los carriles 2 y 4- hay una alta expresin de MLrg. Los
resultados del Western blotting fueron corroborados con anlisis inmunohistoqumicos
para ambas protenas- en clulas NIH3T3 expuestas a LPS. Los resultados obtenidos para el
Western blotting son corroborados por inmunohistoqumica, en las figuras 1E y 1F se
puede observar que hay altos niveles de MLrgW y MLrgS respectivamente- luego de
tratar las clulas con LPS.
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Para analizar los posibles efectos de la expresin de MLrg sobre el ciclo celular, se
insertaron las secuencias codificantes para MLrgW y MLrgS en el vector pcDNA3.1 (+), y
es plsmido hbrido se transfect a clulas NIH3T3. Se utiliz el Western blotting para
analizar la expresin proteica. En la figura 2A se puede observar que la protena MLrgW
fue detectada nicamente en los carriles 3 y 4, que corresponden a las clulas transfectadas
con MLrgW- pcDNA3.1 (+).En la figura 2C se puede observar que la protena MLrgS fue
detectada nicamente en los carriles 1 y 2, que corresponden a las clulas transfectadas con
MLrgS- pcDNA3.1 (+).
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Se observ que la sobreexpresin de MLrgW y MLrgS en los transfectantes NIH3T3 altera
el ciclo celular. En la figura 2B, se puede observar que de las clulas control, 64.1% se
encotraban en G1, por el contrario, de las clulas NIH3T3 transfectadas slo el 47% se
encontraba en G1. De igual manera, en la figura 2D se puede observar que de las clulas
control, slo un 8.9% se encotraban en G2, mientras que de las clulas NIH3T3
transfectadas el 18.8% se encontraba en G2.

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Discusin
Se sabe que los seres humanos estamos expuestos constantemente a una variedad de
patgenos entre los que se incluye las bacterias gram negativas (GNB), estas poseen unas
endotoxinas las cuales son consideradas las mayor causa de muerte en los hospitales, sin
embargo, estas tambin pueden movilizar a la defensa del hospedador en contra de la
invasin de GNB, este mecanismo depende la respuesta inmune innata del husped para
reconocer LPS. La estimulacin de clulas de mamferos por LPS ocurre por medio de una
serie de interacciones con diversas protenas como LBP, CD14, MD-2 y TLR4 y la
compleja de va de sealizacin activada por LPS, esta ruta es de gran inters
farmacolgico ya que si se logra una correcta intervencin en ella podra conducir a
disminuir la inflamacin inducida por las endotoxinas. Sin embargo, la respuesta a una
estimulacin con LPS es diferente en cada organismo y el desarrollo de una enfermedad
inflamatoria depende de la interaccin gen-gen o gen-ambiente, lo que confirma que esta
vara de individuo en individuo.
Por medio del estudio presentado en el artculo se logr la clonacin y caracterizacin de
un gen de ratn, MLrg, cuya expresin es inducida por LPS. Se encontraron dos isoformas
MLrgW y MLrgS generadas por el empalme alternativo, este proceso es un mecanismo
prevalente e importante en la regulacin de genes en Eucariotas porque permite un aumento
en la cantidad de protenas que pueden ser obtenidas a partir de un solo gen, casi tres
cuartos de los genes multi-exones en humanos estn sujetos a este proceso. El impacto de
este empalme alternativo es fundamental para regulacin de la expresin gentica y
complejidad del proteoma.
Por otra parte, las cremalleras de leucina estn relativamente bien conservadas en las
protenas MLrgW y MLrgS. Los factores de bZIP constituyen uno de los tipos ms
importantes de potenciadores de la transcripcin. En vertebrados, estos estn involucrados
en mltiples procesos de desarrollo celular como el cncer, la memoria y el aprendizaje.
La secuencia de aminocidos de MLrgW y MLrgS contiene un dominio de dedo de zinc del
tipo C2H2, uno de los ms comunes motivos de unin a DNA en eucariotes. En este
dominio se da la interaccin o unin con diferentes protenas, DNA o RNA y los motivos
estn presentes en los proteomas de muchos organismos. El reconocimiento al DNA por el
tipo C2H2 de dedos de zinc es bastante sencillo por lo que ha sido explotado en el diseo
de protenas y estudios recientes sugieren que este tipo de dominio pueden funcionar como
una clave para los represores de la transcripcin involucrados en la defensa y climatizacin
de diferentes condiciones de estrs ambiental.
La inmunohistoqumica revel que MLrgW y MLrgS estn localizados preferiblemente en
la membrana nuclear y el citoplasma. As mismo se comprob que un aumento en la
expresin de los pptidos afecta la progresin del ciclo celular en transfectantes estables de
NIH3T3. El porcentaje de clulas en la fase G1 disminuy significativamente por una
sobreexpresin de MLrgW, mientras que el nmero de clulas en G2 aumento por la
sobreexpresin de MLrgS. Estos descubrimientos indican que los dos pptidos podran
estar involucrados con la regulacin del ciclo celular. Las dos protenas son fuertemente
controladas por el tratamiento con LPS y sus dominios de dedos de zinc y bZIP son
reguladores potenciales de la transcripcin. Por lo tanto, es posible que MLrgW y MLrgS

estn involucrados con la regulacin transcripcional siguiendo una activacin de la ruta de

sealizacin de LPS.
En resumen, se reportaron en el artculo las protenas MLrgW y MLrgS, generadas por el
empalme alternativo de transcritos del gen MLrg sensible a LPS en clulas de ratn.
Estudios en transfectantes con sobreexpresin de las protenas revelaron que stas se
localizaban en la membrana nuclear y el citoplasma, y su expresin puede modular la
progresin del ciclo celular. Las molculas contenan dedos de zinc y dominios bZIP
conservados, que podran ser reguladores de la transcripcin y contribuir a la regulacin
celular por una estimulacin por parte de LPS. Futuras investigaciones sern necesarias
para determinar si la intervencin farmacolgica en la ruta MLrg tiene potencial teraputico
en el shock inducido por la exposicin a toxinas presentes en GNB.

ANEXOS

BIBLIOGRAFA
Du, K. (2009). Molecular cloning and functional characterization of a mouse
gene upregulated by lipopolysaccharide treatment reveals alternative
splicing . El Sevier, 267-271.
Freifelder, D. (2003). Tcnicas de bioqumica y biologa molecular. (F. Carretero,
& C. Pedrs-All, Trads.) Barcelona: Revert S.A.
Karp, G. (2011). Biologa celular y molecular. Conceptos y experimentos (Sexta
ed.). Mxico, D.F: McGraw-Hill Interamericana Editores S.A.
Mahmood, T., & Yang, P.-C. (4 de Septiembre de 2012). Western Blot:
Technique, Theory, and Trouble Shooting. Recuperado el 28 de Febrero
de 2015, de National Center for Biotechnology Information :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3456489/
Thieman, W. J., & Palladino , M. A. (2010). Introduccin a la biotecnologa.
Madrid: Pearson Educacin, S.A.